Preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione del dendrimero a base di agenti di contrasto per risonanza magnetica

Riepilogo

Questo protocollo descrive la preparazione e caratterizzazione di un agente di contrasto dendrimerica risonanza magnetica (MRI) che porta chelati macrociclici cyclen basati coordinamento ioni paramagnetici gadolinio. In una serie di esperimenti in vitro MRI, questo agente prodotto un segnale RM amplificato rispetto all'analogo monomerica disponibile in commercio.

Abstract

complessi paramagnetici di gadolinio (III) con aciclico o chelati macrociclici sono gli agenti di contrasto più comunemente usati (CAS) per la risonanza magnetica (MRI). Il loro scopo è quello di migliorare la velocità di rilassamento dei protoni dell'acqua nel tessuto, aumentando così il contrasto dell'immagine MR e la specificità delle misurazioni MRI. mezzi di contrasto clinicamente approvati attuali sono molecole a basso peso molecolare che sono rapidamente eliminato dal corpo. L'utilizzo di dendrimeri come portatori di chelanti paramagnetiche possono giocare un ruolo importante nel futuro sviluppo di agenti di contrasto per MRI più efficienti. In particolare, l'aumento della concentrazione locale dei paramagnetici risultati specie in contrasto segnale più alto. Inoltre, questa CA fornisce un tempo di ritenzione del tessuto più grazie al suo elevato peso e dimensione molecolare. Qui, dimostriamo un procedimento conveniente per la preparazione di agenti di contrasto MRI macromolecolari a base di poli (amidoamine) (PAMAM) dendrimeri con monomacrociclici DOTA tipo chelanti (DOTA - 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetato). L'unità chelante è stato aggiunto sfruttando la reattività del gruppo isotiocianato (NCS) verso i gruppi superficiali ammina del dendrimero PAMAM per formare ponti tiourea. prodotti dendrimerici sono stati purificati e analizzati mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, spettrometria di massa e analisi elementare. Infine, ad alta risoluzione immagini RM sono state registrate e contrasti segnale ottenuto dal dendrimero preparato e agenti monomeriche disponibili in commercio sono stati confrontati.

Introduzione

La risonanza magnetica (MRI) è una tecnica di imaging potente e non ionizzanti ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e diagnostica clinica per la sua natura non invasiva e un eccellente contrasto dei tessuti molli intrinseca. I metodi MRI più comunemente utilizzati utilizzano il segnale ottenuto da protoni dell'acqua, fornendo immagini ad alta risoluzione e informazioni dettagliate all'interno dei tessuti a base di differenze di densità dei segnali acqua. L'intensità del segnale e la specificità degli esperimenti di risonanza magnetica possono essere ulteriormente migliorate utilizzando mezzi di contrasto (CA). Questi sono specie paramagnetiche o superparamagnetiche che influenzano il longitudinale (T ₁₎ e trasversale (T ₂₎ tempi di rilassamento, rispettivamente ^1,2.

Complessi di lantanidi gadolinio ionico con poliamminici ligandi acidi policarbossilici sono i più comunemente usati T ₁ CA. Gadolinio (III) accorcia il rilassamento T ₁tempo di protoni dell'acqua, aumentando così il contrasto del segnale in esperimenti MRI ^3. Tuttavia, gadolinio ionica è tossico; le sue dimensioni approssima quella del calcio (II), e colpisce seriamente calcio assistita segnalazione nelle cellule. Pertanto, aciclici e macrociclici chelati sono impiegati per neutralizzare questa tossicità. Vari leganti multidentati sono stati sviluppati finora, con conseguente gadolinio complessi (III) con elevata stabilità termodinamica e cinetica inerzia ^1. Quelli basati sul Cyclen azamacrocycle 12-membered, in particolare la sua tetracarbossilico DOTA derivata (1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetato) sono complessi più studiati e applicati di questa classe CA.

Tuttavia, GdDOTA tipo CA sono sistemi a basso peso molecolare, che mostrano alcuni svantaggi come l'efficienza e basso contrasto escrezione renale veloce. Macromolecolare e polivalente CA possono essere una buona soluzione a questi problemi ^4. Dal momento che CA biodistribuzione è determinata principalmente dalla loro dimensione, CA macromolecolari mostrano tempi di ritenzione molto più lunghi all'interno dei tessuti. Ugualmente importante, il multivalenza di questi agenti si traduce in un aumento della concentrazione locale della sonda monomerica MR (ad esempio, complessi GdDOTA), migliorando sostanzialmente il segnale MR acquisite e la qualità della misura.

I dendrimeri sono tra i ponteggi preferite per la preparazione di polivalente CA per MRI ^4,5. Queste macromolecole altamente ramificate con determinate dimensioni sono inclini a varie reazioni di accoppiamento sulla loro superficie. In questo lavoro, si segnala la preparazione, purificazione e caratterizzazione di una CA dendrimerica per la risonanza magnetica costituito da un 4 (G4) poli generazione (amidoamine) (PAMAM) dendrimero accoppiato ad chelati GdDOTA-like (DCA). Descriviamo la sintesi del reattiva derivata DOTA e il suo accoppiamento con il dendrimero PAMAM. Su complessazione con Gd (III), la caratterizzazione chimico-fisica di serie Operazire di DCA è stata eseguita. Infine, gli esperimenti di risonanza magnetica sono stati eseguiti per dimostrare la capacità di DCA di produrre immagini RM con un contrasto più forte di quelli ottenuti da basso peso molecolare CA.

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Protocollo

1. Preparazione di DCA

1. Sintesi della unità monomerica 4 ^6.
   1. Sintesi di 4- (4-nitrofenil) -2- (tert 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazaciclododec-1-il) butirrico terz butil estere (2).
      1. Sciogliere (4,7-bis- tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-il) acetico tert-butil estere dell'acido 1 (1,00 g, 1,94 mmoli) in N, N -dimethylformamide ( DMF, 5 ml), aggiungere carbonato di potassio (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 equiv.) e mescolare la miscela a temperatura ambiente per 45 min.
         NOTA: macrociclo 1 è stato preparato da Cyclen e tert-butil bromoacetato secondo la procedura precedentemente pubblicata ^7.
      2. Aggiungere tert-butil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 equiv.) A porzioni nell'arco di 1 ora. Continuare a mescolare il composto in tegli stesse condizioni di reazione per le seguenti 18 ore.
         Nota: butil-2-bromo-4- Tert (4-nitrofenil) butanoato è stato preparato da 4- (4-nitrofenil) Acido -butyric, cloruro di tionile, e bromo secondo la procedura precedentemente pubblicata ^8.
      3. Rimuovere DMF mediante bulbo a bulbo distillazione sotto vuoto a 40-60 ° C ^9.
      4. Purificare il residuo mediante cromatografia su colonna (gel di silice, 7% metanolo / diclorometano) per ottenere il prodotto 2 come un solido amorfo marrone (1,09 g, 72%) ^10.
   2. Sintesi di 4- (4-amminofenil) -2- (tert 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazaciclododec-1-il) butirrico terz butil estere (3).
      1. Sciogliere il nitrobenzene derivato 2 (1.00 g, 1.28 mmol) in etanolo (10 ml) e 7 N soluzione di ammoniaca in metanolo (150 ml). Aggiungere palladio su carbone attivo come catalizzatore (Pd / C, 150 mg, 15% in peso) al solutisopra.
      2. Agitare la miscela eterogenea per 16 ore sotto atmosfera di idrogeno (2,5 bar) nell'apparato idrogenatore Parr.
      3. Preparare una torta di farina fossile sospendendo in etanolo e filtrando la sospensione attraverso un imbuto di vetro sinterizzato. Versare la sospensione dal 1.1.2.2 sopra la torta preparata per rimuovere il catalizzatore Pd / C per filtrazione.
      4. Eliminare il solvente per distillazione delicata su un evaporatore rotante (temperatura del bagno d'acqua ~ 40 ° C) per ottenere composto 3 come solido amorfo marrone (0,91 g, 95%).
   3. Sintesi di 4- (4-isothiocyanatophenyl) -2- (4,7,10-tris- tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- tetraazaciclododec-1-il) butirrico tert-butil estere dell'acido (4).
      1. Aggiungere tiofosgene (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 equiv.) Ad una miscela di 3 (0,91 g, 1,22 mmoli) e trietilammina (0,685 ml, 4,87 mmoli, 4 equiv.) In diclorometano (15 ml).
      2. Vigorosamente smuovere le mi reazionexture con un agitatore magnetico a temperatura ambiente per 16 ore.
      3. Eliminare il solvente per distillazione delicata su un evaporatore rotante (temperatura del bagno d'acqua ~ 40 ° C), e poi purificare il prodotto grezzo mediante cromatografia su colonna (gel di silice, 5% metanolo / diclorometano) per ottenere il prodotto 4 come marrone chiaro solido amorfo (0,51 g, 53%).
2. Sintesi del DCA dendrimero.
   1. Sintesi del dendrimero 5.
      1. Prendere G4-PAMAM dendrimero (667 mg, 10% soluzione di dendrimero in metanolo, 4,67 mmol), si evapora il metanolo per distillazione delicata su un evaporatore rotante (temperatura del bagno d'acqua ~ 40 ° C), e sciogliere il residuo in DMF (4 ml) .
      2. Aggiungere trietilammina (0,105 ml, 0,75 mmoli, 160 equiv.), Agitare per 45 min a 60 ° C e aggiungere isotiocianato 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 equiv. Rispetto ai gruppi superficiali ammino del dendrimero) a porzioni over 1 hr.
      3. Mescolare la miscela di reazione con un agitatore magnetico a 45 ° C per 48 ore.
      4. Rimuovere il solvente mediante bulbo a bulbo distillazione sotto vuoto a 40-60 ° C.
      5. Purificare il residuo cromatografia di esclusione molecolare utilizzando un mezzo di filtrazione di gel lipofilo e metanolo come eluente. Per comprimere la colonna, gonfiare i mezzi di filtrazione in metanolo per almeno 3 ore a temperatura ambiente (> 4 ml di metanolo per 1 g di polvere) senza applicare pressione. Eseguire separazione per gravità attraverso la raccolta di 1 ml frazioni.
      6. Analizzare le frazioni raccolte con cromatografia su strato sottile (TLC). Sviluppare la piastra TLC in 15% metanolo / diclorometano (solo il punto più polare posto sulla linea di base è derivato dal prodotto dendrimerica). Evaporare frazioni raccolte mediante distillazione delicata su un evaporatore rotante (temperatura del bagno d'acqua ~ 40 ° C) per ottenere prodotti 5 (270 mg, 91%).
   2. Sintesi del dendrimero 6.
      1. Sciogliere il chelante protetta dendrimerica 5 (270 mg, 4,23 mmol) in acido formico (5 ml) e agitare la miscela a 60 ° C per 24 ore.
      2. Evaporare l'acido formico per distillazione su un evaporatore rotante (~ pressione 15 mbar, temperatura del bagnomaria ~ 40 ° C) e liofilizzare il prodotto per dare 6 (pressione ~ 0,2 mbar) ^9.
   3. Sintesi del mezzo di contrasto dendrimerica (DCA)
      1. Sciogliere il chelante dendrimerica 6 (4,35 mmol) in acqua e regolare il pH a 7,0 con idrossido di sodio 0,1 M.
      2. Sciogliere GdCl ₃ · 6H ₂ O (113 mg, 304 mmol) in acqua (1 ml) e inserirlo goccia a goccia alla soluzione di chelante 6 su un periodo di 4 ore; mantenere il pH a 7,0 con una soluzione di idrossido di sodio acquoso (0,05 M), misurando il pH con un pHmetro.
      3. Mescolare la miscela con un agitatore magnetico a Temperature per 24 ore.
      4. Aggiungere acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 158 mg, 426 mmol) a porzioni soluzione oltre 4 ore per rimuovere l'eccesso di Gd (III) mantenendo il pH a 7,0 con una soluzione di idrossido di sodio acquoso (0,05 M). Mescolare la miscela a temperatura ambiente per 24 ore.
      5. Eseguire cromatografia di esclusione molecolare per rimuovere la maggior parte dei GdEDTA e l'eccesso di EDTA. Utilizzare un supporto gel filtrazione idrofila gonfio in acqua per confezionare la colonna. Ridurre la miscela ad un volume adeguato e caricare la colonna. Eluire la colonna con acqua deionizzata senza applicare pressione.
      6. Centrifugare il campione utilizzando un'unità filtro centrifugo 3 kDa per 30 min a centrifuga forza 1.800 xg per rimuovere i residui di GdEDTA e EDTA. Ripetere questo passaggio (circa cinque volte) fino a quando il filtrato mostra l'assenza di EDTA e GdEDTA. Trasferire il campione in una beuta, evaporare, e poi liofilizzare il solvente per ottenere un prodotto quasi bianco come finale DCA (186 mg, 71%).
         NOTA: Controllare l'assenza di EDTA e GdEDTA mediante ESI-MS.
      7. Confermare l'assenza di Gd (III) come ione libera utilizzando il test xilenolo arancio. Sciogliere il filtrato (0,5 ml) in una soluzione tampone acetato (pH 5,8). Aggiungere poche gocce di una soluzione xilenolo arancio e monitorare il cambiamento di colore (colore giallo o viola indica l'assenza o la presenza di libera Gd (III) ioni in soluzione, rispettivamente) ^11.

2. In Vitro Caratterizzazione di dendrimerici Prodotti

1. Stima del numero di macrociclici DOTA-unità accoppiate al dendrimero PAMAM (caricamento del dendrimero con macrocicli DOTA-like)
   1. Stima con ¹ H NMR (NMR - spettroscopia di risonanza magnetica nucleare).
      NOTA: Questa procedura è possibile in dendrimeri 5 e 6, ma non su DCA.
      1. Registrare lo spettro ¹ H NMR ^12.
      2. Integrare la regione aromatico e due regioni distinte alifatici (1. segnali del dendrimero alifatica e protoni macrociclici, 2. segnali dei gruppi t -bu) o solo una regione alifatico per dendrimeri 5 e 6, rispettivamente.
         Nota: Non vi è alcun segnale separato nella regione alifatici origine dai gruppi t -bu in dendrimero 6 in quanto sono stati idrolizzati.
      3. Utilizzare Eq. 1 o Eq. 2 per stimare il numero di unità macrociclici (n), dove R = il rapporto degli integrali (alifatici / aromatici in Eq. 1 o alifatici-dendrimero / aliphatic- T- Bu in eq. 2), H = _DEnd il numero di protoni in dendrimero, H _Ar = il numero di protoni aromatici, H _{t Bu} = il numero di protoni in gruppi t -bu, e H _mac = il numero di protoni in un macrociclo.
         Nota: In entrambi i casi Eq. 1 o Eq. 2 possono essere usati for dendrimero 5, mentre solo Eq. 1 può essere utilizzato per dendrimero 6. Dal momento che i protoni scambiabili (su ammine, amidi, tiouree o carbossilati) sono tipicamente sostituiti con deuterio, che non sono stati assunti nei calcoli. Qui, H _DEnd = 1.128 (per 5) o 1000 (per 6), H _Ar = 4, e H _mac = 27 sono stati utilizzati.
         (1)
         (2)
   2. Stima da analisi elementare utilizzando il rapporto di azoto zolfo.
      1. Eseguire l'analisi elementare sul campione dendrimerica solido (DCA in questo lavoro).
      2. Utilizzare Eq. 3 per stimare il numero di unità macrociclici (n), dove R = il rapporto tra determinati% N e S%, N _DEnd o S _DEnd = il numero diazoto o atomi di zolfo nel dendrimero, e N _mac o _mac S = il numero di azoto o zolfo atomi in una sola unità macrociclico.
         Nota: Il fattore 2.29 è ottenuto dal rapporto in massa atomica di zolfo e azoto. In questo lavoro, N _DEnd = 250, S _DEnd = 2, N = 5 _Mac e _Mac S = 1 sono stati utilizzati.
         (3)
   3. Stima con matrice laser assistita tempo desorbimento / ionizzazione di volo (MALDI-TOF).
      1. Eseguire l'analisi MALDI-TOF MS ^13.
      2. Calcolare il numero di unità macrociclici (n) secondo la Eq. 4, dove M _z = massa constatato (m / z), z = la carica della specie, M = _DEnd la massa della parte dendrimerica e M _mac = la massa di una unità macrociclico.
         NOTE: M _DEnd = 14.306 e M _mac = 719 sono stati utilizzati in questo lavoro.
         (4)
2. Determinazione della DCA concentrazione ([DCA]): misura la suscettibilità magnetica Bulk (BMS)
   1. Sciogliere DCA (5-10 mg) in acqua (360 ml) in una provetta fiala di plastica ([DCA] ~ 5-10 mM).
      NOTA: [DCA] dovrebbe essere nell'intervallo di 5-10 mm per evitare un'eventuale sovrapposizione di risonanze Buoh t- a concentrazioni Campione> 15 mM, con la risonanza d'acqua a δ = 4,7 ppm.
   2. Aggiungere 60 ml di D ₂ O: t- miscela BuOH (2: 1 v / v) alla soluzione acquosa di DCA e miscelare la soluzione risultante (420 microlitri) utilizzando un mixer Vortex.
   3. Transfer 400 ml di campione in un tubo NMR esterno e posizionare un tubo NMR inserto coassiale con un BuOH t-: H ₂ O miscela (10:90 v / v) nella provetta.
   4. Discolo spettro NMR ¹ H e misurare lo spostamento di frequenza tra i segnali di risonanza derivanti da t- BuOH nei tubi NMR interno ed esterno (riferimento) ^12.
   5. Utilizzare Eq. 5 per determinare il [DCA], dove T = temperatura assoluta, Δχ = lo spostamento registrato, μ _eff = il momento efficace magnetica per uno ione dei lantanidi (μ _eff = 7.94 per Gd (III) ^14, e s = una costante dipendente dalla forma del campione e la sua posizione nel campo magnetico (0, 1/3, e 1/6 nel caso di una sfera, cilindro parallelo a, e cilindro perpendicolare al campo magnetico, rispettivamente).
      NOTA: Il valore calcolato ottenuto per il [DCA] deve essere corretto alla concentrazione originale dovuto all'aggiunta del D ₂ O: t- soluzione BuOH (60 mL).
      (5)
3. luce dinamicaScattering (DLS) misurazioni.
   1. Preparare una soluzione DCA filtrata (filtro / PTFE 0,2 micron politetrafluoroetilene, 0,75 mM per Gd (III)) in 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) tampone (25 mM, pH 7.4) e trasferirlo in un provetta per la misura DLS.
   2. Posizionare la cuvetta nell'apparecchiatura DLS e impostare i seguenti parametri: 5 ripetizioni di 15 scansioni (1 scan = 12 sec, indice di rifrazione = 1.345, assorbimento = 1%) senza ritardi tra le scansioni e con equilibrazione temperatura 30 sec prima della registrazione .
   3. Esporta i dati acquisiti ed ottenere l'istogramma distribuzione dimensionale tracciando popolazione (%) in funzione delle dimensioni (diametro idrodinamico).
4. Misurazione delle relassività longitudinali e trasversali.
   NOTA: Una procedura simile è stata già descritta utilizzando il rilassamento tempo analizzatore ^15; questa procedura è stata effettuata utilizzando un NMR spettrometro a 300 MHz con TopspinSoftware.
   1. Preparare una serie di soluzioni DCA in H ₂ O: D ₂ O (500 ml, il 10% D ₂ O in H ₂ O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, e 5,0 mm, [HEPES ] = 25 mm) dal campione DCA magazzino (vedi paragrafo 2.2).
   2. Trasferire 450 ml di soluzione in un tubo NMR e posizionarlo nello strumento.
   3. Ottimizzare i parametri di acquisizione (durata 90 ° impulso di eccitazione (p1), e l'irradiazione frequenza di offset (O ₁₎₎ e quindi eseguire il T ₁ e T ₂ esperimenti usando il recupero di inversione (IR) e Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) sequenze di impulsi, rispettivamente.
   4. Determinazione dei tempi T ₁ e T ₂ di rilassamento.
      1. Selezionare l'indice fornito, processo lo spettro 2D nella dimensione F2, ed eseguire la correzione di fase interattivo.
      2. Selezionare la porzione appropriata (picco con intensità massima) nell'analisi / T _{Finestra di rilassamento 1 / T 2, integrarlo, ed esportare la regione al modulo relax.}
      3. Selezionare la funzione appropriata raccordo (invrec o uxnmrt2 per esperimenti IR e CPMG, rispettivamente) per ottenere i tempi T ₁ o T ₂ di rilassamento.
   5. Ripetere i passaggi 2.4.4.2-2.4.4.4 per tutti i rimanenti [DCA] soluzioni.
   6. Calcolare i tassi di rilassamento (R ₁ e R ₂₎ dai valori T ₁ ottenuti (R _1,2 = 1 / T _1,2).
   7. Plot R ₁ e R ₂ (sec ^-1) in funzione della concentrazione di Gd (III) in mM.
   8. Determinare le relassività longitudinali e trasversali, r ₁ ed r ₂ (mM ^-1 sec ^-1), dalla pendenza della retta, come definito dall'eq. 6, dove R _{i, obs} = longitudinale (i = 1) o trasversale (i = 2) velocità di rilassamento diamagneticitàl'acqua in assenza di specie paramagnetiche e [Gd] = concentrazione di Gd (III) utilizzato nell'esperimento.
      (6)

3. In Vitro risonanza magnetica; Confronto tra DCA e GdDOTA

1. Preparazione di fantasmi tubo
   1. Preparare soluzioni acquose di DCA (4 x 350 mL) e GdDOTA (4 x 350 mL) e campioni di acqua (4 x 350 ml) per due serie di esperimenti in cui viene calcolata la concentrazione degli agenti di contrasto: (3.1.1.1) per Gd (III) o (3.1.1.2) per molecola.
      1. Preparare due campioni DCA e due GdDOTA campioni con concentrazioni di 0,5 e 1,0 mm per Gd (III), rispettivamente. Inoltre, preparare due campioni di acqua (come i tubi di controllo).
      2. Preparare due campioni DCA (2,5 e 5,0 mM per Gd (III) o 0,05 e 0,1 mM per molecola dendrimerica), due campioni GdDOTA (0,25, 0,5 mM) e due campioni di acqua (ControL tubi).
         NOTA: Le opportune concentrazioni DCA e GdDOTA devono essere preparati diluendo i rispettivi campioni di riserva con le concentrazioni di determinati con il metodo di BMS (vedi sezione 2.2) con tampone HEPES (pH 7,4). Al fine di semplificare i calcoli, n = 50 è stato ipotizzato per il numero medio di unità macrociclici per molecola dendrimero. Pertanto, il rapporto di DCA: GdDOTA era 1: 5, calcolato su una base per molecola.
   2. Porre i campioni a 300 tubi fiala di plastica microlitri, evitando la presenza di bolle d'aria nella soluzione.
      NOTA: Le dimensioni dei tubi fiala di plastica dipende dal tipo e dimensioni della bobina a radiofrequenza utilizzato (qui, un esempio con la bobina volume è indicato).
   3. Inserire i campioni all'interno di una siringa (60 ml di volume), riempirlo con 1 mM GdDOTA soluzione, e collocarlo nello scanner.
      NOTA: I campioni sono stati collocati nella soluzione acquosa di GdDOTA per evitare gli effetti di suscettibilità (variazioni del campo magnetico strength che si verificano vicino a interfacce tra le sostanze di diversa suscettibilità magnetica).
2. Ottimizzazione dei parametri e di imaging.
   1. Utilizzare la scansione anatomica (localizzatore / Tripilot) per posizionare la siringa con i campioni nel isocentro del magnete.
   2. Premere il semaforo (scan regolazione) per eseguire regolazioni per spessoramento (regolazione del campo magnetico dell'omogeneità) dell'intero volume, la frequenza centrale (O _1), il guadagno del ricevitore (RG), e il guadagno di trasmissione (TX0 e TX1).
   3. Per T ₁ pesate (T _1W) di imaging, selezionare il metodo veloce basso angolo di tiro (FLASH).
   4. Scegli fetta coronale per i campioni disposti verticalmente (siringa in orizzontale) nello scanner utilizzando la scansione Localizer.
   5. Utilizzare Eq. 7 per l'ottimizzazione della (CNR) di acquisizione contrasto-rumore Parametri ^16, dove α = angolo della medaglia, TE = il tempo di eco, TR =il tempo di ripetizione, e T _{1, A,} T _{1, B} = T ₁ volte del campione A (T _{1, A)} e campione B (T _{1, B)} per il quale il CNR deve essere massimizzata (lo stesso vale per T ₂ volte: T _{2, A} e T _{2, B).}
      NOTA: T ₁ e T ₂ relax volte devono essere impostati a valori ottenuti dalle misure di relassività longitudinale e trasversale (sezione 2.4), mentre TE, TR, e α dovrebbe essere ottenuto dal calcolo di ottimizzazione CNR.
      (7)
   6. Acquisire l'immagine utilizzando i parametri ottenuti nella fase precedente (3.2.5).
   7. Calcolare il rapporto segnale-rumore (SNR).
      1. Caricare l'immagine T _1W acquisita (scansione) nella visualizzazione e di elaborazione delle immaginifinestra, e fare clic su Define regione di interesse (ROI).
      2. Scegliere un ROI circolare e disegnarlo alla posizione del campione e lo sfondo. Successivamente, fai clic sul display per ottenere l'ampiezza media del segnale _(segnale S) e la deviazione standard del fondo _(rumore S).
      3. Ripetere il passaggio 3.2.7.2 per la DCA, GdDOTA, e campioni di acqua.
      4. Calcolare il SNR utilizzando la formula: SNR = _segnale S / S _rumore.
   8. A seguito di una procedura leggermente modificata, eseguire T ₂ pesate (T _2W) per immagini utilizzando la rapida acquisizione con metodo di valorizzazione di rilassamento (RARE). Per l'ottimizzazione dei parametri di acquisizione CNR, utilizzare Eq. 8.
      (8)

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Risultati

La preparazione di DCA consisteva di due fasi: 1) sintesi del monomero DOTA-tipo chelante (Figura 1) e 2) accoppiamento del chelante con il dendrimero G4 PAMAM e successiva preparazione del dendrimero Gd (III) (Figura 2) . Nella prima fase, è stato preparato un cyclen basato DOTA-tipo chelante contenente quattro acidi carbossilici e un gruppo ortogonale adatto per ulteriori modifiche sintetici. La preparazione iniziata da 1

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Discussione

Preparazione del mezzo di contrasto MRI dendrimerica richiede appropriata selezione dell'unità monomerica (cioè, il chelante per Gd (III)). Essi riducono la tossicità di questo ione paramagnetico e, ad oggi, una grande varietà di aciclici e chelanti macrociclici servire a questo scopo ^1-3. Tra questi, macrociclici DOTA tipo chelanti possiedono la massima stabilità termodinamica e cinetica inerzia e, quindi, sono la scelta più preferito per la preparazione di agenti di contrasto per MRI iner...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclen	CheMatech	C002
tert-Butyl bromoacetate	Alfa Aesar	A14917
N,N-Dimethylformamide	Fluka	40248
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid	Aldrich	335339
Thionyl chloride	Acros Organics	382662500	Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine	Acros Organics	402841000	Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled
Diethyl ether	any source
Sodium sulphate	Acros Organics	196640010
Chloroform	VWR Chemicals	22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate	Aldrich	364789	Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate	Acros Organics	174560250	48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate	Acros Organics	424270010
Ethyl-acetate	any source		For column chromatography
n-Hexane	any source		For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus	Büchi		Model type: Glass oven B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
Methanol	any source		For column chromatography
Dichloromethane	any source		For column chromatography
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
Ammonia	Acros Organics	428381000	7 N Solution in Methanol
Palladium	Aldrich	643181	15% wet
Hydrogenation apparatus PARR	PARR Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
Sintered glass funnel	any source
Thiophosgen	Aldrich	115150	Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine	Alfa Aesar	A12646
Dichloromethane	Acros Organics	348460010	Extra dry
Magnetic stirrer	any source
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
Thin-layer chromatography plates	Merck Millipore	1.05554.0001
Formic acid	VWR Chemicals	20318.297
Lophylizer	any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate	Aldrich	G7532
Sodium hydroxide	Acros Organics	134070010
pH meter	any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Aldrich	E5134
Mass spectrometer (ESI)	Agilent		Ion trap SL 1100
Acetate buffer	any source		pH 5.8
Xylenol orange	Aldrich	52097	20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge	any source
NMR spectrometer	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Version 2.1
Combustion analysis instrument	EuroVector SpA		EuroEA 3000 Elemental Analyser
MALDI-ToF MS instrument	Applied Biosystems		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-Butyl alcohol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Vortex mixer	any source
Norell NMR tubes	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR coaxial tube	Deutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS instrument	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
Plastic tube vials	any source
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI scanner	Bruker		BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil	Bruker		Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software)	Bruker		Version 5.1