preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de agentes de contraste à base de dendrímeros para Ressonância Magnética

Resumo

Este protocolo descreve a preparação e caracterização de um agente de contraste dendrimérico ressonância magnética (MRI), que transporta os quelatos macrocíclicos baseados-ciclen coordenação iões paramagnéticos gadolínio. Numa série de experiências de ressonância magnética in vitro, este agente produzido um sinal de ressonância magnética amplificado quando em comparação com o análogo monomérico comercialmente disponível.

Resumo

complexos paramagnéticos de gadolínio (III) com acíclico ou quelatos macrocíclicos são os agentes de contraste mais comumente utilizados (CAS) para imagens de ressonância magnética (MRI). O seu objectivo é melhorar a taxa de relaxação dos protões da água no tecido, aumentando assim o contraste da imagem MR e a especificidade das medições de ressonância magnética. agentes de contraste actuais clinicamente aprovados são moléculas de baixo peso molecular que são rapidamente eliminados do corpo. O uso de dendrímeros como transportadores de agentes quelantes paramagnéticas podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento futuro de agentes mais eficazes de contraste para IRM. Especificamente, o aumento na concentração local das espécies paramagnéticas resultados em um sinal de contraste mais elevado. Além disso, esta CA fornece um tempo de retenção mais longo do tecido devido ao seu elevado peso molecular e tamanho. Aqui, demonstramos um processo conveniente para a preparação de agentes de contraste macromoleculares de MRI à base de poli (amidoamina) (PAMAM) dendrímeros com monomacrocíclicos do tipo quelantes DOTA (DOTA - 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acetato). A unidade quelante foi anexado ao explorar a reactividade do grupo isotiocianato (NCS) para os grupos amina na superfície do dendrímero PAMAM para formar pontes de tioureia. dendriméricos produtos foram purificados e analisados ​​por meio de espectroscopia de ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa e análise elementar. Finalmente, as imagens de RM de alta resolução foram registados e os contrastes sinal obtido a partir do dendrimérico preparada e os agentes monoméricos disponíveis comercialmente foram comparados.

Introdução

A ressonância magnética (MRI) é uma técnica de imagem poderosa e não-ionizante amplamente utilizado na investigação biomédica e diagnóstico clínico devido à sua natureza não invasiva e excelente contraste de tecidos moles intrínseco. Os métodos de ressonância magnética mais comumente utilizados utilizar o sinal obtido a partir de protões da água, fornecendo imagens de alta resolução e a informação detalhada dentro dos tecidos com base em diferenças na densidade dos sinais de água. A intensidade do sinal e a especificidade das experiências de ressonância magnética pode ser ainda melhorada utilizando agentes de contraste (CAs). Estas espécies são paramagnéticos ou superparamagnéticos que afectam o longitudinal _(T1) e transversal _(T2) dos tempos de relaxação, respectivamente ^1,2.

Complexos do gadolínio lantanídeos íon com poliaminoácidos ligandos de ácidos policarboxílicos são as mais comumente usadas T ₁ CAs. Gadolínio (III) encurta o t _um relaxamentotempo dos protões da água, aumentando assim o contraste do sinal em MRI experiências ^3. No entanto, o gadolínio iónico é tóxico; o seu tamanho, que se aproxima de cálcio (II), e isto afecta gravemente a sinalização em células assistida-cálcio. Portanto, acíclicos e macrocíclicos quelatos são empregadas para neutralizar esta toxicidade. Vários ligandos multidentados têm sido desenvolvidos até ao momento, resultando em complexos de gadolínio (III) com elevada estabilidade termodinâmica e inércia cinética ^1. Aqueles com base nos ciclen azamacrocycle de 12 membros, em particular, o seu derivado de DOTA tetracarboxílico (1,4,7,10-tetrazaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acetato) são os complexos mais investigados e aplicadas desta classe CA.

No entanto, GdDOTA tipo CAs são sistemas de baixo peso molecular, exibindo certas desvantagens, como a baixa eficiência de contraste e excreção renal rápido. Macromolecular e multivalente CAs pode ser uma boa solução para estes problemas ^4. Desde CA biodistribução é determinada principalmente pelo seu tamanho, CAs macromoleculares exibir tempos de retenção muito mais longos dentro dos tecidos. Igualmente importante, o multivalência destes agentes resulta em uma concentração local aumentada da sonda monomérica MR (por exemplo, complexo GdDOTA), melhorando substancialmente o sinal MR adquirida ea qualidade da medição.

Dendrímeros estão entre os andaimes mais preferidos para a preparação de CAs multivalente de MRI ^4,5. Estas macromoléculas altamente ramificada, com dimensões bem definidas são propensos a várias reacções de acoplamento na sua superfície. Neste trabalho, relatamos a preparação, purificação e caracterização de uma CA dendrimérico para MRI consistindo de um 4 (G4) poli geração (amidoamina) (PAMAM) dendrimer acoplado a quelatos GdDOTA-like (DCA). Descreve-se a síntese do derivado de DOTA reactivo e o seu acoplamento ao dendrímero PAMAM. Após complexação com Gd (III), a caracterização físico-química padrão procedure da DCA foi realizada. Finalmente, as experiências de MRI foram realizadas para demonstrar a capacidade de DCA para produzir imagens de RM com um contraste mais forte do que os obtidos a partir de baixo peso molecular CAs.

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Protocolo

1. Preparação de DCA

1. Síntese da unidade monomérica 4 ^6.
   1. Síntese de 4- (4-nitrofenil) -2- (terc-4,7,10-tris- butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-il) butírico éster de ácido terc-butilo (2).
      1. Dissolver (4,7-bis- terc-butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-tetra-aza-cyclododec-1-il) terc-butil éster do ácido acético 1 (1,00 g, 1,94 mmol) em N, N-dimetilformamida ( DMF, 5 ml), adiciona-se carbonato de potássio (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 equiv.) e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 45 min.
         NOTA: Macrociclo 1 foi preparado a partir ciclen e bromoacetato de terc-butilo de acordo com o procedimento previamente publicado em ^7.
      2. Adicionar terc-butil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato de etilo (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 equiv.) Em porções durante 1 h. Continuar a agitar a mistura sob tele mesmas condições de reacção para a 18 h seguintes.
         Nota:-butil-2-bromo-4-terc-(4-nitrofenil) butanoato de etilo foi preparado a partir de 4- (4-nitrofenil) butírico, cloreto de tionilo, e o bromo de acordo com o procedimento previamente publicada ^8.
      3. Remover DMF por meio de destilação sob vácuo bolbo-a-bolbo a 40-60 ° C ^9.
      4. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna (gel de sílica, metanol a 7% / diclorometano) para se obter o produto 2 como um sólido amorfo castanho (1,09 g, 72%) ^10.
   2. Síntese de 4- (4-aminofenil) -2- (terc-4,7,10-tris- butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-il) butírico éster de ácido terc-butilo (3).
      1. Dissolve-se o derivado nitrobenzeno 2 (1,00 g, 1,28 mmol) em etanol (10 ml) e solução de amónia a 7 N em metanol (150 ul). Adicionar paládio em carvão activado como catalisador (Pd / C, 150 mg, 15% em peso) para a solução queem.
      2. Agitar a mistura heterogénea durante 16 horas sob uma atmosfera de hidrogénio (2,5 bar) no aparelho hidrogenador de Parr.
      3. Preparar uma pasta de terra de diatomáceas através da sua suspensão em etanol e filtração da suspensão através de um funil de vidro sinterizado. Verter a suspensão a partir 1.1.2.2 sobre o bolo preparado para remover o catalisador de Pd / C por filtração.
      4. Remover o solvente por destilação suave num evaporador rotativo (temperatura do banho de água a ~ 40 ° C) para se obter o composto 3 como um sólido amorfo castanho (0,91 g, 95%).
   3. Síntese de 4- (4-isotiocianatofenil) -2- (terc tetraazacyclododec-1-il 4,7,10-tris- butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-) de terc-butil éster do ácido butírico (4).
      1. Adicionar tiofosgénio (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 equiv.) A uma mistura de 3 (0,91 g, 1,22 mmol) e trietilamina (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 equiv.) Em diclorometano (15 mL).
      2. Vigorosamente agitar as mi de reaçãoxture com um agitador magnético à temperatura ambiente durante 16 h.
      3. Remover o solvente por destilação suave num evaporador rotativo (temperatura do banho de água a ~ 40 ° C), e, em seguida, purificar o produto bruto por cromatografia em coluna (gel de sílica, 5% de metanol / diclorometano) para se obter o produto 4 como um castanho claro sólido amorfo (0,51 g, 53%).
2. Síntese do DCA dendrímero.
   1. Síntese do dendrímero 5.
      1. Aqui dendrímero G4-PAMAM (667 mg, solução de dendrímero 10% em metanol, 4,67 mol), evapora-se o metanol por destilação suave num evaporador rotativo (temperatura do banho de água a ~ 40 ° C), e dissolve-se o resíduo em DMF (4 ml) .
      2. Adicionar trietilamina (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 equiv.), Agitar durante 45 min a 60 ° C, e adicionar o isotiocianato de 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 equiv. Em relação aos grupos amino de superfície do dendrímero) ove porçõesR 1 h.
      3. Agita-se a mistura de reacção com um agitador magnico a 45 ° C durante 48 h.
      4. Remover o solvente por meio de destilação sob vácuo bolbo-a-bolbo a 40-60 ° C.
      5. Purifica-se o resíduo por cromatograf ia de exclusão de tamanho utilizando um meio de filtração em gel lipofílico e metanol como o eluente. Para empacotar a coluna, inchar o meio de filtração em metanol durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (> 4 ml de metanol por 1 g de pó), sem aplicação de pressão. Executar separação de gravidade através da recolha de fracções de 1 ml.
      6. Analisar as fracções recolhidas por cromatografia de camada fina (TLC). Desenvolver a placa de TLC, em 15% de metanol / diclorometano (apenas a mancha mais polar localizado na linha de base é derivada de produto dendrimérico). Evapora-se as fracções recolhidas por destilação suave num evaporador rotativo (temperatura do banho de água a ~ 40 ° C) para se obter o produto 5 (270 mg, 91%).
   2. Síntese do dendrímero 6.
      1. Dissolve-se o agente quelante protegido dendrimérico 5 (270 mg, 4,23 mol) em ácido fórmico (5 ml) e agita-se a mistura a 60 ° C durante 24 h.
      2. Evapora-se o ácido fórmico por destilação num evaporador rotativo (~ pressão 15 mbar, temperatura de banho de água a ~ 40 ° C) e liofilizar o produto para dar origem a 6 (~ pressão de 0,2 mbar) ^9.
   3. Síntese do agente de contraste dendrimérico (DCA)
      1. Dissolve-se o agente quelante dendrimérico 6 (4,35 mol) em água e ajustar o pH para 7,0 com hidróxido de sódio 0,1 M.
      2. Dissolver GdCl ₃ .6H ₂ O (113 mg, 304 umol) em água (1 mL) e adicionar-gota a gota à solução de quelante de 6 durante um período de 4 horas; manter o pH a 7,0 com solução de hidróxido de sódio aquoso (0,05 M) de medição de pH com um medidor de pH.
      3. Agita-se a mistura com um agitador magnético no quarto temperatura durante 24 h.
      4. Adicionar ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 158 mg, 426 umol) em porções à solução ao longo de 4 horas para remover o excesso de Gd (III), enquanto se mantém o pH a 7,0 com solução de hidróxido de sódio aquoso (0,05 M). Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 24 h.
      5. Realizar cromatografia de exclusão de tamanho para remover a maioria dos GdEDTA e o excesso de EDTA. Utilizar um meio de filtração em gel hidrofílico inchado em água para embalar a coluna. Reduzir a mistura para um volume adequado e carregar a coluna. Elui-se a coluna com água desionizada sem aplicar pressão.
      6. Centrifugar a amostra utilizando uma unidade de filtração centrífuga 3 kDa durante 30 min a 1800 xg força centrífuga para remover os resíduos de GdEDTA e EDTA. Repetir esta etapa (cerca de cinco vezes) até que o filtrado revela a ausência de EDTA e GdEDTA. Transferir a amostra para um balão, evapora-se que, em seguida, liofilizar o solvente para se obter um produto esbranquiçado como o DCA final (186 mg, 71%).
         NOTA: Verifique ausência de EDTA e GdEDTA por meio de ESI-MS.
      7. Confirmar a ausência de Gd (III) como um íon livre usando o teste de laranja de xilenol. Dissolve-se o filtrado (0,5 ml) numa solução tampão de acetato (pH 5,8). Adicionam-se algumas gotas de uma solução cor de laranja de xilenol e controlar a mudança de cor (de cor amarela ou violeta indica a ausência ou a presença de livre de Gd (III), iões em solução, respectivamente) ^11.

2. Caracterização in vitro de produtos dendriméricos

1. A estimativa do número de unidades de DOTA-macrocíclicas acoplados ao dendrímero PAMAM (carregamento do dendrímero com DOTA-macrociclos semelhantes)
   1. Estimativa com ¹ H RMN (RMN - espectroscopia de ressonância magnética nuclear).
      NOTA: Este procedimento é possível em dendrímeros 5 e 6, mas não na DCA.
      1. Grave o espectro ^1H NMR ^12.
      2. Integrar a região aromática e as duas regiões separadas alifáticos (1. Sinais de dendrímero alifático e protões; macrocíclicas 2. Sinais dos grupos t-Bu) ou apenas uma região alifático para dendrímeros 5 e 6, respectivamente.
         Nota: Não há sinal separado na região alifático oriundos dos grupos t-Bu em dendrímeros 6 desde que tenham sido hidrolisado.
      3. Use Eq. 1 ou a Eq. 2 para estimar o número de unidades macrocíclicos (n), onde R = a proporção de integrais (alifático / aromático na Eq. 1 ou alifático-dendrímero / aliphatic- t-Bu na Eq. 2), H = _Dend o número de protões em dendrímeros, H _Ar = número de prótons aromáticos, H _{t Bu} = número de prótons em grupos t-Bu, e H _mac = número de prótons em um macrociclo.
         Nota: ou a Eq. 1 ou a Eq. 2 pode ser utilizada foR dendrímero 5, enquanto que apenas a Eq. 1 pode ser utilizado para dendrímero 6. Desde protões permutáveis ​​(em aminas, amidas, tioureias, ou carboxilatos) são tipicamente ser substituído por deutério, eles não foram considerada nos cálculos. Aqui, H _Dend foram usadas = 1128 (para 5) ou 1000 (para o 6), H _Ar = 4, e H _Mac = 27.
         (1)
         (2)
   2. Estimativa de análise elementar usando a proporção de azoto ao enxofre.
      1. Realizar a análise elementar na amostra dendrimérico sólido (DCA neste trabalho).
      2. Use Eq. 3 para estimar o número de unidades macrocíclicos (n), onde R = a proporção de N determinada% e% S, N ou S _{Dend Dend} = o número deazoto ou átomos de enxofre no dendrímero, e N ou S _{Mac Mac} = o número de átomos de azoto ou de enxofre em uma unidade macrocíclico.
         Nota: O factor de 2,29 é obtido a partir da razão de massas atómicas de enxofre e de azoto. Neste trabalho, foi utilizado N _Dend = 250, S _Dend = 2, n = 5 _Mac, e S = 1 _mac.
         (3)
   3. Estimativa com laser de tempo de dessorção / ionização assistida por matriz de voo (MALDI-TOF).
      1. Realizar a análise MALDI-TOF MS ^13.
      2. Calcular o número de unidades macrocíclicos (n) de acordo com a Eq. 4, em que M = _z a massa observada (m / z), Z = a carga das espécies, M = _Dend a massa da parte dendrimérico, e M _Mac = massa de uma unidade macrocíclico.
         NÃOTE: M _Dend = 14306 e M _mac = 719 foram utilizados neste trabalho.
         (4)
2. Determinação da concentração DCA ([DCA]): medição de suscetibilidade magnética massa (BMS)
   1. Dissolver DCA (5-10 mg) em água (360 ul) num tubo de frasco de plástico ([DCA] ~ 5-10 mM).
      NOTA: [DCA] deve estar na gama de 5-10 mm para evitar uma possível sobreposição de ressonâncias BuOH T- em concentrações da amostra> 15 mm, com a ressonância da água a δ = 4,7 ppm.
   2. Adicionar 60 ul de D ₂ O: t- BuOH mistura (2: 1 v / v) à solução aquosa de DCA e misturar a solução resultante (420 mL) utilizando um misturador de vórtice.
   3. Transferir 400 ul da amostra num tubo de RMN exterior e colocar num tubo de RMN de inserção coaxial com um BuOH t-: _H2O mistura (10:90 v / v) para o tubo de amostra.
   4. Registroe o espectro RMN de ^1H medir o desvio de frequência entre os sinais de ressonância que derivam de t- BuOH nos tubos de RMN interior e exterior ⁽¹²⁾ de referência.
   5. Use Eq. 5 para determinar o [DCA], em que T é a temperatura absoluta, Δχ = o deslocamento registada, u _eff = o momento efectivo magnético para um ião lantanídeo (μ _eff = 7,94 para o Gd (III), ^14, e s = uma constante dependente sobre a forma da amostra e a sua posição no campo magnético (0, 1/3, e 1/6 no caso de uma esfera, o cilindro paralelo ao, e cilindro perpendicular ao campo magnético, respectivamente).
      NOTA: O valor calculado obtido para o [DCA] deve ser corrigido para a concentração original, devido à adição de D ₂ O: t- BuOH solução (60 ul).
      (5)
3. luz dinâmicaespalhamento (DLS) medições.
   1. Prepara-se uma solução DCA filtrada (filtro / PTFE de 0,2 um politetrafluoretileno, de 0,75 mm por Gd (III)) em 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) tampão (25 mM, pH 7,4) e transferi-lo para uma cuvete para a medida de DLS.
   2. Coloque a cuvete no aparelho de DLS e definir os seguintes parâmetros: 5 repetições de 15 scans (1 varredura = 12 sec, índice de refração = 1.345, a absorção = 1%), sem atrasos, entre as varreduras e com equilíbrio de temperatura de 30 segundos antes da gravação .
   3. Exportar os dados adquiridos e obter o histograma de distribuição de tamanho através da representação gráfica da população (%) como uma função do tamanho (diâmetro hidrodinâmico).
4. Medição das relaxividades longitudinais e transversais.
   NOTA: Um procedimento semelhante já foi descrito usando o relaxamento analisador ^de tempo de ^15; Este procedimento foi realizado utilizando um espectrómetro de RMN de 300 MHz com TopspinProgramas.
   1. Preparar um conjunto de soluções DCA em _H2O: D ₂ O (500 mL, 10% de D ₂ O em _H2O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, e 5,0 mM, [HEPES ] = 25 mm) a partir da amostra da DCA (ver secção 2.2).
   2. Transferir 450 ul da solução para um tubo de RMN e colocá-lo dentro do instrumento.
   3. Otimizar os parâmetros de aquisição (90 ° duração do pulso de excitação (p1), e irradiação freqüência de offset (O ₁₎₎ e, em seguida, executar a T ₁ e T ₂ experimentos utilizando a recuperação de inversão (IR) e Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) sequências de pulso, respectivamente.
   4. Determinação dos tempos t ₁ e t ₂ de relaxamento.
      1. Selecione o valor indicado, o processo do espectro 2D na dimensão F2, e realizar a correção fase interativa.
      2. Selecione a fatia apropriada (pico com intensidade máxima) na Análise / T _{Janela de relaxamento 1 / T 2, integrá-lo e exportar a região para o módulo de relaxamento.}
      3. Seleccione a função adequada, ajustando (invrec ou uxnmrt2 para IR e CPMG experimentos, respectivamente) para obter os tempos de relaxação T ₁ ou T _2.
   5. Repita os passos 2.4.4.2-2.4.4.4 para todas as soluções restantes [DCA].
   6. Calcular as taxas de relaxamento _(R1 e _R2) em relação aos valores obtidos T ₁ (R 1 = _1,2 / _1,2 t).
   7. Lote R ₁ e R ₂ ^(seg-1) como uma função de Gd (III), a concentração em mM.
   8. Determinar as relaxividades longitudinais e transversais, R ₁ e R ₂ (seg ^-1 mM ^-1), a partir do declive da linha ajustada, tal como definido pela Eq. 6, em que R _{i, obs} = longitudinal (I = 1) ou transversal (i = 2) taxa de relaxação de diamagnéticoágua, na ausência de espécies paramagnéticas e [Gd] = concentração de Gd (III) utilizado na experiência.
      (6)

3. In Vitro de ressonância magnética; Comparação entre a DCA e GdDOTA

1. Preparação de fantasmas tubo
   1. Prepare soluções aquosas de DCA (4 x 350 ul) e GdDOTA (4 x 350 ul), bem como amostras de água (4 x 350 ul) para dois conjuntos de experiências em que a concentração dos agentes de contraste é calculado: (3.1.1.1) por Gd (III) ou (3.1.1.2) por molécula.
      1. Prepare duas amostras DCA e dois GdDOTA As amostras com concentrações de 0,5 e 1,0 mm por Gd (III), respectivamente. Além disso, preparar duas amostras de água (como tubos de controle).
      2. Prepare duas amostras DCA (2,5 e 5,0 mm por Gd (III) ou 0,05 e 0,1 mm por molécula dendrimérico), duas amostras GdDOTA (0,25, 0,5 mM) e duas amostras de água (control tubos).
         NOTA: As concentrações DCA e GdDOTA apropriadas devem ser preparadas diluindo as respectivas amostras de ações com concentrações determinadas através do método BMS (ver secção 2.2) com tampão HEPES (pH 7,4). A fim de simplificar os cálculos, n = 50 foi assumida para o número médio de unidades macrocíclicas por molécula dendrímero. Portanto, o rácio de DCA: GdDOTA foi de 1: 5, calculado sobre uma base por molécula.
   2. Coloque as amostras em tubos de 300 ml dos frascos de plástico, evitando a presença de bolhas de ar na solução.
      NOTA: O tamanho dos tubos frasco de plástico depende do tipo e tamanho da bobina de radiofrequência utilizada (aqui, um exemplo com a bobina de volume é dada).
   3. Coloque as amostras dentro de uma seringa (60 ml de volume), preenchê-lo com GdDOTA 1 mM solução e colocá-lo no scanner.
      NOTA: As amostras foram colocadas na solução aquosa de GdDOTA para evitar efeitos de susceptibilidade (variações no campo magnético strength que ocorrem perto de interfaces entre substâncias de diferentes susceptibilidade magnética).
2. Otimização de parâmetros e de imagem.
   1. Use a varredura anatômica (Localizer / TriPilot) para posicionar a seringa com as amostras no isocentro do ímã.
   2. Pressione o semáforo (varredura de ajuste) para realizar ajustes para calçar (ajuste de homogeneidade do campo magnético) de todo o volume, a frequência central (O _1), o ganho do receptor (RG) e o ganho de transmissão (TX0 e TX1).
   3. Para T ₁ ponderadas (T _1w) de imagem, selecione o método rápido de baixo ângulo de tiro (FLASH).
   4. Escolha fatia coronal para as amostras colocadas verticalmente (seringa horizontalmente) no scanner usando a digitalização Localizer.
   5. Use Eq. 7 para optimização da aquisição contraste-ruído (CNR) Parâmetros ^16, onde α = o ângulo da aleta, TE = o tempo de eco, TR =o tempo de repetição, e T _{1, A,} T _{1, B} = T ₁ tempos de amostra A (t _{1, A)} e a amostra B (T _{1, B)} para o qual o CNR deve ser maximizado (o mesmo é válido para T ₂ vezes: T _{2, A} e T _{2, B).}
      NOTA: T ₁ e T ₂ vezes relaxamento deve ser ajustado para valores obtidos a partir das medições de relaxividades longitudinais e transversais (secção 2.4), enquanto que TE, TR, e α deve ser obtido a partir do cálculo optimização CNR.
      (7)
   6. Adquirem a imagem usando os parâmetros obtidos no passo anterior (3.2.5).
   7. Calcula-se a relação sinal-para-ruído (SNR).
      1. Carregar a imagem T _1w adquirida (varredura) para a exibição e processamento de imagemjanela, e clique em Definir região de interesse (ROI).
      2. Escolha um ROI circular e desenhá-la na posição de amostra e de fundo. Subsequentemente, clicar no indicador para obter a amplitude média do sinal _(sinal S) e o desvio padrão do fundo _(ruído S).
      3. Repita o passo 3.2.7.2 para a DCA, GdDOTA, e amostras de água.
      4. Calcular o SNR utilizando a fórmula: SNR = _sinal S / S _ruído.
   8. Seguindo um procedimento ligeiramente modificado, execute T ₂ ponderadas (T _2W) imaging usando a rápida aquisição com o método de valorização de relaxamento (raro). Para otimização dos parâmetros de aquisição CNR, use Eq. 8.
      (8)

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Resultados

A preparação de DCA consistia em duas fases: 1) a síntese da monomérica tipo DOTA quelante (Figura 1) e 2) de acoplamento do quelante com o dendrímero G4 PAMAM e preparação subsequente do Gd dendrimérico (III) complexo (Figura 2) . Na primeira fase, foi preparado um tipo de DOTA quelante à base de ciclen contendo quatro ácidos carboxílicos e um grupo ortogonal apropriado para outras modificações sintéticas. A preparação i...

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Discussão

Preparação do agente de contraste para IRM dendrimérico requer selecção adequada da unidade monomérica (isto é, o quelante de Gd (III)). Eles reduzem a toxicidade do ião paramagnético e, até à data, uma ampla variedade de acíclicos e quelantes macrocíclicos servir para este fim ^1-3. Entre estes, os quelantes macrocíclicos-DOTA tipo possuem a maior estabilidade termodinâmica e inércia cinética e, portanto, são a escolha preferida para a preparação de agentes de contraste para IRM i...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclen	CheMatech	C002
tert-Butyl bromoacetate	Alfa Aesar	A14917
N,N-Dimethylformamide	Fluka	40248
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid	Aldrich	335339
Thionyl chloride	Acros Organics	382662500	Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine	Acros Organics	402841000	Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled
Diethyl ether	any source
Sodium sulphate	Acros Organics	196640010
Chloroform	VWR Chemicals	22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate	Aldrich	364789	Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate	Acros Organics	174560250	48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate	Acros Organics	424270010
Ethyl-acetate	any source		For column chromatography
n-Hexane	any source		For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus	Büchi		Model type: Glass oven B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
Methanol	any source		For column chromatography
Dichloromethane	any source		For column chromatography
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
Ammonia	Acros Organics	428381000	7 N Solution in Methanol
Palladium	Aldrich	643181	15% wet
Hydrogenation apparatus PARR	PARR Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
Sintered glass funnel	any source
Thiophosgen	Aldrich	115150	Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine	Alfa Aesar	A12646
Dichloromethane	Acros Organics	348460010	Extra dry
Magnetic stirrer	any source
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
Thin-layer chromatography plates	Merck Millipore	1.05554.0001
Formic acid	VWR Chemicals	20318.297
Lophylizer	any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate	Aldrich	G7532
Sodium hydroxide	Acros Organics	134070010
pH meter	any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Aldrich	E5134
Mass spectrometer (ESI)	Agilent		Ion trap SL 1100
Acetate buffer	any source		pH 5.8
Xylenol orange	Aldrich	52097	20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge	any source
NMR spectrometer	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Version 2.1
Combustion analysis instrument	EuroVector SpA		EuroEA 3000 Elemental Analyser
MALDI-ToF MS instrument	Applied Biosystems		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-Butyl alcohol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Vortex mixer	any source
Norell NMR tubes	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR coaxial tube	Deutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS instrument	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
Plastic tube vials	any source
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI scanner	Bruker		BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil	Bruker		Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software)	Bruker		Version 5.1