Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung der für Magnetresonanz-Kontrastmittel Dendrimer-basierten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Charakterisierung eines dendrimeren Magnetresonanztomographie (MRI), die Kontrastmittel trägt cyclen basierenden makrocyclischen Chelate paramagnetischen Ionen Gadolinium- koordinieren. In einer Reihe von MRI - Experimente in vitro produzierte dieses Mittel ein verstärktes MRI - Signal , wenn an dem handelsüblichen monomeren Analogon verglichen.

Zusammenfassung

Paramagnetische Komplexe von Gadolinium (III) mit acyclischen oder makrocyclischen Chelate sind die am häufigsten verwendeten Kontrastmittel (CAs) für die Magnetresonanztomographie (MRI). Ihr Zweck ist es, die Relaxationsrate von Wasserprotonen in Gewebe zu verbessern, wodurch die MR Bildkontrast und die Spezifität der MRI-Messungen. Strom klinisch zugelassenen Kontrastmittel sind niedermolekulare Moleküle, die vom Körper rasch gelöscht werden. Die Verwendung von Dendrimere als Träger von paramagnetischem Chelatoren kann eine wichtige Rolle bei der zukünftigen Entwicklung von effizienteren MRI-Kontrastmittel spielen. Insbesondere die Erhöhung der lokalen Konzentration der paramagnetischen Spezies führt zu einem höheren Signalkontrast. Darüber hinaus liefert diese CA eine längere Geweberetentionszeit aufgrund seines hohen Molekulargewicht und -größe. Hier zeigen wir, ein praktikables Verfahren zur Herstellung von hochmolekularen MRI-Kontrastmittel auf Basis von Poly (amidoamin) (PAMAM) Dendrimere mit monomacrozyklischen DOTA-Typ Chelatoren (DOTA - 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetate). Die chelatbildende Einheit wurde durch Ausnutzen der Reaktivität des Isothiocyanat (NCS) Gruppe in Richtung der Aminoberflächengruppen des PAMAM Dendrimer beigefügten Thioharnstoff Brücken zu bilden. Dendrimeren Produkte wurden mittels Kernresonanzspektroskopie, Massenspektrometrie gereinigt und analysiert, und die Elementaranalyse. Schließlich wurden hochaufgelöste MR-Bilder aufgenommen und die Signal Kontraste aus dem vorbereiteten dendrimeren und den im Handel erhältlichen monomeren Mittel verglichen wurden erhalten.

Einleitung

Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist ein leistungsfähiges und nichtionisierende Bildgebungstechnik weit verbreitet in der biomedizinischen Forschung und der klinischen Diagnostik aufgrund seiner nicht-invasiven Natur und ausgezeichnete Eigenweichteilkontrast. Die am häufigsten verwendeten MRI Verfahren verwenden das Signal von Wasserprotonen erhalten wird, Bilder mit hoher Auflösung und die Bereitstellung detaillierter Informationen innerhalb der von Unterschieden in der Dichte der Wassersignale basierend Geweben. Die Signalintensität und die Spezifität der MRI-Experimente weiter verbessert werden kann unter Verwendung von Kontrastmitteln (CAs). Diese sind paramagnetische oder super Spezies , die die longitudinale (T ₁₎ und Querrichtung (T ₂₎ Relaxationszeiten beeinflussen bzw. ^1,2.

Komplexe der Lanthanid - Ion Gadolinium mit Polyaminogruppen Polycarbonsäure Liganden sind die am häufigsten verwendeten T ₁ CAs. Gadolinium (III) verkürzt die T ₁ EntspannungsZeit von Wasserprotonen zu erhöhen, so dass die Signalkontrast in der MRT - Experimente ^3. Jedoch ionische Gadolinium ist giftig; dessen Größe etwa derjenigen von Calcium (II), und es wirkt sich stark Calcium-assisted in Zellen signalisieren. Daher Chelate azyklisch und makrocyclischen werden verwendet, um diese Toxizität zu neutralisieren. Verschiedene mehrzähnigen Liganden wurden bisher ^1, was zu Gadolinium (III) -Komplexe mit hoher thermodynamischer Stabilität und kinetische Inertheit entwickelt. Diejenigen, auf der Basis der 12-glied azamacrocycle cyclen, insbesondere seine Tetra Derivat DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetate) sind die am besten untersuchten und angewandte Komplexe dieser CA-Klasse.

Dennoch GdDOTA-Typ CAs sind niedermolekulare Systeme und zeigt gewisse Nachteile wie geringe Kontrast Effizienz und schnelle renale Ausscheidung. Makromolekulare und mehrwertige CAs kann eine gute Lösung für diese Probleme ⁴ sein. Da CA biodistribution wird vor allem durch ihre Größe bestimmt, hochmolekularen CAs Anzeige viel längere Retentionszeiten innerhalb von Geweben. Ebenso wichtig ist , die Multivalenz dieser Mittel führt zu einer erhöhten lokalen Konzentration des monomeren MR - Sonde (beispielsweise GdDOTA complex), im wesentlichen den erfassten MR - Signals und die Messqualität zu verbessern.

Dendrimere sind unter den am meisten bevorzugten Gerüste für die Herstellung von mehrwertigen CAs für MRI ^4,5. Diese hochverzweigten Makromoleküle mit definierter Größen sind anfällig für verschiedene Kopplungsreaktionen auf ihrer Oberfläche. In dieser Arbeit berichten wir über die Herstellung, Reinigung und Charakterisierung eines dendrimeren CA für die MRT, bestehend aus einer Generation 4 (G4) Poly (Amidoamin) (PAMAM) Dendrimer gekoppelt GdDOTA artigen Chelate (DCA). Wir beschreiben die Synthese des reaktiven DOTA-Derivat und dessen Kopplung an das PAMAM-Dendrimer. Folge der Komplexbildung mit Gd (III), die Standard-physikochemische Charakterisierung procedure von DCA durchgeführt wurde. Schließlich wurden MRI-Experimente ausgeführt, um die Fähigkeit von DCA zu erzeugen MR-Bilder mit einem stärkeren Kontrast als die von niedermolekularen CAs erhalten zu demonstrieren.

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Protokoll

1. Herstellung von DCA

1. Synthese der monomeren Einheit 4 ^6.
   1. Synthese von 4- (4-nitrophenyl) -2- (4,7,10-tris- tert - butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) buttersäure - tert-butylester (2).
      1. Auflösen (4,7-bis- tert - butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-yl) -essigsäure-tert-butylester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) in N, N - Dimethylformamid ( DMF, 5 ml), Kaliumcarbonat (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 equiv.) und rühren der Mischung bei Raumtemperatur für 45 min hinzu.
         HINWEIS: Der Makrocyclus 1 wurde aus cyclen hergestellt und tert-Butylbromacetat gemäß dem zuvor veröffentlichten Verfahren ^7.
      2. Hinzufügen , tert - Butyl-2-brom-4- (4-nitrophenyl) butanoat (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 Äquiv.) Portionsweise über 1 Std. Weiter die Mischung unter Rühren ter denselben Reaktionsbedingungen für die folgenden 18 Stunden.
         Hinweis: tert - Butyl-2-brom-4- (4-nitrophenyl) butanoat wurde aus 4- (4-nitrophenyl) -buttersäure, Thionylchlorid und Brom nach dem zuvor veröffentlichten Verfahren ^8.
      3. Entfernen DMF mittels bulb-to-bulb Vakuumdestillation bei 40-60 ° C ^9.
      4. Reinige den Rückstand durch Säulenchromatographie (Kieselgel, 7% Methanol / Dichlormethan) Produkt 2 als brauner amorpher Feststoff (1,09 g, 72%) zu erhalten ^10.
   2. Synthese von 4- (4-aminophenyl) -2- (4,7,10-tris- tert - butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) buttersäure - tert-butylester (3).
      1. Man löst das Nitrobenzolderivat 2 (1,00 g, 1,28 mmol) in Ethanol (10 ml) und 7 N Ammoniak - Lösung in Methanol (150 ul). Hinzufügen, Palladium auf Aktivkohle als Katalysator (Pd / C, 150 mg, 15 wt%) mit dem solutiauf.
      2. Schütteln die heterogene Mischung 16 h unter Wasserstoffatmosphäre (2,5 bar) in der Parr-Hydriervorrichtung Vorrichtung.
      3. Bereiten einen Kuchen aus Diatomeenerde, indem sie in Ethanol suspendiert und Filtrieren der Suspension durch einen gesinterten Glastrichter. Gießen Sie die Suspension von 1.1.2.2 über den vorbereiteten Kuchen des Pd / C-Katalysator durch Filtration zu entfernen.
      4. Entfernen des Lösungsmittels durch schonende Destillation am Rotationsverdampfer (Wasserbadtemperatur ~ 40 ° C) Verbindung 3 als brauner amorpher Feststoff (0,91 g, 95%) zu erhalten.
   3. Synthese von 4- (4-isothiocyanatophenyl) -2- (4,7,10-tris- tert - butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10 tetraazacyclododec-1-yl) buttersäure - tert-butylester (4).
      1. Hinzufügen Thiophosgen (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 equiv.) Zu einer Mischung von 3 (0,91 g, 1,22 mmol) und Triethylamin (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 Äquiv.) In Dichlormethan (15 ml).
      2. Kräftig rühren die Reaktions mixture mit einem Magnetrührer bei Raumtemperatur für 16 Stunden.
      3. Entfernen des Lösungsmittels durch schonende Destillation am Rotationsverdampfer (Wasserbadtemperatur ~ 40 ° C) und reinigt dann das Rohprodukt durch Säulenchromatographie (Kieselgel, 5% Methanol / Dichlormethan) , um das Produkt 4 als hellbraunen amorphen Feststoff zu erhalten (0,51 g, 53%).
2. Synthese des Dendrimers DCA.
   1. Synthese des Dendrimers 5.
      1. Nehmen G4-PAMAM-Dendrimer (667 mg, 10% Dendrimer-Lösung in Methanol, 4,67 umol), verdampfe das Methanol durch schonende Destillation am Rotationsverdampfer (Wasserbadtemperatur ~ 40 ° C) und löst den Rückstand in DMF (4 ml) .
      2. Hinzufügen Triethylamin (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 equiv.), Unter Rühren für 45 min bei 60 ° C, und fügen Isothiocyanat 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 equiv. , Bezogen auf die Amino - Oberflächengruppen des Dendrimers) portionen Over 1 Std.
      3. Rühre das Reaktionsgemisch mit einem Magnetrührer bei 45 ° C für 48 Stunden.
      4. Entfernen des Lösungsmittels mittels bulb-to-bulb Vakuumdestillation bei 40-60 ° C.
      5. Reinige den Rückstand durch Grßenausschlußchromatographie einen lipophilen Gelfiltrationsmedium und Methanol als Elutionsmittel verwendet wird. Um die Spalte packen, schwellen die Filtrationsmedien in Methanol für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur (> 4 ml Methanol pro 1 g Pulver), ohne Druck auszuüben. Führen Schwerkrafttrennung durch das Sammeln von 1-ml-Fraktionen.
      6. Analysieren Sie die gesammelten Fraktionen mit Dünnschichtchromatographie (TLC). Entwickeln Sie die DC-Platte in 15% Methanol / Dichlormethan (nur die meisten polaren Fleck auf der Basislinie befindet sich von dendrimeren Produkt abgeleitet). Man dampft die gesammelten Fraktionen , die durch schonende Destillation auf einem Rotationsverdampfer (Wasserbad Temperatur ~ 40 ° C) zur Produkt 5 (270 mg, 91%) zu erhalten.
   2. Synthese des Dendrimers 6.
      1. Man löst den geschützten dendrimeren Chelator 5 (270 mg, 4,23 umol) in Ameisensäure (5 ml) und rührt die Mischung bei 60 ° C für 24 Std.
      2. Dampfe das Ameisensäure durch Destillation auf einem Rotationsverdampfer (~ 15 mbar Druck, Wasserbadtemperatur ~ 40 ° C) und Gefriertrocknungs das Produkt erhalten wurde 6 (Druck ~ 0,2 mbar) ^9.
   3. Die Synthese des dendrimeren Kontrastmittel (DCA)
      1. Man löst den dendrimeren Chelator 6 (4,35 & mgr; mol) in Wasser und den pH - Wert auf 7,0 mit 0,1 M Natriumhydroxid.
      2. Löse GdCl ₃ · 6 H ₂ O (113 mg, 304 & mgr; mol) in Wasser (1 ml) und fügen Sie die Lösung von Chelator 6 über einen Zeitraum von 4 Stunden zugetropft; Aufrechterhaltung des pH-Wertes auf 7,0 mit wässriger Natriumhydroxidlösung (0,05 M) von pH-Wert mit einem pH-Meter gemessen wird.
      3. Rühren Sie die Mischung mit einem Magnetrührer bei Raum temperatur für 24 Stunden.
      4. Hinzufügen, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 158 mg, 426 umol) der Lösung portionsweise über 4 Stunden den Überschuß an Gd (III) zu entfernen, während der pH auf 7,0 mit wässriger Natriumhydroxidlösung aufrechterhalten (0,05 M). Rühren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 24 Std.
      5. Führen Grßenausschlußchromatographie die Mehrheit der GdEDTA und den Überschuß an EDTA zu entfernen. Verwenden Sie ein hydrophiles Gel Filtrationsmedium in Wasser gequollen um die Säule zu packen. Reduzieren Sie die Mischung auf ein geeignetes Volumen und die Säule geladen. Eluieren der Säule mit VE-Wasser ohne Druck auszuüben.
      6. Zentrifugieren Sie die Probe mit einem 3 kDa Zentrifugalfiltereinheit 30 min bei Zentrifugalkraft 1800 xg die Reste von GdEDTA und EDTA zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt (rund fünf Mal), bis das Filtrat, das das Fehlen von EDTA und GdEDTA zeigt. Übertragen Sie die Probe in einen Kolben, verdampfen, und dann gefriertrocknen das Lösungsmittel ein weißliches Produkt als letzte DCA (186 mg, 71% zu erhalten).
         HINWEIS: Überprüfen Sie Abwesenheit von EDTA und GdEDTA durch ESI-MS.
      7. Bestätigen Sie die Abwesenheit von Gd (III) als freies Ion der Xylenolorangelösung Test. Man löst das Filtrat (0,5 ml) in einem Acetatpuffer-Lösung (pH 5,8). Fügen Sie ein paar Tropfen einer Xylenolorangelösung Lösung und verfolgen die Farbänderung (gelb oder violette Farbe zeigt die Abwesenheit oder Anwesenheit von freiem Gd (III) -Ionen in Lösung, jeweils) ^11.

2. In - vitro - Charakterisierung der Dendrimere Produkte

1. Abschätzung der Anzahl von makrocyclischen DOTA-units mit dem PAMAM - Dendrimer (Beladung des Dendrimers mit DOTA-Makrocyclen wie)
   1. Schätzung mit ¹ H NMR (NMR - kernmagnetische Resonanzspektroskopie).
      Hinweis: Dieses Verfahren ist möglich , auf Dendrimere 5 und 6, aber nicht auf DCA.
      1. Notieren Sie die ¹ H - NMR - Spektrum ^12.
      2. Integrieren der aromatischen Region und die beiden getrennten aliphatischen Bereiche (1 Signale des aliphatischen Dendrimer und makrocyclischen Protonen, 2. Signale der t - Bu - Gruppen) oder eine aliphatische Region für Dendrimere 5 bzw. 6.
         Hinweis: Es gibt kein separates Signal in der aliphatischen Region von den t - Bu - Gruppen in Dendrimer 6 entstanden , da sie hydrolysiert worden sind.
      3. Verwenden Sie Gl. 1 oder Gl. 2 die Anzahl der makrocyclischen Einheiten (n) zu schätzen, wobei R das Verhältnis der Integrale = (aliphatisch / aromatisch in Eq. 1 oder aliphatisch-Dendrimer / aliphatisch- t- Bu in Gl. 2), H = _dende die Anzahl der Protonen in Dendrimer, = H _Ar die Anzahl an aromatischen Protonen, H _{t Bu} die Anzahl der Protonen in t - Bu - Gruppen und H _mac = die Anzahl der Protonen in einem Makrocyclus =.
         Hinweis: Entweder Gl. 1 oder Gl. 2 kann fo verwendet werdenr Dendrimer 5, während nur Gl. 1 kann für Dendrimer 6 verwendet werden. Da austauschbare Protonen (auf Amine, Amide, Thioharnstoffen oder Carboxylate) sind typischerweise mit Deuterium ersetzt sind, wurden sie in den Berechnungen nicht übernommen. Hier H _dende = 1,128 (5) oder 1000 (6), H _Ar = 4 und H _mac = 27 verwendet wurden.
         (1)
         (2)
   2. Schätzung aus der Elementaranalyse, indem das Verhältnis von Stickstoff zu Schwefel verwendet wird.
      1. Führen Sie die Elementaranalyse auf der festen dendrimeren Probe (DCA in dieser Arbeit).
      2. Verwenden Sie Gl. 3 die Anzahl an makrocyclischen Einheiten (n) zu schätzen, wobei R das Verhältnis der ermittelten% N und% S, N oder S _{dende dende} = = die Anzahl derStickstoff- oder Schwefelatome in dem Dendrimer und N _mac oder S _mac = die Anzahl von Stickstoff- oder Schwefelatome in einem makrocyclischen Einheit.
         Anmerkung: Der Faktor 2,29 wird aus dem Verhältnis in Atommassen von Schwefel und Stickstoff erhalten. In dieser Arbeit, N _dend = 250, S _dend = 2, N _mac = 5 und S _mac = 1 verwendet wurden.
         (3)
   3. Schätzung mit matrixunterstützter Laser-Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF).
      1. Führen Sie die MALDI-TOF - MS - Analyse ^13.
      2. Berechnen der Anzahl von makrocyclischen Einheiten (n) nach Gl. 4, wobei M _z = die beobachtete Masse (m / z), z = die Ladung der Spezies, M _dende = die Masse des dendrimeren seits und M _mac die Masse eines makrocyclischen Einheit =.
         NEINTE: M _dend = 14.306 und M _mac = 719 wurden in dieser Arbeit verwendet.
         (4)
2. Bestimmung der DCA - Konzentration ([DCA]): Bulk magnetische Suszeptibilität Messung (BMS)
   1. Auflösen DCA (5-10 mg) in Wasser (360 ul) in einem Kunststoffröhrchen Rohr ([DCA] ~ 5-10 mM).
      HINWEIS: [DCA] sollte im Bereich von 5 bis 10 mM sein , um eine mögliche Überlappung von t- BuOH Resonanzen bei Probenkonzentrationen> 15 mm, wobei die Resonanz von Wasser bei δ = 4,7 ppm.
   2. Werden 60 & mgr; l D ₂ O: t- BuOH - Mischung (2: 1 v / v) zu der wässrigen Lösung von DCA und Mischen der erhaltenen Lösung (420 & mgr; l) mit einem Vortex - Mischer.
   3. Transfer 400 ul der Probe in eine äußere Röhre NMR und legen eine koaxiale NMR Einsatzrohr mit einer t- BuOH: H ₂ O - Gemisch (10:90 v / v) in das Probenröhrchen.
   4. Aufzeichnendas ¹ H - NMR - Spektrum und Messen der Frequenzverschiebung zwischen Signalen Resonanz t- BuOH in den inneren und äußeren Röhren NMR (Referenz) ¹² abzuleiten.
   5. Verwenden Sie Gl. 5 die [DCA] zu bestimmen, wobei T die absolute Temperatur =, = Δχ die aufgezeichnete Verschiebung, & mgr; _eff = die effektive magnetische Moment für ein Lanthanidenion (μ _eff = 7,94 für Gd (III) ¹⁴ und s = eine abhängige Konstante von der Form der Probe und ihre Position im Magnetfeld (0, 1/3 und 1/6 in dem Fall einer Kugel, eines Zylinders parallel und Zylinder senkrecht zu dem Magnetfeld, respectively).
      HINWEIS: Der berechnete Wert für die [DCA] erhalten sollte aufgrund der Zugabe des D ₂ O auf die ursprüngliche Konzentration korrigiert werden: t- BuOH - Lösung (60 ul).
      (5)
3. Dynamisches LichtStreuung (DLS) Messungen.
   1. Bereiten Sie eine gefilterte DCA-Lösung (0,2 & mgr; m Polytetrafluorethylen / PTFE-Filter, 0,75 mM pro Gd ​​(III)) in 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) Puffer (25 mM, pH 7,4) und gibt sie in eine Küvette für die DLS-Messung.
   2. Setzen Sie die Küvette in die DLS Gerät und stellen Sie die folgenden Parameter: 5 Wiederholungen von 15 Scans (1 scan = 12 sec, Brechungsindex = 1,345, Absorption = 1%) ohne Verzögerungen zwischen den Scans und mit Temperaturausgleich 30 Sekunden vor der Aufnahme .
   3. Exportieren Sie die erfassten Daten und erhalten die Größenverteilung Histogramm Bevölkerung durch Auftragen (%) in Abhängigkeit von der Größe (hydrodynamischen Durchmesser).
4. Messung der longitudinalen und transversalen Relaxivitäten.
   HINWEIS: Ein ähnliches Verfahren wurde bereits beschrieben die Relaxationszeit Analysator ¹⁵ verwendet wird ; Dieses Verfahren wurde unter Verwendung eines 300 MHz NMR-Spektrometer mit Topspin durchgeführtSoftware.
   1. Einen Satz von DCA - Lösungen in H ₂ O: D ₂ O (500 & mgr; l, 10% D ₂ O in H ₂ O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 und 5,0 mM [HEPES ] = 25 mM) von der DCA Lager Probe (Abschnitt 2.2) zu sehen.
   2. Übertragen Sie 450 ul Lösung in einem NMR-Röhrchen und legen Sie sie in das Gerät.
   3. Optimieren Sie die Aufnahmeparameter (90 ° Anregungspulsdauer (p1) und Bestrahlung Frequenz - Offset (O ₁₎₎ und dann die T ₁ und T ₂ Experimente durchführen unter Verwendung der Inversion - Recovery (IR) und Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) Pulssequenzen, respectively.
   4. Bestimmung von T ₁ und T ₂ Relaxationszeiten.
      1. Wählen Sie die aufgezeichneten Mess, Prozess das 2D-Spektrum in der F2-Dimension, und führen Sie die interaktive Phasenkorrektur.
      2. Wählen Sie die entsprechende Scheibe (Peak mit einer maximalen Intensität) in der Analyse / T _{1 / T 2 Entspannung Fenster integrieren, und die Region zur Entspannung Modul exportieren.}
      3. Wählen Sie die entsprechende Anpassungsfunktion (invrec oder uxnmrt2 für IR und CPMG Experimente, beziehungsweise) die T ₁ oder T ₂ Relaxationszeiten zu erhalten.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 2.4.4.2-2.4.4.4 für alle verbleibenden [DCA] Lösungen.
   6. Berechnen Sie die Relaxationsgeschwindigkeit (R ₁ und R ₂₎ aus den erhaltenen T ₁ - Werte (R _1,2 = 1 / T _1,2).
   7. Plot R ₁ und R ₂ (s ^-1) in Abhängigkeit von Gd (III) Konzentration in mM.
   8. Bestimmung der longitudinalen und transversalen Relaxivitäten, r ₁ und r ₂ (mm ^-1 sec ^-1), aus der Steigung der angepassten Linie, wie durch Gl. 6 ist , wobei R _{i, obs} = der Längs (i = 1) oder quer (i = 2) diamagnetischen RelaxationsgeschwindigkeitWasser in der Abwesenheit von paramagnetischen Spezies und [Gd] = die Konzentration von Gd (III) in dem Experiment verwendet.
      (6)

3. In - vitro - MRT; Vergleich zwischen DCA und GdDOTA

1. Herstellung von Rohr Phantome
   1. Bereiten wäßriger Lösungen von DCA (4 x 350 ul) und GdDOTA (4 x 350 ul) sowie Wasserproben (4 x 350 ul) für zwei Sätze von Experimenten, bei denen die Konzentration der Kontrastmittel berechnet wird: (3.1.1.1) pro Gd ​​(III) oder (3.1.1.2) pro Molekül.
      1. Bereiten Sie zwei DCA Proben und zwei GdDOTA Proben mit Konzentrationen von 0,5 und 1,0 mM pro Gd ​​(III), respectively. Zusätzlich bereiten zwei Wasserproben (als Kontrollröhrchen).
      2. Bereiten zwei DCA Proben (2,5 und 5,0 mM pro Gd ​​(III) oder 0,05 und 0,1 mm pro Molekül dendrimeren), zwei GdDOTA Proben (0,25, 0,5 mM) und zwei Wasserproben (control Röhren).
         HINWEIS: Die entsprechenden DCA und GdDOTA Konzentrationen sollten durch Verdünnen der jeweiligen Aktien Proben mit Konzentrationen über den BMS-Methode bestimmt, hergestellt werden mit HEPES-Puffer (pH 7,4) (siehe Abschnitt 2.2). Um die Berechnungen zu vereinfachen, n = 50 wurde für die durchschnittliche Anzahl von makrocyclischen Einheiten pro Dendrimermolekül angenommen. Daher ist das Verhältnis von DCA: GdDOTA war 1: 5, berechnet auf einer Basis pro Molekül.
   2. Platzieren Sie die Proben in 300 & mgr; l-Kunststoffröhrchen Röhrchen, das Vorhandensein von Luftblasen in der Lösung vermieden wird.
      HINWEIS: Die Größe der Kunststoffröhrchen Rohre hängt von der Art und der Größe der Hochfrequenzspule verwendet wird (hier wird ein Beispiel mit der Volumenspule gegeben ist).
   3. Legen Sie die Proben in einer Spritze (60 ml Volumen), füllen Sie es mit 1 mM GdDOTA Lösung, und legen Sie sie in den Scanner.
      HINWEIS: Die Proben wurden in der wässrigen Lösung des GdDOTA platziert Suszeptibilitätseffekte (Variationen im Magnetfeld s vermeidentrength, die in der Nähe von Schnittstellen zwischen Substanzen unterschiedlicher magnetischer Suszeptibilität auftreten).
2. Parameteroptimierung und Bildgebung.
   1. Verwenden Sie den anatomischen Scan (Localizer / TriPilot) die Spritze mit den Proben im Isozentrum des Magneten zu positionieren.
   2. Drücken Sie die Ampel (Einstellung Scan) durchzuführen Anpassungen für Shim (Anpassung der Magnetfeldhomogenität) des gesamten Volumens, die Mittenfrequenz (O _1), die Empfängerverstärkung (RG) und die Sendeverstärkung (TX0 und TX1).
   3. Für T ₁ -gewichteten (T _1W) Bildgebung, wählen Sie den schnellen low angle shot (FLASH) Methode.
   4. Wählen Sie koronare Schicht für die Proben vertikal angeordnet (Spritze horizontal) in der Scanner den Localizer-Scan verwenden.
   5. Verwenden Sie Gl. 7 für die Optimierung des Kontrastes-Rausch (CNR) Erfassungsparameter ^16, wobei α = der Flipwinkel, TE die Echozeit =, TR =die Wiederholungszeit, und T _{1, A,} T _{1, B} T ₁ mal der Probe A (T _{1, A)} und Probe B (T _{1, B)} , für die = sollte das CNR maximiert werden (das gleiche gilt für T ₂ mal: T _{2, A} und T _{2, B).}
      HINWEIS: T ₁ und T ₂ Relaxationszeiten sollte aus den Messungen der Längs- und Quer Relaxivität (Abschnitt 2.4), während TE, TR, und α sollte von der CNR Optimierungsberechnung erhalten werden , erhalten auf Werte eingestellt werden.
      (7)
   6. Erwerben Sie das Bild mithilfe der im vorherigen Schritt erhaltenen Parameter (3.2.5).
   7. Berechnen des Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR).
      1. Laden Sie die erworbenen T _1w Bild (Scan) in die Bildanzeige und VerarbeitungFenster, und klicken Sie auf Region of Interest (ROI) zu definieren.
      2. Wählen Sie einen kreisförmigen ROI und es an der Probenposition und Hintergrund zeichnen. Anschließend klicken Sie auf dem Display die durchschnittliche Signalamplitude (S - _Signal) und Standardabweichung des Hintergrunds (S _Rauschen) zu erhalten.
      3. Wiederholen Sie Schritt 3.2.7.2 für die DCA, GdDOTA und Wasserproben.
      4. Berechnen Sie die SNR unter Verwendung der Formel: SNR = _Signal S / S _Rauschen.
   8. Nach einem leicht modifizierten Verfahren, führen T ₂ -gewichteten (T _2W) Bildgebung die schnelle Erfassung mit Relaxationserhöhung (RARE) Methode verwendet wird . Zur Optimierung der CNR Erfassungsparameter verwenden Gl. 8.
      (8)

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Ergebnisse

Die Herstellung von DCA bestand aus zwei Stufen: 1) Synthese des monomeren DOTA-Typ - Chelator (Abbildung 1) und 2) Kopplung des Chelators mit dem G4 PAMAM Dendrimer und anschließende Herstellung der dendrimeren Gd (III) -Komplex (Figur 2) . In der ersten Stufe wird ein cyclen Basis DOTA-Typ Chelator vier Carbonsäuren und eine orthogonale Gruppe geeignet für die weitere synthetische Modifikationen enthielt, wurde hergestellt. Die Hers...

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Diskussion

Herstellung der dendrimeren MRI Kontrastmittels erfordert eine geeignete Auswahl der monomeren Einheit (dh der Chelator für Gd (III)). Sie reduzieren die Toxizität dieses paramagnetischen Ion und bis heute eine große Auswahl an azyklisch und makrocyclischen Chelatbildnern diesem Zweck dienen ^1-3. Unter diesen makrocyclischen DOTA-Typ - Chelatoren besitzen die höchste Stabilität thermodynamischen und kinetischen Inertheit und damit sind die bevorzugte Wahl zur Herstellung von inerten MRI - Kontra...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclen	CheMatech	C002
tert-Butyl bromoacetate	Alfa Aesar	A14917
N,N-Dimethylformamide	Fluka	40248
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid	Aldrich	335339
Thionyl chloride	Acros Organics	382662500	Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine	Acros Organics	402841000	Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled
Diethyl ether	any source
Sodium sulphate	Acros Organics	196640010
Chloroform	VWR Chemicals	22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate	Aldrich	364789	Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate	Acros Organics	174560250	48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate	Acros Organics	424270010
Ethyl-acetate	any source		For column chromatography
n-Hexane	any source		For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus	Büchi		Model type: Glass oven B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
Methanol	any source		For column chromatography
Dichloromethane	any source		For column chromatography
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
Ammonia	Acros Organics	428381000	7 N Solution in Methanol
Palladium	Aldrich	643181	15% wet
Hydrogenation apparatus PARR	PARR Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
Sintered glass funnel	any source
Thiophosgen	Aldrich	115150	Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine	Alfa Aesar	A12646
Dichloromethane	Acros Organics	348460010	Extra dry
Magnetic stirrer	any source
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
Thin-layer chromatography plates	Merck Millipore	1.05554.0001
Formic acid	VWR Chemicals	20318.297
Lophylizer	any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate	Aldrich	G7532
Sodium hydroxide	Acros Organics	134070010
pH meter	any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Aldrich	E5134
Mass spectrometer (ESI)	Agilent		Ion trap SL 1100
Acetate buffer	any source		pH 5.8
Xylenol orange	Aldrich	52097	20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge	any source
NMR spectrometer	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Version 2.1
Combustion analysis instrument	EuroVector SpA		EuroEA 3000 Elemental Analyser
MALDI-ToF MS instrument	Applied Biosystems		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-Butyl alcohol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Vortex mixer	any source
Norell NMR tubes	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR coaxial tube	Deutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS instrument	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
Plastic tube vials	any source
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI scanner	Bruker		BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil	Bruker		Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software)	Bruker		Version 5.1