Técnica ratón Microcirugía de infusión para Targeted Sustancia de entrega en el SNC<i&gt; vía</i&gt; La arteria carótida interna

Resumen

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Resumen

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Introducción

En modelos in vivo del sistema nervioso central (SNC) requieren un suministro eficaz de sustancias exógenas, tales como medicamentos, agentes patógenos, o exosomas, en el cerebro. Por lo tanto, un método de entrega ideal debe causar un trauma mínimo para el animal, preservar la integridad de la red neuronal, y alcanzar altas concentraciones de sustancia en el cerebro ^1.

Se han descrito varios métodos quirúrgicos de entrega sustancia local, incluyendo intra-vaina, intracerebral, y las inyecciones intraventriculares o implantes ^{2, 3, 4, 5.} Estos enfoques, sin embargo, se consideran traumática en el sistema nervioso central, y permiten la administración de sólo volúmenes bajos de la sustancia de interés. Por otra parte, se ha sugerido que las sustancias exógenas pueden eliminarse rápidamente por el líquido cefalorraquídeo ⁶ , y una gama baja penetración en el parénquima cerebral se ha observado ⁷ cuando se emplean las técnicas antes mencionadas. Métodos de administración sistémicas, tales como administración oral, pulmonar, subcutánea, intravenosa, y se utilizan más comúnmente en modelos animales, a pesar de que exhiben una baja eficacia en la entrega de las sustancias en el sistema nervioso central, debido a la absorción por otros órganos ^{8, 9.} Por lo tanto, estas vías de administración requieren dosis elevadas de las sustancias administradas, aumentando el riesgo de efectos secundarios y toxicidad ^{10, 11.}

A continuación, describimos una técnica de microcirugía infusión de ratón, que permite suministrar sustancias directamente en el cerebro a través de la arteria carótida interna. Además de dirigirse a la entrega al sistema nervioso central, esta técnica no pasa por alto las barreras fisiológicas normales y por lo tanto es de gran importancia para biological procesos involucrados en los pasajes de la terapéutica o patógenos en el cerebro.

Protocolo

Los procedimientos involucrados en el siguiente protocolo han sido aprobados por la Universidad de Miami Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). Además, todos los procedimientos se llevan a cabo en las instalaciones aprobadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC).

1. Preparación de los ratones para la cirugía

1. Anestesiar al ratón con isoflurano mezclado con oxígeno, utilizando un sistema de anestesia de laboratorio. Utilice isoflurano a establecer entre 4-5% y el flujo de oxígeno a 2 L / min en la máquina comercial (Ver Tabla de Materiales). Transferir el animal a la superficie de la cirugía, bajo un microscopio estereoscópico, y mantener la anestesia utilizando un cono de morro (utilizar la configuración 1.5 isoflurano - 2,5 y el oxígeno en el flujo de 2 L / min).
   1. Asegúrese de que la frecuencia respiratoria del ratón es de alrededor de 1 - 2 respiración / seg sin jadear. Además, asegúrese de que el animal no presenta reacción estimulación barbas y el pedal reflex (dedo del pie pellizco). Controlar la frecuencia y el esfuerzo de respiración durante la cirugía, por lo menos cada 5 minutos. Siga específica Institucional Cuidado de Animales y el empleo y las directrices veterinarios para el control de roedores anestesia.
2. Aplicar una gota de lubricante oftálmica en cada ojo utilizando un hisopo estéril con el fin de evitar la sequedad. Se recomienda la administración de anti-inflamatorio y analgésico para aliviar el malestar.
3. Con el animal tumbado sobre su espalda, mantener la anestesia utilizando un cono de nariz.
4. Limpiar la zona del cuello del animal limpiando la zona tres veces con etanol 70% y clorhexidina. Afeitarse el área de la cirugía del animal usando una navaja de afeitar (que se detallan a continuación).

2. La disección de la arteria carótida común (CCA)

1. Realizar todo el procedimiento de microcirugía bajo un microscopio estereoscópico. Con unas tijeras quirúrgicas y las pinzas realizar una incisión en la línea media de poca profundidad en el cuello, por encima del esternón hasta por debajo de tél mordaza (alrededor de 3 a 4 cm).
2. El uso de pinzas graso cuidadosamente separado y el tejido conectivo para exponer la tráquea.
3. Coloque una almohada (objeto redondo, alrededor de 0,5 cm de diámetro) en la parte posterior del cuello del ratón para extender el cuello, exponiendo aún más el área.
4. Separar el tejido usando un retractor de tejidos o ganchos.
5. En el lado izquierdo del animal de la tráquea, pinzas cuidadosamente con el tejido conectivo para exponer la CCA izquierda.
6. Utilizando unas pinzas eliminan cuidadosamente todo el tejido conectivo para exponer la bifurcación CCA, y el comienzo de ambas arterias carótidas externa e interna.

3. Preparación de la CCA para la infusión de sustancias

1. Inserte dos segmentos de sutura de nylon (aproximadamente 1 cm cada uno) en virtud de la arteria carótida externa (ACE), el uso de fórceps.
2. Coloque un nudo permanente en el punto más alto posible de la ECA.
3. En el punto más bajo posible de la ECA, inmediatamente por encima de la bifurcación de la ACC, lugarun nudo extraíble. Este nudo debe estar floja en comparación con el nudo superior.
4. Cierre la CCA utilizando una grapa de vaso, en el punto más bajo posible.
5. Cierre la arteria carótida interna (ACI) utilizando una grapa de vaso.
6. Utilizando tijeras de primavera de microdisección realizar un pequeño corte en el ECA (aproximadamente 2 mm), entre los dos nudos.

4. La infusión de sustancias a través de la ACI

1. Montar un sistema de infusión. Adjuntar 6 pulgadas de tubo capilar (dimensiones ideales: 2,5 mm x 1,2 mm) a una jeringa de tuberculina que contiene 250 l de la sustancia a infundir (fármacos, agentes patógenos, vesículas extracelulares, entre otros) e inserte la punta capilar suavemente en la incisión realizada en el paso 3.6.
2. Continuar a deslizarse por el capilar hasta que alcanza un punto medio entre la bifurcación y el clip de cierre de la CCA.
3. Atar el nudo CEPA inferior. Compruebe que el nudo es suficiente para permitir la fluidez capilar suelto y lo suficientemente apretado para evitar leakingramo.
4. Retire el clip de la ACI.
5. aplicar una suave presión a la infusión de sustancias permitiendo émbolo de la jeringa en aproximadamente 10 l por segundo.

5. Procedimientos después de la infusión

1. Coloque el clip de nuevo en el ICA.
2. Retire con cuidado el tubo capilar.
3. Atar el nudo CEPA inferior por completo.
4. Retire los clips de la ACI y el CCA.

6. Cierre la incisión y el cuidado post-operatorio

1. Retire retractor de tejido o ganchos y almohada.
2. área de sutura limpia usando una solución salina estéril.
3. Cerrar la incisión utilizando nylon sutura / aguja y pinzas.
4. Administrar anti-inflamatorio y analgésico para aliviar el malestar post-operatorio.
5. Lugar de los animales en la jaula colocada en la pista de calentamiento durante al menos 1 hora y la recuperación del monitor.

Resultados

La técnica de microcirugía infusión de ratón descrito aquí es muy versátil y se ha utilizado para suministrar diferentes sustancias directamente en el cerebro, incluyendo la entrega de células tumorales en un modelo representativo de la formación de metástasis cerebral ^{1, 12.}

Esta técnica también es adecuado para evaluar los aspectos patológicos de diferent...

Discusión

La microcirugía de infusión descrito aquí se ha demostrado ser muy exitoso en la entrega de sustancias exógenas de diversas características biológicas en el SNC, la prevención de la difusión no deseada a través del cuerpo ^{1, 12.} La interrupción de la barrera sangre-cerebro es una característica patológica de diversas enfermedades relacionadas con el SNC; por lo tanto, la evaluación de la relación de sustancias exógenas con la barrera sangre-cerebr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia instrument	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine Science Tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine Science Tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine Science Tool	00109-11
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-08
Nylon suture	Braintree Scientific	SUT-S 104
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherScientific	50-121-8005