Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC<i&gt; via</i&gt; Artéria carótida interna

Resumo

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Resumo

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Introdução

Em modelos in vivo do sistema nervoso central (SNC) doenças requerem uma entrega eficaz de substâncias exógenas, tais como drogas, agentes patogénicos, ou exossomas, para o cérebro. Por isso, um método de entrega ideal deve causar o mínimo de trauma para o animal, preservar a integridade da rede neuronal, e alcançar concentrações elevadas de substâncias no cérebro ^1.

Vários métodos cirúrgicos de distribuição de substâncias locais foram descritos, incluindo intra-bainha, intracerebral, e as injeções intraventricular ou implantes ^{2, 3, 4, 5.} Estas abordagens, no entanto, são consideradas traumática do sistema nervoso central, e permitir a administração de apenas baixos volumes de a substância de interesse. Além disso, tem sido sugerido que as substâncias exógenas podem ser rapidamente removidos pelo fluido cerebrospinal ⁶ , e uma gama baixa de penetração para o parênquima cerebral foi observada ⁷ quando as técnicas acima mencionadas são empregues. Métodos de entrega sistêmicas, tais como oral, pulmonar, subcutânea e intravenosa, são mais comumente usados em modelos animais, embora eles apresentam baixa eficácia na entrega das substâncias para o SNC, devido à absorção por outros órgãos ^{8, 9.} Portanto, estas vias de administração requerem doses elevadas de substâncias administradas, aumentando o risco de efeitos colaterais e toxicidade ^{10, 11.}

Aqui, descrevemos uma técnica de microcirurgia infusão do mouse, o que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna. Além de direccionamento da entrega ao CNS, esta técnica não ultrapassar barreiras fisiológicas normais e é portanto altamente relevantes para biological processos envolvidos nas passagens de agentes terapêuticos ou agentes patogénicos para o cérebro.

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Protocolo

Os procedimentos envolvidos no protocolo seguinte foram aprovados pela Universidade de Miami Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). Além disso, todos os procedimentos estão sendo realizados em instalações aprovadas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório de Animal Care International (AAALAC).

1. Preparação de Ratos para Cirurgia

1. Anestesiar rato com isoflurano misturado com o oxigênio, usando um sistema de anestesia laboratório. Use isoflurano na definição entre 4-5% e fluxo de oxigênio a 2 L / min na máquina comercial (Veja a Tabela de Materiais). Transferir o animal para a superfície da cirurgia, sob um microscópio estereoscópico, e manter a anestesia utilizando um cone de nariz (1.5 usar uma configuração de isoflurano - 2,5 e de oxigénio no fluxo de 2 L / min).
   1. Certifique-se de que a taxa respiratória do rato é de cerca de 1-2 respiração / seg sem ofegante. Além disso, garantir que o animal não apresenta reação estimulação bigodes e pedal reFlex (toe pitada). Monitorar a taxa de respiração e esforço durante a cirurgia, pelo menos a cada 5 min. Siga específica Animal Care Institucional e Comitê de Uso e diretrizes veterinários para monitorar anestesia roedor.
2. Aplicar uma gota de lubrificante oftálmica em cada olho utilizando uma zaragatoa estéril, a fim de evitar a secura. A administração de anti-inflamatório e analgésico para aliviar o desconforto é recomendado.
3. Com o animal deitado de costas, manter a anestesia utilizando um cone de nariz.
4. Limpar a área do pescoço do animal, limpando a área três vezes com etanol a 70% e cloro-hexidina. Shave área de cirurgia do animal usando uma lâmina de barbear (detalhada abaixo).

2. A dissecção da artéria carótida comum (CCA)

1. Execute o procedimento de microcirurgia inteira sob um microscópio estereoscópico. Utilizando uma tesoura cirúrgica e fórceps executar uma incisão na linha média raso no pescoço, a partir de cima do esterno até abaixo tele maxila (cerca de 3 a 4 cm).
2. Utilizando uma pinça gordos cuidadosamente separado e tecido conjuntivo para expor a traqueia.
3. Coloque um travesseiro (objeto redondo, cerca de 0,5 cm de diâmetro) na parte de trás do pescoço do rato para estender o pescoço, expondo ainda mais a área.
4. Separa-se o tecido utilizando um afastador de tecido ou ganchos.
5. No lado esquerdo do animal, da traqueia, cuidadosamente pinça para além do tecido conjuntivo para expor a CCA esquerda.
6. Usando fórceps cuidadosamente remover todo o tecido conjuntivo para expor a bifurcação CCA, e o início de ambas as artérias carótidas interna e externa.

3. Preparação do CCA para perfusão Substância

1. Insira dois segmentos de fio de náilon (cerca de 1 cm cada) sob artéria carótida externa (ECA), usando uma pinça.
2. Coloque um nó permanente no ponto mais alto possível da ECA.
3. No ponto mais baixo possível da ECA, imediatamente acima da bifurcação CCA, lugarum nó removível. Este nó deve ser solto em comparação com o nó superior.
4. Feche a CCA usando um clipe de embarcação, no ponto mais baixo possível.
5. Fechar a artéria carótida interna (ICA), utilizando um grampo navio.
6. Usando microdissecção mola tesoura realizar um pequeno corte no ECA (cerca de 2 mm), entre os dois nós.

4. Infusion Substância via ICA

1. Montar um sistema de infusão. Anexar 6 polegadas de tubulação capilar (dimensões ideais: 2,5 mm x 1,2 mm) para uma seringa de tuberculina contendo 250 ml da substância a ser infundido (drogas, patógenos, vesículas extracelulares, entre outros) e insira a ponta capilar suavemente para dentro da incisão realizada no passo 3.6.
2. Continue a deslizar para baixo o tubo capilar até atingir um ponto médio entre a bifurcação e o grampo de fecho do CCA.
3. Amarrar o nó ECA inferior. Verifique se o nó está solto o suficiente para permitir a fluidez capilar e apertado o suficiente para evitar leaking.
4. Remover clipe do ICA.
5. Gentilmente aplicar pressão para a substância pistão seringa permitindo a infusão de cerca de 10 l por segundo.

5. Procedimentos após a infusão

1. Coloque o clipe de volta no ICA.
2. Remova cuidadosamente o tubo capilar.
3. Amarrar o nó ECA inferior completamente.
4. Remova clipes do ICA e do CCA.

6. Incisão Encerramento e cuidados pós-operatórios

1. Remover afastador ou tecido ganchos e travesseiro.
2. área de sutura limpa utilizando solução salina estéril.
3. Fechar a incisão usando nylon sutura / agulha e fórceps.
4. Administrar anti-inflamatória e analgésica para aliviar o desconforto pós-operatório.
5. Coloque o animal na gaiola colocada na almofada de aquecimento durante pelo menos 1 h e recuperação do monitor.

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Resultados

A técnica de microcirurgia infusão rato aqui descrito é muito versátil e tem sido usado para fornecer substâncias diferentes diretamente no cérebro, incluindo a entrega de células de tumor em um modelo representativo da formação de metástases cerebrais ^{1, 12.}

Esta técnica também é adequado para avaliar os aspectos patológicos de diferentes agentes patogé...

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Discussão

A microcirurgia infusão descrito aqui tem provado ser muito bem sucedida no fornecimento de substâncias exógenas de vários recursos biológicos para o SNC, impedindo a divulgação indesejada por todo o corpo ^{1, 12.} O rompimento da barreira sangue-cérebro é uma característica patológica de várias doenças relacionadas com o SNC; Por conseguinte, a avaliação da relação de substâncias exógenas com a barreira hemato-encefálica é de grande importân...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia instrument	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine Science Tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine Science Tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine Science Tool	00109-11
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-08
Nylon suture	Braintree Scientific	SUT-S 104
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherScientific	50-121-8005