Mouse микрохирургии Настой Техника для Targeted вещества Доставка в ЦНС<i&gt; с помощью</i&gt; Артерию внутренней сонной

Резюме

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Аннотация

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Введение

В естественных условиях модели центральной нервной системы (ЦНС) , заболевания требуют эффективной доставки экзогенных веществ, таких как наркотики, патогенных микроорганизмов, или экзосомы, в мозг. Следовательно, идеальный способ доставки должен вызывать минимальную травму животному, сохранить целостность нейронной сети, и достигать высоких концентраций веществ в головном мозге ^1.

Несколько хирургических методов локальной доставки действующего вещества были описаны, в том числе внутри-оболочки, внутрицеребральная, внутрижелудочкового инъекций или имплантатов ^{2, 3, 4, 5.} Эти подходы, однако, считаются травматическое в ЦНС, и позволить введение только низких объемов вещества, представляющего интерес. Кроме того, было высказано предположение , что экзогенные вещества могут быть быстро удалены спинно - мозговой жидкости ⁶ , и низкий диапазон проникновения в паренхиме головного мозга наблюдалась ⁷ , когда вышеуказанные методы используются. Системные методы доставки, такие как пероральный, легочный, подкожного и внутривенного путей, чаще используются в моделях на животных, хотя они демонстрируют низкую эффективность в доставке веществ в ЦНС, благодаря поглощению другими органами ^{8, 9.} Таким образом, эти маршруты поставки требуют повышенных доз на администрируемых веществ, увеличивая риск побочных эффектов и токсичности ^{10, 11.}

Здесь мы опишем метод микрохирургии мыши настой, который эффективно доставляет вещества непосредственно в мозг через внутреннюю сонную артерию. В дополнение к ориентации на доставку в ЦНС, этот метод не обходит нормальные физиологические барьеры и поэтому весьма актуальным для Биологическийл процессы, участвующие в проходах терапевтических средств или патогенов в мозг.

протокол

Процедуры, участвующие в следующем протоколе были одобрены в Университете Майами Institutional уходу и использованию животных комитета (IACUC). Кроме того, все процедуры проводятся в учреждениях, утвержденных Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных Care International (AAALAC).

1. Подготовка мышей для хирургии

1. Обезболить мышь с изофлуран в смеси с кислородом, с использованием лабораторной системы анестезии. Используйте изофлуран при установке между 4-5% и расход кислорода при 2 л / мин на коммерческой машине (см Материалы таблицу). Передача животное на поверхность хирургии, под стереомикроскопа, и поддерживать анестезии с помощью носовой конус (используйте настройку 1,5 изофлуран - 2,5 и кислорода поток со скоростью 2 л / мин).
   1. Убедитесь в том, что частота дыхания мыши составляет около 1 - 2 дыхания / сек без задыхаться. Кроме того, убедитесь, что животное не проявляет усов реакции стимуляции и педали гeflex (носок щепотку). Монитор частоты дыхания и сил во время операции, по крайней мере , каждые 5 мин. Следуйте конкретным институциональным уходу и использованию животных комитета и ветеринарные руководящие принципы для мониторинга грызун анестезии.
2. Нанесите каплю глазной смазки на каждый глаз, используя стерильный тампон, чтобы предотвратить сухость кожи. Администрация противовоспалительного и обезболивающего, чтобы облегчить дискомфорт рекомендуется.
3. С животное, лежа на спине, поддержания анестезии с помощью носовой конус.
4. Очистите область шеи животного, протерев площадь в три раза с этанолом 70% и хлоргексидин. Бритье область хирургии животного с помощью бритвы (подробно изложено ниже).

2. Рассечение общей сонной артерии (ССА)

1. Выполните всю процедуру микрохирургии под стереомикроскопа. Используя хирургические ножницы и пинцет выполняют неглубокую срединный разрез в области шеи, сверху грудины до уровня ниже тон челюсти (примерно от 3 до 4 см).
2. Использование щипцов тщательно отдельной жирной и соединительной ткани подвергать трахеи.
3. Поместите подушку (круглый предмет, около 0,5 см в диаметре) на задней части шеи мыши, чтобы продлить шеи, далее подвергая область.
4. Отделить ткани, используя либо механизм втягивания ткани или крючки.
5. На левой стороне животного трахеи, тщательно выщипывать друг от друга соединительной ткани, чтобы выставить левую CCA.
6. Использование щипцов тщательно удалить все соединительные ткани, чтобы разоблачить развилки CCA, и начало как внешних, так и внутренних сонных артерий.

3. Подготовка ОАС для вещества Infusion

1. Вставьте два сегмента нейлоновой нити (около 1 см каждая) под наружной сонной артерии (ЭКА), с помощью пинцета.
2. Поместите постоянный узел на самом высоком ЕКСХ точки.
3. В самой нижней точке возможного ЕКСХ, непосредственно над бифуркацией ОСА, местосъемный узел. Этот узел должен быть свободным по сравнению с верхним узлом.
4. Закройте CCA с помощью клипа судна, по самой низкой возможной точки.
5. Закройте внутренней сонной артерии (ВСА), используя зажим судна.
6. Использование микродиссекция пружинные ножницы выполняют небольшой разрез в ECA (около 2 мм), между этими двумя узлами.

4. Вещество Настой через ICA

1. Собрать систему для инфузии. Приложить 6 дюймов капиллярной трубки (идеальные размеры: 2,5 мм х 1,2 мм) к туберкулину шприц, содержащий 250 мкл вещества, подлежащего инфузии (наркотики, патогены, внеклеточные везикулы, среди других) и вставьте кончик капилляра осторожно в разрез выполняется на шаге 3.6.
2. Продолжайте скользить вниз капилляр, пока он не достигнет средней точки между бифуркацией и зажимом закрытия ОАС.
3. Свяжите вниз нижний ECA узел. Убедитесь в том, что узел достаточно, чтобы позволить капиллярную текучестью свободно и достаточно плотно, чтобы предотвратить leakinг.
4. Удалить клип из ВСА.
5. Осторожно надавливайте на поршень шприца, позволяющего вещества инфузии приблизительно 10 мкл в секунду.

5. Процедуры после инфузии

1. Поместите клип обратно на ВСА.
2. Осторожно удалите капиллярной трубки.
3. Свяжите вниз нижний ECA узел полностью.
4. Удалить клипы из ВСА и ОСА.

6. Разрез Закрытие и послеоперационный уход

1. Удалите втягивающего устройства или ткани крючки и подушку.
2. Очистить поверхность шва с помощью стерильного физиологического раствора.
3. Закрыть разрез с помощью нейлоновой шовный / иглы и пинцета.
4. Администрирование противовоспалительное и обезболивающее, чтобы облегчить послеоперационный дискомфорт.
5. Поместите животное в клетке, размещенной на грелку в течение по крайней мере 1 ч и восстановление монитора.

Результаты

Техника микрохирургии мышь вливание описанный здесь очень универсальна и используется для доставки различных веществ непосредственно в мозг, в том числе доставку опухолевых клеток в репрезентативной модели формирования метастаз головного мозга ^1,

Обсуждение

Описанный здесь настой микрохирургии было доказано быть очень успешным в доставке экзогенных веществ различных биологических особенностей в ЦНС, предотвращая нежелательное распространение по всему телу ^{1, 12.} Срыв гематоэнцефалического барьера являет?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia instrument	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine Science Tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine Science Tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine Science Tool	00109-11
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-08
Nylon suture	Braintree Scientific	SUT-S 104
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherScientific	50-121-8005