CNS içine Hedeflenen Madde Teslimat için Fare Mikrocerrahi İnfüzyon Tekniği<i&gt; yoluyla</i&gt; İç Karotis Arter

Özet

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Özet

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Giriş

Merkezi sinir sisteminin in vivo modellerde (CNS) hastalıkları, beyin bu tür ilaçlar, patojenlerin veya eksozom gibi eksojen madde, etkili bir teslim gerektirir. Bu nedenle, ideal bir dağıtım yöntemi, hayvana en az travmaya neden nöronal ağ bütünlüğünü korumak ve beyin ¹ yüksek madde konsantrasyonları elde etmelidir.

Yerel madde sağlama çeşitli cerrahi yöntem içi kılıf, intraserebral, intraventriküler enjeksiyonlar veya ^{implantlar, 2, 3, 4, 5} de dahil olmak üzere tarif edilmiştir. Bu yaklaşımlar, ancak, CNS travmatik kabul ve ilgi maddenin sadece düşük hacimli yönetimine izin vardır. Ayrıca, dış kaynaklı maddelerin hızlı bir şekilde beyin omurilik sıvısı ⁶ çıkarılabilir ileri sürülmüştür , ve yukarıda belirtilen teknikler kullanıldığı zaman beyin parankiması için düşük penetrasyon aralığı ⁷ gözlenmiştir. Bunlar merkezi sinir sistemine maddeleri sunan düşük etkinliği sergileyen ancak örneğin oral, akciğer, deri altı ve damar içi yollar gibi sistemik uygulama yöntemleri, daha yaygın olarak diğer organlarda ^{8, 9} alımı nedeniyle, hayvan modelleri kullanılmaktadır. Bu nedenle, teslimat bu rotalar yan etki ve toksisite ^{10, 11} riskini artıran, yönetilen maddelerin yüksek dozda gerektirir.

Burada, etkili doğrudan internal karotid arter yoluyla beyine maddeleri sağlayan bir fare infüzyon mikrocerrahi tekniği, açıklar. CNS teslimat hedeflemenin yanı sıra, bu teknik, normal fizyolojik engelleri aşmak ve bu nedenle biologica son derece alakalı değilbeyne terapötik veya patojenlerin pasajlar yer l süreçleri.

Protokol

Aşağıdaki protokolde yer alan işlemler Miami Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Buna ek olarak, tüm işlemler laboratuvar Animal Care International Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından onaylanan tesislerinde yürütülmektedir.

Cerrahi Farelerin 1. Hazırlık

1. Bir laboratuvar anestezi sistemi kullanılarak, oksijen ile karışık izofluran ile fare anestezisi. 2 L% ve oksijen akışı 4-5 arasında ayarında izofluran kullanın / ticari makinede dak (Malzeme Tablosu bakınız). Bir stereomikroskop altında, cerrahi yüzeyine hayvan aktarın ve bir burun konisi kullanılarak anestezi sürdürmek (- 2 L / dk 2.5 ve oksijen akışını 1.5 ayarını izofluran kullanın).
   1. nefes nefese kalmadan 2 solunum / sn - fare solunum hızı 1 civarında olduğundan emin olun. Buna ek olarak, hayvan bıyık stimülasyon reaksiyonu ve pedal r sergilemez sağlamakeflex (ayak tutam). Ameliyat sırasında en az her 5 dk solunum hızı ve çaba izleyin. Kemirgen anestezi izlenmesi için özel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve veteriner kurallara uyun.
2. kuruluğunu önlemek amacıyla steril bir bez kullanılarak her bir göze göz kayganlaştırıcı bir damla uygulayın. anti-enflamatuar ve rahatsızlığı azaltmak için analjezik uygulanması tavsiye edilir.
3. Hayvan sırtında yatarken ile bir burun konisi kullanılarak anestezi korumak.
4. parkı etanol% 70 ve klorheksidin ile üç kez silerek hayvanın boyun bölgesini temizleyin. (Aşağıda ayrıntılı) bir jilet kullanarak hayvanın ameliyat alanını tıraş.

Ortak Karotis Arter 2. Diseksiyon (CCA)

1. Bir stereomikroskop altında tüm mikrocerrahi prosedürü uygulayın. Cerrahi makas kullanarak ve forseps göğüs yukarıdan t altına, boyun sığ bir ensizyon gerçekleştirinO (yaklaşık 3 ila 4 cm) çene.
2. Forseps dikkatle ayrı yağlı ve bağ dokusu kullanılarak trakea ortaya çıkarmak.
3. bölgeyi daha fazla açığa boyun uzatmak için farenin ensesine bir yastık (yuvarlak nesneyi, çapı yaklaşık 0.5 cm) yerleştirin.
4. Bir doku retraktörü veya kanca kullanarak doku ayırın.
5. trakea hayvanın sol tarafında dikkatle sol CCA maruz bağ dokusu ayrı tweeze.
6. Forseps dikkatle CCA çatallanma ortaya çıkarmak için tüm bağ dokusu, hem dış ve iç karotid arterlerin başlangıcını kaldırın.

Madde İnfüzyon için CCA 3. hazırlanması

1. forseps kullanarak, eksternal karotid arter altında naylon sütür (yaklaşık 1 cm her) iki kesimleri (ECA) yerleştirin.
2. ECA mümkün olan en yüksek noktasında kalıcı bir düğüm yerleştirin.
3. ECA mümkün olan en düşük noktası, hemen CCA çatallanma üzerinde yer atçıkarılabilir düğüm. Bu düğüm, üst düğüm kıyasla gevşek olmalıdır.
4. mümkün olan en düşük noktada, bir gemi klibi kullanarak CCA kapatın.
5. Bir gemi klibi kullanarak internal karotis arter (ICA) kapatın.
6. Kullanılarak mikrodisseksiyon yaylı makas, iki düğüm arasındaki ECA (yaklaşık 2 mm) küçük bir kesim yapmak.

ICA aracılığıyla 4. Madde İnfüzyon

1. bir infüzyon sistemi monte edin. Kılcal boru (6 inç doğru boyutları: 2.5 mm x 1.2 mm) takın maddenin 250 ul ihtiva eden bir tüberkülin şırıngaya (ilaçlar, patojenler, diğerleri arasında hücre dışı veziküller) aşılanmış ve yapılan kesi içine yavaşça kılcal ucu eklemek için adım 3.6.
2. o çatallanma ve CCA kapanış klibi arasında bir orta nokta ulaşıncaya kadar kılcal aşağı kaydırmaya devam edin.
3. Alt ECA düğüm aşağı kravat. düğüm kılcal akışkanlığını sağlayacak kadar gevşek ve Leakin önlemek için yeterince sıkı olduğundan emin olunörn.
4. ICA klipsi çıkartın.
5. Yavaşça şırınga pistonu sağlayan madde infüzyon saniyede yaklaşık 10 ul baskı uygulamak.

5. Mesaj İnfüzyon Prosedürleri

1. Yeri ICA geri klibi.
2. Yavaşça kılcal boru kaldırın.
3. tamamen alt ECA düğüm aşağı kravat.
4. ICA ve CCA klipleri çıkarın.

6. Kesi Kapanış ve Post-operatif Bakım

1. toplayıcı veya doku kanca ve yastık çıkarın.
2. steril serum fizyolojik ile temizleyin dikiş alanı.
3. naylon sütür / iğne ve forseps kullanarak kesi kapatın.
4. anti-enflamatuar ve analjezik ameliyat sonrası rahatsızlığı azaltmak için uygulayınız.
5. en az 1 saat ve monitör kurtarma için ısıtma pedi üzerine yerleştirilir kafeste hayvan yerleştirin.

Sonuçlar

Burada tarif edilen fare infüzyon mikrocerrahi tekniği çok yönlüdür ve beyin metastaz oluşumunun ^{1, 12} ait temsili bir modelinde tümör hücrelerinin verilmesi de dahil olmak üzere, doğrudan beyin içine farklı maddelerin aktarılması için kullanılmıştır.

Bu teknik aynı zamanda CNS farklı patojenlerin patolojik açıdan değerlendirmek için uygundur...

Tartışmalar

Burada anlatılan infüzyon mikrocerrahi gövdesi ^{1, 12} boyunca istenmeyen yayılmasını önleyerek, CNS içine çeşitli biyolojik özellikleri eksojen maddelerin teslim çok başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Kan-beyin bariyerinin bozulması çok merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıkların patolojik özelliğidir; Bu nedenle, kan-beyin bariyeri ile ekzojen maddelerin ilişkisini değerlendirmek büyük önem ve ilgi konusudur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia instrument	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine Science Tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine Science Tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine Science Tool	00109-11
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-08
Nylon suture	Braintree Scientific	SUT-S 104
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherScientific	50-121-8005