Tecnica mouse Microchirurgia infusione per Targeted Sostanza consegna nel sistema nervoso centrale<i&gt; via</i&gt; Carotide interna

Riepilogo

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Abstract

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Introduzione

Nei modelli in vivo del sistema nervoso centrale (SNC) malattie richiedono un efficace erogazione di sostanze esogene, come la droga, agenti patogeni, o esosomi, nel cervello. Pertanto, un metodo di distribuzione ideale dovrebbe causare un trauma minimo per l'animale, preservare l'integrità della rete neuronale, e raggiungere elevate concentrazioni di sostanza nel cervello ^1.

Sono stati descritti diversi metodi chirurgici di consegna sostanza locale, tra intra-guaina, intracerebrale, e iniezioni intraventricolare o protesi ^{2, 3, 4, 5.} Questi approcci, tuttavia, sono considerate traumatica al SNC, e permettono la somministrazione di solo bassi volumi della sostanza di interesse. Inoltre, è stato suggerito che le sostanze esogene possono essere rapidamente rimossi dal liquido cerebrospinale ⁶ e una gamma bassa penetrazione al parenchima cerebrale è stata osservata ⁷ quando le tecniche sopra menzionate sono impiegati. Metodi di consegna sistemici, come ad esempio per via orale, polmonare, per via sottocutanea, endovenosa e, sono più comunemente utilizzati nei modelli animali, anche se essi mostrano scarsa efficacia nel fornire le sostanze al sistema nervoso centrale, a causa di assorbimento da parte di altri organi ^{8, 9.} Pertanto, queste rotte di consegna richiedono dosi elevate di sostanze amministrati, aumentando il rischio di effetti collaterali e la tossicità ^{10, 11.}

Qui, descriviamo una tecnica microchirurgica infusione del mouse, che offre in modo efficace le sostanze direttamente nel cervello attraverso l'arteria carotide interna. Oltre al targeting la consegna al CNS, questa tecnica non bypassare normali barriere fisiologiche ed è quindi molto importante per biologicaprocessi l coinvolti nei passaggi terapie o agenti patogeni nel cervello.

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Protocollo

Le procedure coinvolte nel seguente protocollo sono stati approvati dalla University of Miami Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC). In aggiunta, tutte le procedure sono state condotte in impianti autorizzati dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento degli animali da laboratorio Care International (AAALAC).

1. Preparazione di topi per Chirurgia

1. Anestetizzare topo con isoflurano mescolato con l'ossigeno, utilizzando un sistema di laboratorio anestesia. Utilizzare isoflurano a stabilire tra il 4-5% e il flusso di ossigeno a 2 L / min sulla macchina commerciale (vedi Materiali Tavolo). Trasferire l'animale alla superficie un intervento chirurgico, sotto uno stereomicroscopio, e sostenere l'anestesia con un cono (utilizzare l'impostazione 1,5 isoflurano - 2,5 e ossigeno flusso a 2 L / min).
   1. Assicurarsi che la frequenza respiratoria del mouse è di circa 1 - 2 respirazione / sec, senza boccheggiare. Inoltre, assicurarsi che l'animale non presenta reazione stimolazione baffi e pedale reFlex (tep pizzico). Monitorare la frequenza respiratoria e lo sforzo durante l'intervento chirurgico, almeno ogni 5 min. Seguire specifica Istituzionale Animal Care e del Comitato Usa e le linee guida per il monitoraggio veterinari roditore anestesia.
2. Applicare una goccia di lubrificante oftalmica su ciascun occhio con un tampone sterile per prevenire la secchezza. Si raccomanda somministrazione di anti-infiammatori e analgesici per alleviare il disagio.
3. Con l'animale sdraiato sul dorso, mantenere l'anestesia con un cono di naso.
4. Pulire collo dell'animale strofinando la zona tre volte con etanolo al 70% e clorexidina. Radere zona chirurgia dell'animale utilizzando un rasoio (descritto di seguito).

2. La dissezione della carotide comune (CCA)

1. Eseguire l'intera procedura microchirurgia allo stereomicroscopio. Utilizzando forbici chirurgiche e pinze eseguire una incisione mediana superficiale nel collo, da sopra lo sterno al di sotto tegli mascella (circa 3 o 4 cm).
2. Utilizzando pinze grassi accuratamente separato e tessuto connettivo per esporre la trachea.
3. Posizionare un cuscino (oggetto rotondo, circa 0,5 cm di diametro) sul retro del collo del mouse per estendere il collo, esponendo la zona.
4. Separare il tessuto utilizzando un divaricatore tissutale o ganci.
5. Sul lato sinistro dell'animale della trachea, accuratamente tweeze parte il tessuto connettivo per esporre il CCA partita.
6. Uso di pinze rimuovere accuratamente tutto il tessuto connettivo per esporre la biforcazione CCA, e l'inizio di entrambe le arterie carotidi interne ed esterne.

3. Preparazione del CCA per la sostanza Infusion

1. Inserire due segmenti di sutura in nylon (circa 1 cm ciascuno) sotto carotide esterna (ECA), con pinze.
2. Posizionare un nodo permanente al punto possibile della ECA più alto.
3. Nel punto più basso possibile della ECA, immediatamente al di sopra della biforcazione CCA, postoun nodo rimovibile. Questo nodo dovrebbe essere sciolto rispetto al nodo superiore.
4. Chiudere la CCA utilizzando una clip nave, nel punto più basso possibile.
5. Chiudere l'arteria carotide interna (ICA) utilizzando una clip nave.
6. Con le forbici a molla di microdissezione eseguire un piccolo taglio nella ECA (circa 2 mm), tra i due nodi.

4. Infusione Sostanza via ICA

1. Assemblare un sistema di infusione. Fissare 6 pollici di tubo capillare (dimensioni ideali: 2,5 mm x 1,2 mm) ad una siringa tubercolina contenente 250 ml di sostanza da infondere (farmaci, agenti patogeni, vescicole extracellulari, tra gli altri) e inserire la punta capillare dolcemente verso l'incisione eseguita al punto 3.6.
2. Continua a scivolare lungo il capillare fino a raggiungere un punto medio tra la biforcazione e la clip di chiusura del CCA.
3. Legare giù il nodo ECA inferiore. Verificare che il nodo è sufficiente per consentire capillare fluidità sciolti e abbastanza stretta per impedire leaking.
4. Rimuovere clip dalla ICA.
5. applicare una leggera pressione alla sostanza della siringa del pistone consente l'infusione a circa 10 ml al secondo.

5. Procedure di infusione postali

1. Posizionare la clip posteriore sul ICA.
2. Rimuovere delicatamente il tubo capillare.
3. Legare giù il nodo ECA inferiori completamente.
4. Rimuovere clip dal ICA e il CCA.

6. Incisione di chiusura e di assistenza post-operatoria

1. Rimuovere divaricatore o di tessuti ganci e cuscino.
2. Pulire l'area di sutura con soluzione fisiologica sterile.
3. Chiudere l'incisione mediante sutura in nylon / ago e pinza.
4. Somministrare anti-infiammatori e analgesici per alleviare il disagio post-operatorio.
5. Mettere animale in gabbia posto sulla piastra elettrica per almeno 1 ora e il recupero del monitor.

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Risultati

La tecnica microchirurgia infusione topo descritto qui è molto versatile ed è stato utilizzato per fornire diverse sostanze direttamente nel cervello, compresa la fornitura di cellule tumorali in un modello rappresentativo di una formazione di metastasi cerebrale ^{1, 12.}

Questa tecnica è adatto anche per valutare gli aspetti patologici diversi patogeni nel SNC. In un...

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Discussione

La microchirurgia infusione qui descritto è stato dimostrato di essere molto successo nella fornitura di sostanze esogene di varie funzioni biologiche nel SNC, impedendo la diffusione indesiderata in tutto il corpo ^{1, 12.} Rottura della barriera emato-encefalica è una caratteristica patologica di diverse malattie del sistema nervoso centrale-correlate; pertanto valutare il rapporto di sostanze esogene con la barriera emato-encefalica è di grande importanza ed ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia instrument	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine Science Tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine Science Tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine Science Tool	00109-11
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-08
Nylon suture	Braintree Scientific	SUT-S 104
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherScientific	50-121-8005