Souris microchirurgie Infusion Technique pour ciblée Substance Livraison dans le SNC<i&gt; via</i&gt; L&#39;artère carotide interne

Résumé

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Résumé

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Introduction

Dans les modèles in vivo du système nerveux central (SNC) ont besoin d' une prestation efficace des substances exogènes, tels que les médicaments, les agents pathogènes, ou exosomes, dans le cerveau. Par conséquent, une méthode de distribution idéale devrait provoquer un traumatisme minimal à l'animal, de préserver l'intégrité du réseau neuronal, et d' atteindre des concentrations élevées de la substance dans le cerveau ^1.

Plusieurs méthodes chirurgicales de distribution de substance locale ont été décrites, y compris intra-gaine, intracérébrale, et les injections intraventriculaire ou implants ^{2, 3, 4, 5.} Ces approches, cependant, sont considérés comme traumatique du système nerveux central, et permettent l'administration des seuls volumes faibles de la substance d'intérêt. En outre, il a été suggéré que les substances exogènes peuvent être éliminées rapidement par le liquide céphalo - ⁶ , et une faible gamme de pénétration du parenchyme cérébral a été observée ⁷ lorsque les techniques mentionnées ci-dessus sont utilisées. Méthodes de libération systémique, comme par voie orale, pulmonaire, sous - cutanée et intraveineuse, sont plus couramment utilisés dans des modèles animaux, bien qu'ils présentent une faible efficacité dans la livraison des substances au système nerveux central, en raison de l' absorption par les autres organes ^{8, 9.} Par conséquent, ces voies d'administration nécessitent des doses élevées de substances administrées, ce qui augmente le risque d'effets secondaires et de toxicité ^{10, 11.}

Ici, nous décrivons une technique de microchirurgie d'infusion de souris, ce qui crée effectivement des substances directement dans le cerveau par l'intermédiaire de l'artère carotide interne. En plus de cibler la livraison au CNS, cette technique ne contourne pas les barrières physiologiques normales et est donc très pertinente pour biological processus impliqués dans les passages des agents thérapeutiques ou des agents pathogènes dans le cerveau.

Protocole

Les procédures impliquées dans le protocole suivant ont été approuvés par l'Université de Miami Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC). En outre, toutes les procédures sont menées dans des installations agréées par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International (AAALAC).

1. Préparation de la souris pour la chirurgie

1. Anesthésier souris avec de l'isoflurane mélangé avec de l'oxygène, en utilisant un système de laboratoire de l'anesthésie. Utilisez isoflurane à mettre entre 4-5% et le débit d'oxygène à 2 L / min sur la machine commerciale (voir tableau Matériaux). Transférer l'animal à la surface de la chirurgie, sous un stéréomicroscope, et maintenir l'anesthésie en utilisant un cône de nez (utiliser le paramètre 1,5 isoflurane - 2,5 et de l'oxygène au débit de 2 L / min).
   1. Assurez-vous que la fréquence respiratoire de la souris est d'environ 1 - 2 respiration / sec sans haleter. En outre, veiller à ce que l'animal ne présente pas de réaction de stimulation des moustaches et de la pédale reFlex (pincement de l'orteil). Surveiller le taux de respiration et d' efforts au cours de la chirurgie, au moins tous les 5 min. Suivez spécifique Institutional Animal Care et utilisation Comité et directives vétérinaires pour la surveillance des rongeurs d'anesthésie.
2. Appliquer une goutte de lubrifiant ophtalmique sur chaque œil à l'aide d'un écouvillon stérile afin de prévenir la sécheresse. L'administration de l'anti-inflammatoire et analgésique pour soulager l'inconfort est recommandée.
3. Avec l'animal couché sur le dos, maintenir l'anesthésie à l'aide d'un cône de nez.
4. Nettoyer la zone du cou de l'animal en essuyant la zone trois fois avec de l'éthanol à 70% et la chlorhexidine. Rasez la zone de chirurgie de l'animal à l'aide d'un rasoir (détaillé ci-dessous).

2. Dissection de l'artère carotide commune (CCA)

1. Effectuez la procédure de microchirurgie entière sous un stéréomicroscope. Avec des ciseaux chirurgicaux et des pinces effectuer une incision médiane peu profonde dans le cou, au-dessus du sternum au-dessous de til mâchoire (environ 3 à 4 cm).
2. En utilisant une pince grasse soigneusement séparée et du tissu conjonctif pour exposer la trachée.
3. Placer un oreiller (objet rond, d'environ 0,5 cm de diamètre) au dos du col de la souris pour s'étendre du col, ce qui expose en outre la région.
4. Séparer le tissu en utilisant soit un écarteur de tissus ou des crochets.
5. Sur le côté gauche de la trachée de l'animal, tweeze avec précaution le tissu conjonctif pour exposer le CCA gauche.
6. Utiliser une pince retirer délicatement tous les tissus conjonctifs pour exposer la bifurcation CCA, et le début des deux artères carotides internes et externes.

3. Préparation de la CCA pour perfusion des substances

1. Insérez deux segments de suture en nylon (environ 1 cm chacun) sous l'artère carotide externe (ECA), en utilisant une pince.
2. Placez un nœud permanent au point possible de la CEA le plus élevé.
3. Au point le plus bas possible de la CEA, immédiatement au-dessus de la bifurcation CCA, le lieuun noeud amovible. Ce nœud doit être lâche par rapport au nœud supérieur.
4. Fermez le CCA en utilisant un clip de navire, au point le plus bas possible.
5. Fermez l'artère carotide interne (ICA) à l'aide d'un clip navire.
6. Utilisation de microdissection ciseaux à ressort effectuer une petite incision dans l'ECA (environ 2 mm), entre les deux nœuds.

4. Substance Infusion via ICA

1. Assembler un système de perfusion. Fixer 6 pouces de tube capillaire (dimensions idéales: 2,5 mm x 1,2 mm) à une seringue tuberculine contenant 250 ul de la substance à infuser (médicaments, des agents pathogènes, des vésicules extracellulaires, entre autres) et insérez la pointe capillaire doucement dans l'incision réalisée à l'étape 3.6.
2. Continuez à glisser vers le bas le capillaire jusqu'à ce qu'il atteigne un point médian entre la bifurcation et le clip de fermeture du CCA.
3. Attachez le nœud de la CEA inférieure. Vérifiez que le noeud est suffisant pour permettre la fluidité capillaire lâche et assez serré pour empêcher leaking.
4. Retirer l'attache de l'ICA.
5. Appuyez doucement sur la substance perfusion seringue piston permettant à environ 10 pi par seconde.

5. Procédures de perfusion post

1. Placez dos clip sur la CIA.
2. Retirez délicatement le tube capillaire.
3. Attachez le nœud ECA inférieure complètement.
4. Retirer les clips de l'ICA et le CCA.

6. Incision clôture et des soins post-opératoires

1. Retirer écarteur ou de tissus crochets et oreiller.
2. zone de suture Nettoyer avec une solution saline stérile.
3. Fermer l'incision en utilisant suture en nylon / aiguille et pince.
4. Administrer anti-inflammatoire et analgésique pour soulager l'inconfort post-opératoire.
5. Placez l'animal dans une cage placée sur un coussin chauffant pendant au moins 1 h et la récupération du moniteur.

Résultats

La technique de microchirurgie d'infusion de souris décrit ici est très polyvalent et a été utilisé pour délivrer différentes substances directement dans le cerveau, y compris la fourniture des cellules tumorales dans un modèle représentatif de la formation de métastases cérébrales ^{1, 12.}

Cette technique est également adaptée pour évaluer les aspects...

Discussion

La microchirurgie de perfusion décrit ici a été prouvé être très efficace dans la prestation de substances exogènes de diverses caractéristiques biologiques dans le SNC, ce qui empêche la diffusion non désirée dans tout le corps ^{1, 12.} Rupture de la barrière hémato-encéphalique est une caractéristique pathologique de plusieurs maladies liées au système nerveux central; Par conséquent évaluer la relation entre les substances exogènes à la bar...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia instrument	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine Science Tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine Science Tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine Science Tool	00109-11
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-08
Nylon suture	Braintree Scientific	SUT-S 104
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherScientific	50-121-8005