Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

Resumen

Este protocolo describe bioprinting 3D de tejido cardíaco sin el uso de biomateriales. Los parches cardiacos bioprinted 3D exhiben la integración mecánica de esferoides componentes y son altamente prometedores en regeneración del tejido cardíaco y como modelos 3D de la enfermedad cardíaca.

Resumen

Este protocolo describe 3D bioprinting de tejido cardíaco sin el uso de biomateriales, utilizando sólo células. Los cardiomiocitos, las células endoteliales y los fibroblastos se aislan primero, se cuentan y se mezclan a las proporciones celulares deseadas. Se co-cultivan en pocillos individuales en placas de 96 pocillos de inserción ultrabaja. Dentro de 3 días, se forman esferoides. Estos esferoides son luego recogidos por una boquilla usando succión al vacío y montados en un conjunto de agujas usando una bioprinter 3D. A continuación se permite que los esferoides se fusionen en el conjunto de agujas. Tres días después de la bioprinting en 3D, los esferoides se eliminan como un parche intacto, que ya está espontáneamente golpeando. Los parches cardiacos bioprinted 3D exhiben la integración mecánica de esferoides componentes y son altamente prometedores en regeneración del tejido cardíaco y como modelos 3D de la enfermedad cardíaca.

Introducción

Hay muchos métodos diferentes de bioprinting 3D ^{1 , 2 , 3} . La bioprinting en 3D se clasifica frecuentemente por la tecnología de impresión ¹ , con ejemplos como bioprinting de inyección de tinta, bioprinting de microextrusión, bioprinting asistido por láser, una combinación de métodos o enfoques más recientes. 3D bioprinting también se puede clasificar en andamio libre o andamios métodos dependientes [ ^4] . La mayoría de los métodos de bioprinting 3D son dependientes de andamio, donde hay una necesidad de biomateriales, por ejemplo , bioinks ⁵ o andamios ⁶ . Sin embargo, la bioprintura en 3D dependiente del andamio se enfrenta a muchos problemas y limitaciones ^{4 , 7} , tales como la inmunogenicidad del material de andamiaje, el costo de los bioinks patentados, la velocidad lenta y la toxicidad de los productos de degradación.

EscaleraSe ha intentado una ingeniería de tejido cardíaco sin pliegues utilizando esferoides ⁸ , con el potencial de superar estas desventajas de la ingeniería tisular dependiente del andamio. Sin embargo, como reconocen los autores en ese trabajo, ha sido difícil manipular y colocar con firmeza los esferoides en lugares fijos, en el proceso de biofabricación. El uso concomitante de bioprinting 3D y la ingeniería de tejidos basada en esferoides tiene el potencial para superar estas dificultades. En este protocolo, se describe bioprinting 3D de tejido cardíaco sin otros biomateriales, utilizando sólo las células en forma de esferoides.

Las bioprintadoras 3D basadas en esferoides libres de andamios tienen la capacidad de recoger los esferoides individuales usando succión por vacío y colocarlos en un conjunto de agujas. El concepto de posicionamiento de los esferoides en una matriz de agujas en bioprintado 3D, se inspira en el uso de los conjuntos de agujas (conocidos como " kenzan ") en el antiguo JapaArte nese del arreglo de la flor, ikebana. Este sistema permite que los esferoides se posicionen con precisión en cualquier configuración y da como resultado que los esferoides individuales se fusionen durante un período corto para crear un tejido 3D bioprinted. Este método permite, por lo tanto, manipular los esferoides con facilidad, con implicaciones potenciales para el futuro de la biofabricación de órganos libre de scaffold.

Protocolo

1. Preparación de cardiomiocitos

1. Generar y cultivar células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) en placas de 6 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal como se describe ¹⁰ .
2. Diferenciar hiPSCs hiPSC derivados de cardiomiocitos (hiPSC-CMs) utilizando los métodos descritos anteriormente [ ^{11 , 12]} .
3. El día 19 después de la diferenciación, aísle los cardiomiocitos usando 2 ml de tripsina / EDTA al 0,05% en cada pocillo durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Monitorear los cardiomiocitos bajo un microscopio óptico para vigilar la disociación celular.
5. Neutralizar la tripsina utilizando 2 ml de inhibidor de tripsina 0,0125%.
6. Juntar los cardiomiocitos aislados y transferirlos a un tubo cónico de 50 ml usando un relleno de pipeta motorizado.
7. Centrifugar la suspensión de células durante 5 min a 250 xg a temperatura ambiente para obtener un gránulo.
8. Resuspender el sedimento en 5 ml de Roswell Park(RPMI) suplementado con B-27 (medio celular RPMI / B-27).
9. Pipetar 20 μL de células en medio celular y teñir con una cantidad igual de solución de azul tripán al 0,4%.
10. Utilice un contador automático de células o un hemocitómetro manual para contar y obtener la concentración y la viabilidad celular de la suspensión celular.

2. Preparación de los fibroblastos

1. Iniciar la línea celular de fibroblastos cardíacos humanos (HCF) (tipo ventricular adulto) ¹³ .
2. Paso y aislarlos de acuerdo con HCF protocolos de cultivo [ ^13] .
3. Pipetar 20 μL de células en medio celular y teñir con una cantidad igual de solución de Trypan Blue 0,4%.
4. Utilice un contador automático de células o un hemocitómetro manual para contar y obtener la concentración y viabilidad celular de la nueva suspensión celular.

3. Preparación de células endoteliales

1. Inicie el umb humanoLina de células endoteliales de la vena ilical (HUVEC) como se describe ¹⁴ . Se pasan y se aíslan de acuerdo con los protocolos de cultivo HUVEC como se describe ¹⁴ .
2. Pipetar 20 μL de células en medio celular y teñir con una cantidad igual de solución de azul tripán al 0,4%.
3. Utilice un contador automático de células o un hemocitómetro manual para contar y obtener la concentración y la viabilidad celular de la suspensión celular.

4. Co-cultura:

1. Mezclar los tres tipos de células (hiPSC-CM, HCFs y HUVECs) en medio celular RPMI / B-27 para generar un stock de solución de células mixtas en un tubo cónico de 50 mL, a una relación de células hiPSC-CM: HCF: HUVEC de 70:15:15 y concentración de 165.000 células por ml.
2. Distribuir la solución de células mixtas en placas de 96 pocillos de fondo en U de muy baja fijación a 200 μl por pocillo, o 33.000 células por pocillo, utilizando una pipeta multicanal.
3. Incubar las placas de 96 pocillos durante 3 días (37 ° C, 5% de diox de carbono, 95% de humedad).
4. Inspeccione la presencia de esferoides multicelulares de células mixtas en el centro y el fondo de pocillos individuales, bajo microscopía óptica.
   NOTA: En una proyección microscópica bidimensional, estos esferoides aparecerán de forma circular ( Figura 1 ). Los esferoides deben formarse dentro de las 24 h, después de la siembra de células en placas de 96 pocillos de inserción ultrabaja. Los esferoides deben comenzar a latir en 48 horas, después de la siembra de células en placas de 96 pocillos. Los esferoides que no están golpeando no deben ser usados ​​para bioprinting 3D para asegurar que el parche cardiaco 3D bioprinted final es funcional. La inmunofluorescencia de los esferoides para la conexina 43 (Cx43) y la troponina se puede utilizar para evaluar la composición celular esferoide y la calidad [ ^15] .

5. Bioprinting en 3D de tejidos cardíacos libres de andamios

1. Cargue las placas que contienen los esferoides en las revistas de la bioprinter 3D basada en esferoides libres de andamios.
2. Encienda el bioprinter 3D y ejecute el software 3D bioprinting.
   1. Haga clic en "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspect Mode", y luego "Home Return".
   2. Haga clic en el icono verde en "Inicio" para comenzar la inspección esferoide.
   3. Observe que los diámetros del esferoide aparezcan en la columna "(2) Dia (μm)" en la pantalla.
3. Para estimar el diámetro medio del esferoide a los 100 μm más cercanos, haga clic en "Ajustes iniciales" e introduzca el diámetro medio del esferoide en el tono de Stack Z (μm).
4. Haga clic en "Total", el número bajo "Capas" debe reajustarse automáticamente. Haga clic en "Aplicar" para confirmar la configuración.
5. Haga clic en "Mapa de la matriz de agujas", vaya a "N ° de capa", seleccione la capa deseada para bioprintado 3D y dibuje el diseño de bioprintado 3D deseado en el mapa a la izquierda de la pantalla seleccionando posiciones de esferoides individuales. ClicK "Aplicar" para confirmar el diseño de bioprintado 3D.
6. Haga clic en "Comprobación de matriz de aguja" para comenzar la inspección de la matriz de aguja. Si el conjunto de agujas está desenfocado, introduzca los valores en "OffsetZ (μm)", que van de 0 a 500 μm para ajustar el enfoque de la cámara, comenzando con 500 μm y disminuyendo entre 100 μm y 0 μm.
7. Haga clic en "Parámetros de inspección", "Tipo 1" y ajuste "Diámetro (μm)" en el rango de diámetro deseado. Ajuste "Redondez (%)" y "Suavidad (%)" a los porcentajes deseados. Haga clic en "Aplicar" para confirmar la configuración.
   NOTA: Aquí los diámetros esferoides se fijaron de 450 μm a 550 μm. "Redondez (%)" y "Suavidad (%)" son evaluaciones computarizadas de cada esferoide individual. Aquí, la configuración utilizada para "Redondez (%)" es 60% y "Suavidad (%)" es 70%.
8. Haga clic en "Presencia" y actualice el "Diámetro (μm)" al mismo valorS en el paso anterior. Haga clic en "Aplicar" para confirmar la configuración.
9. Haga clic en "Modo de pila", a continuación, el icono verde en "Inicio" para comenzar la recogida de esferoides con la boquilla de la bioprinter 3D por succión de vacío, y la colocación de esferoides en lugares específicos en una serie de agujas.
   NOTA: Para un parche cardíaco que consta de 81 esferoides (9 esferoides x 9 esferoides), la bioprintura en 3D debe tomar de 20 a 30 min.
10. Después de la bioprintura, usando fórceps estériles, recoja el conjunto de agujas que contiene el parche bioprinted en 3D y transfiéralo a un vaso de precipitados estéril de 250 mL que contiene 150 mL de medio celular RPMI / B-27.
11. Incubar el parche bioprintado 3D con el conjunto de agujas durante 3 días (37 ° C, 5% de dióxido de carbono, 95% de humedad).

6. Eliminación del parche Bioprinted en 3D del arreglo de agujas y maduración del parche

1. Después de 3 días de incubación, con una mano en la base de la disposición de agujas y la otra en la cubierta de plástico debajo de tEl parche, deslice suavemente la cubierta de plástico hacia arriba para quitar el parche bioprintado 3D de la matriz de agujas.
   NOTA: La lubricación con solución salina tamponada con fosfato (PBS) se puede aplicar a las agujas justo antes de este paso, según sea necesario, para una remoción más suave y fácil.
2. Usando un par de fórceps estériles, recoja la cubierta de plástico con el parche bioprinted en 3D encima de él y transfiera el parche y la cubierta plástica en un plato de 35 milímetros que contenga el medio de la célula de RPMI / B-27.
3. Agite suavemente la tapa de plástico con el parche en el medio de la célula RPMI / B-27, con la pinza todavía sujetando a la cubierta de plástico, para liberar el parche en el medio.
4. Inspeccione el parche bioprinted en 3D bajo microscopía óptica para visualizar si está golpeando para asegurarse de que el parche bioprinted en 3D es funcional.
5. Incubar el parche bioprintado 3D en el plato de 35 mm durante 3 días o más (37 ° C, 5% de dióxido de carbono, 95% de humedad).
   NOTA: Después de 3 días, los esferoides se fusionan y los agujerosEl parche, donde estaban las agujas, ya no debería ser visible.

Resultados

Al final del paso 4.4 (co-cultivo), las células de cada pocillo deben agregarse en la parte inferior de las placas de 96 pocillos de fondo en U de inserción ultrabaja para formar esferoides por gravedad. Estos esferoides contienen hiPSC-CM, HCFs y HUVECs, y pueden ser inspeccionados visualmente bajo microscopía óptica, donde deben aparecer circulares por proyección bidimensional ( Figura 1 ). Al final del paso 6.3, el parche cardiaco bioprinted en 3D de...

Discusión

It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.

One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Invitrogen	A1413202
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher	15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125%	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell Media	Invitrogen	11875-093	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement	Thermo Fisher	17504044	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type)	Sciencell	6310
Human umbilical vein endothelial cells	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antibody	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher	P36935