Création d'un tissu cardiaque exposant l'intégration mécanique des sphéroïdes à l'aide de la bioprinterie 3D

Résumé

Ce protocole décrit la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans l'utilisation de biomatériaux. Les plaques cardiovasculaires bioprinées 3D présentent une intégration mécanique des sphéroïdes constitutifs et sont très prometteuses dans la régénération des tissus cardiaques et comme modèles 3D de maladies cardiaques.

Résumé

Ce protocole décrit la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans l'utilisation de biomatériaux, en utilisant uniquement des cellules. Les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes sont d'abord isolés, comptés et mélangés aux rapports cellulaires désirés. Ils sont co-cultivés dans des puits individuels dans des plaques à 96 puits ultra-bas. Dans les 3 jours, les sphéroïdes battent. Ces sphéroïdes sont ensuite ramassés par une buse à l'aspiration sous vide et assemblés sur une matrice d'aiguille à l'aide d'une bioprintrice en 3D. Les sphéroïdes sont alors autorisés à fusionner sur le réseau d'aiguilles. Trois jours après la bioprammation en 3D, les sphéroïdes sont enlevés comme un patch intact, qui bat déjà spontanément. Les plaques cardiovasculaires bioprinées 3D présentent une intégration mécanique des sphéroïdes constitutifs et sont très prometteuses dans la régénération des tissus cardiaques et comme modèles 3D de maladies cardiaques.

Introduction

Il existe de nombreuses méthodes différentes de bioprinture 3D ^{1 , 2 , 3} . La bioprinture 3D est fréquemment classée par la technologie d'impression ¹ , avec des exemples tels que la bioprin à jet d'encre, la bioprin de microextrusion, la biopramétrie assistée par laser, une combinaison de méthodes ou des approches plus récentes. La bioprinture en 3D peut également être classée dans des méthodes sans échafaudage ou dépendantes de l'échafaudage ⁴ . La plupart des méthodes de biopramétrie en 3D dépendent de l'échafaudage, où il existe un besoin de biomatériaux, p.ex. bioinks ⁵ ou échafaudages ⁶ . Cependant, la bioprin 3D dépendant de l'échafaudage fait face à de nombreux problèmes et limitations ^{4 , 7} , tels que l'immunogénicité du matériel d'échafaudage, le coût des bioinks exclusifs, la vitesse lente et la toxicité des produits de dégradation.

ScafL'ingénierie des tissus cardiaques sans plis utilisant des sphéroïdes a été tentée ⁸ , avec le potentiel de surmonter ces inconvénients de l'ingénierie tissulaire dépendante des échafaudages. Cependant, comme l'ont reconnu les auteurs dans ce document, il était difficile de manipuler et de positionner de manière robuste les sphéroïdes dans des endroits fixes, dans le cadre de la biofabrication. L'utilisation concomitante de l'ingénierie des tissus à base de biochimie 3D et de sphéroïde permet de surmonter ces difficultés. Dans ce protocole, nous décrivons la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans autres biomatériaux, en utilisant uniquement des cellules sous forme de sphéroïdes.

Les bioprimes en 3D à base de sphéroïdes sans échafaudage ⁹ ont la possibilité de ramasser des sphéroïdes individuels à l'aide d'une aspiration sous vide et de les placer sur un réseau d'aiguille. Le concept de positionnement des sphéroïdes sur une trousse à aiguille en 3D bioprinting, s'inspire de l'utilisation de tableaux d'aiguilles (connu sous le nom de " kenzan ") dans l'ancien JapaNese art of flower arrangement, ikebana. Ce système permet aux sphéroïdes d'être positionnés avec précision dans n'importe quelle configuration et entraîne la fusion des sphéroïdes individuels sur une courte période pour créer un tissu 3D bioprinté. Cette méthode permet de manipuler facilement les sphéroïdes avec des implications potentielles pour l'avenir de la biofabrication d'organes sans échafaudages.

Protocole

1. Préparation des cardiomyocytes

1. Générer et cultiver des cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) sur des plaques à 6 puits revêtues d'une matrice de membrane basale telle que décrite ¹⁰ .
2. Différenciez les hiPSC dans les cardiomyocytes dérivés de HiPSC (HiPSC-CM) en utilisant les méthodes décrites précédemment ^{11 , 12} .
3. Le jour 19 après différenciation, isoler les cardiomyocytes en utilisant 2 ml de Trypsin / EDTA 0,05% dans chaque puits pendant 5 minutes à température ambiante.
4. Surveiller les cardiomyocytes sous un microscope optique pour surveiller la dissociation cellulaire.
5. Neutralizez la trypsine en utilisant 2 mL d'inhibiteur de trypsine 0.0125%.
6. Collez les cardiomyocytes isolés et transférez-les dans un tube conique de 50 ml à l'aide d'une charge de pipette motorisée.
7. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 250 xg à température ambiante pour obtenir une pastille.
8. Remettre en suspension la pastille dans 5 mL de Roswell ParkMédias cellulaires du Memorial Institute (RPMI) complétés par B-27 (média cellulaire RPMI / B-27).
9. Pipettez 20 μL de cellules dans des milieux cellulaires et tachez avec une quantité égale de solution à 0,4% de Trypan Blue.
10. Utilisez un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre manuel pour compter et obtenir la concentration et la viabilité cellulaire de la suspension cellulaire.

2. Préparation des fibroblastes

1. Lancer la ligne cellulaire ¹³ du groupe des fibroblastes cardiaques humains (HCF) (type ventriculaire adulte).
2. Passage et les isoler conformément aux protocoles de culture HCF ¹³ .
3. Pipettez 20 μL de cellules dans le milieu cellulaire et tachez avec une quantité égale de solution Trypan Blue à 0,4%.
4. Utilisez un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre manuel pour compter et obtenir la concentration et la viabilité cellulaire de la nouvelle suspension cellulaire.

3. Préparation des cellules endothéliales

1. Initier l'umb humainLigne des cellules endothéliales de la veine ilirique (HUVEC) comme décrit ¹⁴ . Passage et les isoler conformément aux protocoles de culture de HUVEC tels que décrits ¹⁴ .
2. Pipettez 20 μL de cellules dans des milieux cellulaires et tachez avec une quantité égale de solution à 0,4% de Trypan Blue.
3. Utilisez un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre manuel pour compter et obtenir la concentration et la viabilité cellulaire de la suspension cellulaire.

4. Co-culture:

1. Mélangez les trois types de cellules (hiPSC-CM, HCF et HUVEC) dans des milieux cellulaires RPMI / B-27 pour générer un stock de solution cellulaire mixte dans un tube conique de 50 ml, à un rapport de cellules HiHCC CM: HCF: HUVEC 70:15:15 et concentration de 165 000 cellules par ml.
2. Distribuer la solution cellulaire mixte dans des plaques en U-fond de 96 puits ultra-bas à 200 μL par puits, soit 33 000 cellules par puits, en utilisant une pipette multicanaux.
3. Incuber les plaques à 96 puits pendant 3 jours (37 ° C, 5% diox carboniqueIdé, 95% d'humidité).
4. Inspecter la présence de sphéroïdes multicellulaires à cellules mixtes au centre et au bas des puits individuels, sous microscopie optique.
   REMARQUE: Dans une projection microscopique bidimensionnelle, ces sphéroïdes apparaîtront de forme circulaire ( figure 1 ). Les sphéroïdes devraient se former dans les 24 h, après l'ensemencement de cellules dans des plaques à 96 puits ultra-bas. Les sphéroïdes devraient commencer à battre dans les 48 h, après l'ensemencement de cellules dans des plaques à 96 puits. Les sphéroïdes qui ne battent pas ne doivent pas être utilisés pour la bioprime 3D pour s'assurer que le patch cardiaque bioprinté 3D final est fonctionnel. L'immunofluorescence des sphéroïdes pour la connexine 43 (Cx43) et la troponine peut être utilisée pour évaluer la composition et la qualité cellulaire sphéroïde ¹⁵ .

5. Bioprintage 3D de tissus cardiaques sans échafaudages

1. Chargez les plaques contenant les sphéroïdes dans les magazines de la bioprampe 3D à base de sphéroïde sans échafaudage.
2. Activez la bioprime 3D et exécutez le logiciel de bioprintage 3D.
   1. Cliquez sur "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspect Mode", puis "Home Return".
   2. Cliquez sur l'icône verte sous "Démarrer" pour commencer l'inspection des sphéroïdes.
   3. Surveillez que les diamètres sphéroïdes apparaissent sous la colonne "(2) Dia (μm)" sur l'écran.
3. Pour estimer le diamètre sphéroïde moyen au plus près de 100 μm, cliquez sur "Réglages initiaux" et entrez le diamètre sphéroïde moyen dans le niveau Stack Z (μm).
4. Cliquez sur "Total", le numéro sous "Calques" devrait réajuster automatiquement. Cliquez sur "Appliquer" pour confirmer les paramètres.
5. Cliquez sur "Carte de la ligne d'aiguille", passez à "Numéro de calque", sélectionnez la couche souhaitée pour la bioprin 3D et tracez la conception de biopramétrie 3D souhaitée sur la carte à gauche de l'écran en sélectionnant les positions sphéroïdes individuelles. ClicK "Appliquer" pour confirmer la conception de la bioprin 3D.
6. Cliquez sur "Vérification de la ligne d'aiguille" pour commencer l'inspection du tableau d'aiguille. Si le réseau d'aiguille est hors de portée, saisissez les valeurs dans "OffsetZ (μm)", allant de 0 à 500 μm pour ajuster la mise au point de la caméra, en commençant par 500 μm et en diminuant de 100 μm à 0 μm.
7. Cliquez sur "Paramètres d'inspection", "Type 1", et réglez "Diamètre (μm)" dans la plage de diamètre souhaitée. Réglez "Roundness (%)" et "Smoothness (%)" aux pourcentages souhaités. Cliquez sur "Appliquer" pour confirmer les paramètres.
   REMARQUE: Ici, les diamètres sphéroïdes ont été fixés de 450 μm à 550 μm. "Roundness (%)" et "Smoothness (%)" sont calculés par ordinateur de chaque sphéroïde individuel. Ici, les paramètres utilisés pour "Roundness (%)" sont 60% et "Loughness (%)" est de 70%.
8. Cliquez sur "Présence" et mettez à jour le "Diamètre (μm)" dans le même réglageS dans l'étape précédente. Cliquez sur "Appliquer" pour confirmer les paramètres.
9. Cliquez sur "Stack Mode", puis sur l'icône verte sous "Start" pour commencer la prise de sphéroïde en utilisant la buse de la bioprintrice 3D par aspiration sous vide, et le placement de sphéroïdes dans des endroits spécifiques dans une matrice d'aiguille.
   REMARQUE: Pour un patch cardiaque composé de 81 sphéroïdes (9 sphéroïdes x 9 sphéroïdes), la bioprin 3D doit prendre environ 20 à 30 minutes.
10. Après la bioprinture, en utilisant des pinces stériles, retirez le réseau d'aiguilles contenant le patch bioprin 3D et transférez-le dans un bécher stérile de 250 mL contenant 150 mL de média cellulaire RPMI / B-27.
11. Incuber le patch 3D bioprinté avec la matrice d'aiguille pendant 3 jours (37 ° C, 5% de dioxyde de carbone, 95% d'humidité).

6. Suppression du patch bioprinté 3D de la matrice d'aiguilles et de la maturation des patchs

1. Après 3 jours d'incubation, d'une main à la base de l'agencement d'aiguille et l'autre sur le couvercle en plastique sous tIl patch, glisse doucement le couvercle en plastique vers le haut pour enlever le patch 3D bioprinté de la matrice d'aiguille.
   REMARQUE: La lubrification avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) peut être appliquée aux aiguilles juste avant cette étape, au besoin, pour un retrait plus doux et plus facile.
2. À l'aide d'une pince stérilisée, retirez le couvercle en plastique avec le patch bioprin 3D sur le dessus et transférez le patch et le couvercle en plastique dans un plat 35 mm contenant du milieu cellulaire RPMI / B-27.
3. Secouez doucement le couvercle en plastique avec le patch dans le média cellulaire RPMI / B-27, les pinces toujours enfoncées sur le couvercle en plastique, pour libérer le patch dans le support.
4. Inspectez le patch bioprinté en 3D sous microscope optique pour visualiser s'il bat parce que le patch bioprin 3D est fonctionnel.
5. Incuber le patch bioprinté 3D dans le plat de 35 mm pendant 3 jours ou plus (37 ° C, 5% de dioxyde de carbone, 95% d'humidité).
   REMARQUE: après 3 jours, les sphéroïdes fusionnent et les trous dansLe patch, où étaient les aiguilles, ne devrait plus être visible.

Résultats

À la fin de l'étape 4.4 (co-culture), les cellules de chaque puits devraient agréger au bas des plaques en U-fond de 96 puits ultra-bas pour former des sphéroïdes par gravité. Ces sphéroïdes contiennent du hiPSC-CM, des HCF et des HUVEC, et peuvent être inspectés visuellement sous microscope optique, où ils devraient apparaître circulaires par projection bidimensionnelle ( figure 1 ). À la fin de l'étape 6.3, le patch cardiaque bioprint...

Discussion

It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.

One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Invitrogen	A1413202
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher	15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125%	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell Media	Invitrogen	11875-093	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement	Thermo Fisher	17504044	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type)	Sciencell	6310
Human umbilical vein endothelial cells	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antibody	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher	P36935