Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne den Einsatz von Biomaterialien. 3D-Bioprints-Herz-Patches zeigen mechanische Integration von Komponenten-Sphäroiden und sind vielversprechend bei der Herz-Gewebe-Regeneration und als 3D-Modelle von Herzerkrankungen.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne den Einsatz von Biomaterialien, wobei nur Zellen verwendet werden. Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten werden zuerst isoliert, gezählt und bei gewünschten Zellverhältnissen gemischt. Sie werden in einzelnen Brunnen in ultra-niedrigen Befestigung 96-Well-Platten co-kultiviert. Innerhalb von 3 Tagen, schlagen Sphärenoiden bilden. Diese Sphäroide werden dann durch eine Düse mit Vakuumsaugung aufgenommen und auf einer Nadelanordnung unter Verwendung eines 3D-Bioprinter aufgebaut. Die Sphäroide dürfen dann auf dem Nadel-Array verschmelzen. Drei Tage nach dem 3D-Bioprinting werden die Sphäroide als intaktes Patch entfernt, das schon spontan schlägt. 3D-Bioprints-Herz-Patches zeigen mechanische Integration von Komponenten-Sphäroiden und sind vielversprechend bei der Herz-Gewebe-Regeneration und als 3D-Modelle von Herzerkrankungen.

Einleitung

Es gibt viele verschiedene Methoden der 3D-Bioprinting ^{1 , 2 , 3} . Das 3D-Bioprinting wird häufig durch die Drucktechnologie ¹ klassifiziert, mit Beispielen wie Inkjet-Bioprinting, Microextrusion Bioprinting, laserunterstütztes Bioprinting, einer Kombination von Methoden oder neueren Ansätzen. 3D-Bioprinting kann auch in Gerüst- oder Gerüst-abhängige Methoden eingeteilt werden ⁴ . Die meisten Methoden des 3D-Bioprintings sind gerüstabhängig, wo Biomaterialien erforderlich sind, zB Bioinks ⁵ oder Gerüste ⁶ . Allerdings ist das Gerüst-abhängige 3D-Bioprinting viele Probleme und Einschränkungen ^{4 , 7} , wie Immunogenität von Gerüstmaterial, Kosten für proprietäre Bioinks, langsame Geschwindigkeit und Toxizität von Abbauprodukten.

ScafFachfreies Herzgewebe-Engineering mit Sphäroiden wurde versucht ⁸ , mit dem Potenzial, diese Nachteile der Gerüst-abhängigen Tissue Engineering zu überwinden. Jedoch, wie von den Autoren in diesem Papier anerkannt, war es schwierig, robuste Griff und Position Sphäroiden an festen Standorten, in den Prozess der Biofabrikation. Die gleichzeitige Nutzung von 3D-Bioprinting und Sphäroid-basierten Tissue Engineering hat das Potenzial, diese Schwierigkeiten zu überwinden. In diesem Protokoll beschreiben wir das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne andere Biomaterialien, wobei nur Zellen in Form von Sphäroiden verwendet werden.

Gerüstfreie Sphäroid-basierte 3D-Bioprinter ⁹ haben die Möglichkeit, einzelne Sphäroide mit Vakuumsaugung aufzuheben und auf einem Nadel-Array zu positionieren. Das Konzept der Positionierung von Sphäroiden auf einem Nadel-Array in 3D-Bioprinting, ist inspiriert von der Verwendung von Nadel-Arrays (bekannt als " Kenzan ") in der alten JapaNese kunst der blumenanordnung , ikebana. Dieses System ermöglicht die präzise Positionierung von Sphäroiden in beliebiger Konfiguration und führt dazu, dass die einzelnen Sphäroide über einen kurzen Zeitraum zusammenschmelzen, um ein 3D-Bioprints-Gewebe zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht es, dass Sphäroide mit Leichtigkeit manipuliert werden können, mit potenziellen Implikationen für die Zukunft der gerüstfreien Orgel-Biofabrikation.

Protokoll

1. Vorbereitung der Kardiomyozyten

1. Generieren und kultivieren menschlich induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) auf 6-Well-Platten, die mit der Basalmembranmatrix beschichtet sind, wie beschrieben ¹⁰ .
2. Unterscheiden Sie hiPSCs in hiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden ^{11 , 12} .
3. Am Tag 19 nach der Differenzierung, isolieren Sie die Kardiomyozyten mit 2 ml Trypsin / EDTA 0,05% in jeder Vertiefung für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Überwachen Sie die Kardiomyozyten unter einem optischen Mikroskop, um die Zelldissoziation zu beobachten.
5. Neutralisieren von Trypsin unter Verwendung von 2 ml Trypsin-Inhibitor 0,015%.
6. Die isolierten Kardiomyozyten umspülen und in ein 50 ml konisches Röhrchen mit einem motorisierten Pipettenfüller überführen.
7. Die Zellsuspension 5 min bei 250 xg bei Raumtemperatur zentrifugieren, um ein Pellet zu erhalten.
8. Das Pellet in 5 ml Roswell Park resuspendierenMemorial Institute (RPMI) Zellmedien ergänzt mit B-27 (RPMI / B-27 Zellmedien).
9. Pipettieren Sie 20 μl Zellen in Zellmedien und Flecken mit einer gleichen Menge von 0,4% Trypan Blue Lösung.
10. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler oder ein manuelles Hämocytometer, um die Konzentration und die Zelllebensfähigkeit der Zellsuspension zu zählen und zu erhalten.

2. Vorbereitung von Fibroblasten

1. Initiieren Sie die menschliche Herzfibroblasten (HCF) (adulte ventrikuläre) Zelllinie ¹³ .
2. Passage und isolieren sie nach HCF Kultivierungsprotokollen ¹³ .
3. Pipettieren Sie 20 μl Zellen in Zellmedien und Flecken mit einer gleichen Menge an Trypan Blue Lösung 0,4%.
4. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler oder ein manuelles Hämocytometer, um die Konzentration und die Zelllebensfähigkeit der neuen Zellsuspension zu zählen und zu erhalten.

3. Vorbereitung von Endothelzellen

1. Lasse die menschliche umb einIlical vene Endothelzelle (HUVEC) wie beschrieben ¹⁴ . Passage und isolieren sie nach HUVEC Kultivierungsprotokollen wie beschrieben ¹⁴ .
2. Pipettieren Sie 20 μl Zellen in Zellmedien und Flecken mit einer gleichen Menge von 0,4% Trypan Blue Lösung.
3. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler oder ein manuelles Hämocytometer, um die Konzentration und die Zelllebensfähigkeit der Zellsuspension zu zählen und zu erhalten.

4. Co-Kultur:

1. Mischen Sie die drei Zelltypen (hiPSC-CM, HCFs und HUVECs) in RPMI / B-27-Zellmedien, um einen Bestand an gemischter Zelllösung in einem 50 ml konischen Röhrchen bei einem HIPSC-CM: HCF: HUVEC-Zellverhältnis zu erzeugen 70:15:15 und Konzentration von 165.000 Zellen pro ml.
2. Verteilen Sie die gemischte Zelllösung in ultra-niedrige Anlagerung 96-well U-Bodenplatten bei 200 & mgr; l pro Vertiefung oder 33 000 Zellen pro Vertiefung unter Verwendung einer Mehrkanalpipette.
3. Inkubieren Sie die 96-Well-Platten für 3 Tage (37 ° C, 5% Carbon DioxIde, 95% Luftfeuchtigkeit).
4. Überprüfen Sie auf das Vorhandensein von gemischten zelligen multizellulären Sphäroiden im Zentrum und Boden der einzelnen Brunnen, unter Lichtmikroskopie.
   HINWEIS: In einer zweidimensionalen mikroskopischen Projektion erscheinen diese Sphäroide kreisförmig ( Abbildung 1 ). Sphäroide sollten sich innerhalb von 24 h nach der Zelsenbildung in ultra-niedrige Befestigung 96-Well-Platten bilden. Sphäroide sollten innerhalb von 48 h nach der Zelsen in 96-Loch-Platten schlagen. Sphäroiden, die nicht schlagen, sollten nicht für das 3D-Bioprinting verwendet werden, um sicherzustellen, dass das endgültige 3D-Bioprints-Herz-Patch funktional ist. Immunfluoreszenz von Sphäroiden für Connexin 43 (Cx43) und Troponin kann zur Beurteilung der Sphäroidzellzusammensetzung und -qualität verwendet werden ¹⁵ .

5. 3D-Bioprinting von Gerüst-freie Herz-Gewebe

1. Laden Sie die Platten, die die Sphäroide enthalten, in die Magazine des gerüstfreien Sphäroid-basierten 3D-Bioprinter.
2. Schalten Sie den 3D-Bioprinter ein und führen Sie die 3D-Bioprinting-Software aus.
   1. Klicken Sie auf "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspect Mode" und dann "Home Return".
   2. Klicken Sie auf das grüne Symbol unter "Start", um die Sphäroid-Inspektion zu beginnen.
   3. Achten Sie darauf, dass die Sphäroid-Durchmesser unter der Säule "(2) Dia (μm)" auf dem Bildschirm erscheinen.
3. Um den durchschnittlichen Sphäroid-Durchmesser auf die nächstgelegenen 100 μm abzuschätzen, klicken Sie auf "Initial Settings" und geben den durchschnittlichen Sphäroid-Durchmesser in Stack Z-Tonhöhe (μm) ein.
4. Klicken Sie auf "Total", die Nummer unter "Layer" sollte automatisch neu eingestellt werden. Klicken Sie auf "Übernehmen", um die Einstellungen zu bestätigen.
5. Klicken Sie auf "Needle Array Map", gehen Sie auf "Layer No.", wählen Sie die gewünschte Ebene für 3D Bioprinting und zeichnen Sie das gewünschte 3D Bioprinting Design auf der Karte auf der linken Seite des Bildschirms, indem Sie einzelne Sphäroidpositionen auswählen. ClicK "Apply", um das 3D-Bioprinting-Design zu bestätigen.
6. Klicken Sie auf "Needle Array Check", um die Nadel-Array-Inspektion zu starten. Wenn die Nadelanordnung unscharf ist, geben Sie die Werte in "OffsetZ (μm)" ein, die von 0 bis 500 μm reichen, um den Kamerafokus einzustellen, beginnend mit 500 μm und abnehmend um 100 μm auf 0 μm.
7. Klicken Sie auf "Prüfparameter", "Typ 1" und setzen Sie "Durchmesser (μm)" auf den gewünschten Durchmesserbereich. Setzen Sie "Rundheit (%)" und "Glätte (%)" auf die gewünschten Prozentsätze. Klicken Sie auf "Übernehmen", um die Einstellungen zu bestätigen.
   HINWEIS: Hier wurden die Sphäroid-Durchmesser von 450 μm auf 550 μm eingestellt. "Rundheit (%)" und "Glätte (%)" sind computerberechneten Beurteilungen jedes einzelnen Sphäroid. Hier sind die für "Rundheit (%)" verwendeten Einstellungen 60% und "Glätte (%)" 70%.
8. Klicken Sie auf "Anwesenheit" und aktualisieren Sie den "Durchmesser (μm)" auf die gleiche EinstellungS im vorherigen Schritt. Klicken Sie auf "Übernehmen", um die Einstellungen zu bestätigen.
9. Klicken Sie auf "Stack Mode", dann das grüne Symbol unter "Start" zu beginnen Spheroid abholen mit der Düse des 3D-Bioprinter durch Vakuum-Saug-und Platzierung von Sphäroiden an bestimmten Orten in einem Nadel-Array.
   HINWEIS: Für ein Herz-Patch, bestehend aus 81 Sphäroiden (9 Sphäroiden x 9 Sphäroiden), sollte das 3D-Bioprinting etwa 20 bis 30 min dauern.
10. Nach dem Bioprinting mit steriler Pinzette das Nadel-Array mit dem 3D-Bioprints aufnehmen und in ein 250 ml steriles Becherglas geben, das 150 ml RPMI / B-27-Zellmedien enthält.
11. Inkubieren Sie den 3D-Bioprints mit dem Nadelarray für 3 Tage (37 ° C, 5% Kohlendioxid, 95% Feuchtigkeit).

6. Entfernen von 3D Bioprinted Patch aus dem Needle Array und Patch Reifung

1. Nach 3 Tagen Inkubation, mit einer Hand an der Basis der Nadel-Array und die andere auf der Kunststoff-Abdeckung unter tEr pflücken, schieben Sie die Plastikabdeckung vorsichtig nach oben, um das 3D-Bioprints-Patch aus dem Nadel-Array zu entfernen.
   HINWEIS: Die Schmierung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) kann auf die Nadeln unmittelbar vor diesem Schritt angewendet werden, je nach Bedarf, für eine glattere und leichtere Entfernung.
2. Mit einem Paar steriler Pinzette die Plastikabdeckung mit dem 3D-Bioprints aufnehmen und die Patch- und Plastikabdeckung in eine 35 mm Schale mit RPMI / B-27 Zellmedien überführen.
3. Die Plastikabdeckung vorsichtig mit dem Patch in den RPMI / B-27 Zellmedien schütteln, wobei die Pinzette noch an der Plastikabdeckung festhält, um das Pflaster in das Medium zu lösen.
4. Überprüfen Sie den 3D-Bioprints-Patch unter Lichtmikroskopie, um zu visualisieren, ob es schlägt, um sicherzustellen, dass der 3D-Bioprints-Patch funktional ist.
5. Inkubieren Sie die 3D-Bioprints in der 35 mm Schale für 3 Tage oder länger (37 ° C, 5% Kohlendioxid, 95% Luftfeuchtigkeit).
   ANMERKUNG: Nach 3 Tagen verschmelzen die Sphäroide zusammen und die LöcherDer Fleck, wo die Nadeln waren, sollte nicht mehr sichtbar sein.

Ergebnisse

Am Ende von Schritt 4.4 (Co-Kultur) sollten die Zellen in jeder Vertiefung am Boden der Ultra-Low-Attachment-96-Well-U-Bodenplatten aggregieren, um Sphäroide durch Schwerkraft zu bilden. Diese Sphäroide enthalten hiPSC-CM, HCFs und HUVECs und können unter Lichtmikroskopie visuell untersucht werden, wo sie durch zweidimensionale Projektion kreisförmig erscheinen sollen ( Abbildung 1 ). Am Ende von Schritt 6.3 sollte das 3D-Bioprints-Herz-Patch Gewebe-Hohl...

Diskussion

It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.

One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Invitrogen	A1413202
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher	15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125%	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell Media	Invitrogen	11875-093	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement	Thermo Fisher	17504044	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type)	Sciencell	6310
Human umbilical vein endothelial cells	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antibody	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher	P36935