Creazione di tessuto cardiaco che mostra l'integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D

Riepilogo

Questo protocollo descrive la bioprinting 3D del tessuto cardiaco senza l'uso di biomateriali. Le zone cardiache 3D bioprinted espongono l'integrazione meccanica dei sferoidi dei componenti e sono altamente promettenti nella rigenerazione del tessuto cardiaco e come modelli 3D di malattie cardiache.

Abstract

Questo protocollo descrive il bioprinting 3D del tessuto cardiaco senza l'uso di biomateriali, utilizzando solo le cellule. I cardiomiociti, le cellule endoteliali ei fibroblasti vengono prima isolati, contati e mescolati a rapporti cellulari desiderati. Sono co-coltivati ​​in singoli pozzetti in piastre a 96 pozzetti ad attacco ultra-basso. Entro 3 giorni, battendo forma sferoide. Questi sferoidi vengono quindi prelevati da un ugello usando l'aspirazione del vuoto e assemblati su un array di ago utilizzando un bioprinter 3D. I sferoidi sono quindi autorizzati a fondere sull'array dell'ago. Tre giorni dopo la bioprinting 3D, i sferoidi vengono rimossi come una patch intatta, che sta già battendo spontaneamente. Le zone cardiache 3D bioprinted espongono l'integrazione meccanica dei sferoidi dei componenti e sono altamente promettenti nella rigenerazione del tessuto cardiaco e come modelli 3D di malattie cardiache.

Introduzione

Ci sono molti metodi differenti di bioprinting 3D ^{1 , 2 , 3} . La bioprinting 3D è spesso classificata dalla tecnologia di stampa ¹ , con esempi come bioprinting a getto d'inchiostro, bioprinting a microestrusione, bioprinting assistito da laser, combinazione di metodi o approcci più recenti. La bioprinting 3D può essere classificata anche in metodi scaffold-dependent o scaffold-dependent ⁴ . La maggior parte dei metodi di bioprinting 3D sono dipendenti da scaffold, dove vi è la necessità di biomateriali, ad es. Biochip ⁵ o scaffold ⁶ . Tuttavia, il bioprinting 3D dipende da molte problematiche e limitazioni ^{4 , 7} , come l'immunogenicità del materiale di ponteggio, il costo dei biochimici proprietari, la velocità lenta e la tossicità dei prodotti di degradazione.

SCAFÈ stato tentato l'ingegnerizzazione dei tessuti cardiaci senza piombo usando sferoidi ⁸ , con il potenziale per superare questi svantaggi dell'ingegneria tissutale dipendente dal ponteggio. Tuttavia, come riconosciuto dagli autori in tale documento, era stato difficile gestire in modo robusto e posizionare sferoidi in posizioni fissi, nel processo di biofabbricazione. L'uso concomitante di bioprinting 3D e di ingegneria tissutale a base di sferoidi ha il potenziale per superare queste difficoltà. In questo protocollo, descriviamo la bioprinting 3D del tessuto cardiaco senza altri biomateriali, usando solo le cellule sotto forma di sferoidi.

I bioprinters 3D a base di sferoidi a base di scaffali ⁹ hanno la capacità di prelevare singoli sferoidi usando l'aspirazione del vuoto e posizionarli su una matrice di ago. Il concetto di sferoidi di posizionamento su un array di ago in bioprinting 3D è ispirato dall'utilizzo di array d'ago (detto " kenzan ") nell'antico JapaSe l'arte della disposizione dei fiori, ikebana. Questo sistema permette che i sferoidali siano posizionati in modo preciso in qualsiasi configurazione e che i singoli sferoidi si fusero insieme per un breve periodo per creare un tessuto 3D bioprintato. Questo metodo consente quindi di manipolare con facilità le sferoidi, con potenziali implicazioni per il futuro della biofabbricazione degli organi senza scaffalature.

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Protocollo

1. Preparazione dei cardiomiociti

1. Generare e coltivare cellule staminali pluripotenti indotte da umano (hiPSCs) su piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice a membrana basale come descritto ¹⁰ .
2. Differenziare i hiPSC nei cardiomiociti derivanti da hiPSC (hiPSC-CMs) utilizzando metodi descritti in precedenza ^{11 , 12} .
3. Il giorno 19 dopo la differenziazione, isolare i cardiomiociti usando 2 mL di Trypsin / EDTA 0,05% in ogni pozzetto per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Monitorare i cardiomiociti sotto un microscopio ottico per guardare la dissociazione delle cellule.
5. Neutralizzare Trypsin usando 2 mL di inibitore di Trypsin 0,0125%.
6. Raccogliere i cardiomiociti isolati e trasferirli in un tubo conico da 50 ml utilizzando un riempitivo a pipetta motorizzato.
7. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 250 xg a temperatura ambiente per ottenere un pallone.
8. Resuspendere il pellet in 5 ml di Roswell ParkI supporti delle cellule Memorial Institute (RPMI) sono integrati con B-27 (supporti cellulari RPMI / B-27).
9. Pipettare 20 μL di cellule nei supporti cellulari e macchiare con una quantità uguale di 0,4% Trypan Blue.
10. Utilizzare un contatore automatico di celle o un emocitometro manuale per contare e ottenere la concentrazione e la vitalità cellulare della sospensione cellulare.

2. Preparazione dei fibroblasti

1. Avviare la linea cellulare ^{13 del} fibroblasto cardiaco umano (HCF) (tipo ventricolare adulto).
2. Passaggio e isolarli secondo protocolli culturali HCF ¹³ .
3. Pipettare 20 μL di cellule nel supporto cellulare e macchiare con una quantità uguale di Trypan Blue soluzione 0,4%.
4. Utilizzare un contatore automatico di celle o un emocitometro manuale per contare e ottenere la concentrazione e la vitalità cellulare della nuova sospensione cellulare.

3. Preparazione delle cellule endoteliali

1. Inizia l'umb umanoCella delia endoteliale vena (HUVEC) vascolare come descritto ¹⁴ . Passaggio e isolarli secondo protocolli culturali HUVEC come descritto ¹⁴ .
2. Pipettare 20 μL di cellule nei supporti cellulari e macchiare con una quantità uguale di 0,4% Trypan Blue.
3. Utilizzare un contatore automatico di celle o un emocitometro manuale per contare e ottenere la concentrazione e la vitalità cellulare della sospensione cellulare.

4. Co-cultura:

1. Mescolare i tre tipi di cellule (hiPSC-CM, HCFs e HUVECs) nei supporti di cellule RPMI / B-27 per generare uno stack di soluzione cellulare cellulare in un tubo conico da 50 mL, con un rapporto di cellule hiPSC-CM: HCF: HUVEC 70:15:15 e concentrazione di 165.000 cellule per ml.
2. Distribuire la soluzione delle cellule miste in lastre a basso profilo a 96 pozzetti ad attacco ultra-basso a 200 μl per pozzetto, o 33.000 cellule per pozzetto, utilizzando una pipetta multicanale.
3. Incubare le piastre a 96 pozzetti per 3 giorni (37 ° C, 5% diossido di carbonioIde, umidità del 95%).
4. Ispezionare la presenza di sferoidi multicellulari a cellule miste al centro e al fondo dei singoli pozzetti, sotto la microscopia leggera.
   NOTA: In una proiezione microscopica bidimensionale, questi sferoidi appariranno a forma circolare ( Figura 1 ). I sferoidi dovrebbero formarsi entro 24 ore, dopo che le cellule si posizionano in piastre a 96 pozzetti ad attacco ultra-basso. Gli sferoidali dovrebbero iniziare a battere entro 48 ore, dopo che le cellule si posano in piatti a 96 pozzetti. Sferoidi che non battono non devono essere utilizzati per il bioprinting 3D per garantire che la patch cardiaca 3D bioprinted sia funzionale. L'immunofluorescenza dei sferoidi per la connxina 43 (Cx43) e la troponina può essere utilizzata per valutare la composizione cellulare e la qualità sferoidale ¹⁵ .

5. Bioprinting 3D dei tessuti cardiaci senza scaffalature

1. Caricare le piastre contenenti i sferoidi nelle riviste del bioprinter 3D a base di sferoidi.
2. Accendere il bioprinter 3D e eseguire il software bioprinting 3D.
   1. Fare clic su "Auxillary", "Preparazione dell'operazione", "Modalità d'ispezione" e poi "Home Return".
   2. Fai clic sull'icona verde sotto "Start" per iniziare l'ispezione sferoidale.
   3. Osservare che i diametri sferoidali appaiono sotto la colonna "(2) Dia (μm)" sullo schermo.
3. Per stimare il diametro medio sferoidale al 100 μm più vicino, fare clic su "Impostazioni iniziali" e immettere il diametro medio sferoidale in passo Stack Z (μm).
4. Fai clic su "Totale", il numero sotto "Livelli" dovrebbe essere nuovamente regolato automaticamente. Fai clic su "Applica" per confermare le impostazioni.
5. Fai clic su "Agra mappa arma", vai a "No. strato", seleziona lo strato desiderato per la stampa biografica 3D e disegna il disegno bioprinting 3D desiderato sulla mappa a sinistra dello schermo selezionando singole posizioni sferoidali. ClicK "Applica" per confermare il disegno bioprinting 3D.
6. Fai clic su "Ago check aghi" per avviare l'ispezione degli array di ago. Se l'array dell'ago è fuori fuoco, i valori di ingresso in "OffsetZ (μm)" variano da 0 a 500 μm per regolare la messa a fuoco della macchina, a partire da 500 μm e diminuendo di 100 μm a 0 μm.
7. Fare clic su "Parametri di ispezione", "Tipo 1" e impostare "Diametro (μm)" nel campo di diametro desiderato. Impostare "Roundness (%)" e "Smoothness (%)" alle percentuali desiderate. Fai clic su "Applica" per confermare le impostazioni.
   NOTA: qui i diametri sferoidi sono stati impostati da 450 μm a 550 μm. "Roundness (%)" e "Smoothness (%)" sono la valutazione calcolata dal calcolatore di ogni sferoide individuale. Qui le impostazioni utilizzate per "Rotondità (%)" sono del 60% e "Lisezza (%)" è del 70%.
8. Fare clic su "Presence" e aggiornare "Diametro (μm)" alla stessa impostazioneS nel passaggio precedente. Fai clic su "Applica" per confermare le impostazioni.
9. Fai clic su "Modalità stack", quindi l'icona verde in "Start" per iniziare lo sferoid pick up usando l'ugello del bioprinter 3D in aspirazione e posizionando sferoidi in posizioni specifiche in un array di ago.
   NOTA: Per una patch cardiaca composta da 81 sferoidi (9 sferoidi x 9 sferoidi), il bioprinting 3D dovrebbe richiedere circa 20-30 minuti.
10. Dopo la bioprinting, utilizzando pinze sterili, raccogliere l'array di ago contenente la patch bioprintata 3D e trasferirlo in un bicchiere da 250 mL contenente 150 ml di supporti RPMI / B-27.
11. Incubare la patch bioprintata 3D con l'ago per 3 giorni (37 ° C, 5% di anidride carbonica, umidità del 95%).

6. Rimozione della patch 3D Bioprinted dall'array degli aghi e dalla maturazione della patch

1. Dopo 3 giorni di incubazione, con una mano alla base dell'array dell'ago e l'altra sulla copertura in plastica sotto tPatch, scivolare delicatamente il coperchio in plastica verso l'alto per rimuovere la patch bioprintata 3D dall'array dell'ago.
   NOTA: La lubrificazione con soluzione salina fosfatizzata (PBS) può essere applicata agli aghi appena prima di questa fase, se necessario, per una rimozione più agevole e più facile.
2. Usando una coppia di pinze sterili, raccogliere la copertura in plastica con la patch 3D bioprintata e trasferire la patch e la copertura in un contenitore da 35 mm contenente supporti cella RPMI / B-27.
3. Scuotete delicatamente la copertura in plastica con la patch nei supporti cella RPMI / B-27, con le pinze che tengono ancora sul coperchio in plastica per rilasciare la patch nei supporti.
4. Ispezionare la patch bioprinted 3D in microscopia leggera per visualizzare se sta battendo per garantire che la patch bioprinted 3D sia funzionale.
5. Incubare la patch bioprintata 3D nel piatto da 35 mm per 3 giorni o più (37 ° C, 5% anidride carbonica, umidità del 95%).
   NOTA: Dopo 3 giorni, i sferoidi si fondono insieme ei fori inLa patch, dove erano gli aghi, non dovrebbe più essere visibile.

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Risultati

Alla fine del punto 4.4 (co-cultura), le cellule in ciascun pozzetto dovrebbero aggregarsi nella parte inferiore delle piastre a basso profilo a 96 pozzetti ad attacco ultra-basso per formare sferoidi per gravità. Questi sferoidi contengono HiPSC-CM, HCFs e HUVECs e possono essere sottoposti a ispezione visiva sotto microscopia leggera, dove devono apparire circolari per proiezione bidimensionale ( Figura 1 ). Alla fine del passo 6.3, la patch cardiaca 3D b...

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Discussione

It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.

One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Invitrogen	A1413202
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher	15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125%	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell Media	Invitrogen	11875-093	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement	Thermo Fisher	17504044	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type)	Sciencell	6310
Human umbilical vein endothelial cells	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antibody	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher	P36935