Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

Resumo

Este protocolo descreve a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem o uso de biomateriais. Os remendos cardíacos bioprinted 3D apresentam integração mecânica de esferóides componentes e são altamente promissores na regeneração do tecido cardíaco e como modelos 3D de doenças cardíacas.

Resumo

Este protocolo descreve a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem o uso de biomateriais, utilizando apenas células. Os cardiomiócitos, as células endotélias e os fibroblastos são primeiro isolados, contados e misturados às proporções de células desejadas. Eles são co-cultivados em poços individuais em placas de 96 poços de ultra-baixa fixação. Dentro de 3 dias, formando esferóides. Esses esferóides são então apanhados por um bico com aspiração a vácuo e montados em uma agulha com uma bioprantia 3D. Os esferóides são então autorizados a fundir na disposição da agulha. Três dias após a bioprinção em 3D, os esferóides são removidos como um remendo intacto, que já está espancando espontaneamente. Os remendos cardíacos bioprinted 3D apresentam integração mecânica de esferóides componentes e são altamente promissores na regeneração do tecido cardíaco e como modelos 3D de doenças cardíacas.

Introdução

Existem muitos métodos diferentes de bioprinção 3D ^{1 , 2 , 3} . A bioprinção em 3D é freqüentemente classificada pela tecnologia de impressão ¹ , com exemplos como bioprintagem a jato de tinta, bioprinção de microextrusão, bioprinção assistida a laser, uma combinação de métodos ou abordagens mais recentes. A bioprinção 3D também pode ser classificada em métodos não dependentes de andaimes ou dependentes de andaimes ⁴ . A maioria dos métodos de bioprinção em 3D são dependentes de andaimes, onde há necessidade de biomateriais, por exemplo , bioinks ⁵ ou andaimes ⁶ . No entanto, a bioprinção 3D dependente do andaime enfrenta muitos problemas e limitações ^{4 , 7} , como a imunogenicidade do material de andaimes, o custo dos bioinks proprietários, a velocidade lenta e a toxicidade dos produtos de degradação.

ScafA engenharia de tecido cardíaco sem dobra usando esferóides foi tentada ⁸ , com o potencial de superar essas desvantagens da engenharia de tecido dependente de andaimes. No entanto, como reconhecido pelos autores nesse artigo, foi difícil manipular e posicionar robustos esferoides em locais fixos, no processo de biofabricação. O uso concomitante de bioprinção 3D e engenharia de tecido à base de esferóides tem o potencial de superar essas dificuldades. Neste protocolo, descrevemos a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem outros biomateriais, utilizando apenas células na forma de esferóides.

As bioprinteiras 3D baseadas em esferóides sem cadastro ⁹ possuem a capacidade de retirar esferóides individuais usando aspiração a vácuo e colocá-los em uma disposição de agulhas. O conceito de posicionamento de esferóides em uma disposição de agulhas em bioprinção 3D, é inspirado no uso de matrizes de agulhas (conhecidas como " kenzan ") no antigo JapaNese arte de arranjo de flores, ikebana. Este sistema permite que os esferóides sejam posicionados com precisão em qualquer configuração e resulte em esferóides individuais fundindo em um curto período para criar um tecido 3D bioprinted. Este método permite que os esferóides sejam manipulados com facilidade, com implicações potenciais para o futuro da biofabricação de órgãos isentos de andaimes.

Protocolo

1. Preparação de cardiomiócitos

1. Gerar e cultivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) em placas de 6 poços revestidas com a matriz da membrana basal como descrito ¹⁰ .
2. Diferencie o HiPSCs em cardiomiócitos derivados de HiPSC (HiPSC-CMs) utilizando métodos previamente descritos ^{11 , 12} .
3. No dia 19 após a diferenciação, isolar os cardiomiócitos usando 2 mL de tripsina / EDTA 0,05% em cada poço durante 5 minutos à temperatura ambiente.
4. Monitore os cardiomiócitos sob um microscópio óptico para verificar a dissociação celular.
5. Neutralize Trypsin usando 2 mL de inibidor de tripsina 0,0125%.
6. Coloque os cardiomiócitos isolados e transfira-os para um tubo cônico de 50 mL usando um enchimento de pipeta motorizado.
7. Centrifugar a suspensão celular durante 5 min a 250 xg à temperatura ambiente para obter um grânulo.
8. Ressuspender o sedimento em 5 mL de Roswell ParkMeio celular do Instituto Memorial (RPMI) suplementado com B-27 (mídia celular RPMI / B-27).
9. Pipetar 20 μL de células em meio celular e manchar com uma quantidade igual de 0,4% solução de Trypan Blue.
10. Use um contador de células automatizado ou um hemocitômetro manual para contar e obter a concentração ea viabilidade celular da suspensão celular.

2. Preparação de fibroblastos

1. Inicie a linha celular ^{13 do grupo de} fibroblasto cardíaco humano (HCF) (tipo ventricular adulto).
2. Passar e isolá-los de acordo com os protocolos de cultivo de HCF ¹³ .
3. Pipetar 20 μL de células em meio celular e manchar com uma quantidade igual de solução de Trypan Blue 0,4%.
4. Use um contador de células automatizado ou um hemocitômetro manual para contar e obter a concentração e a viabilidade celular da nova suspensão celular.

3. Preparação de células endoteliais

1. Inicie o umb humanoLinha de células endoteliais da veia ilíaca (HUVEC) como descrito ¹⁴ . Passar e isolá-los de acordo com os protocolos de cultura HUVEC conforme descrito ¹⁴ .
2. Pipetar 20 μL de células em meio celular e manchar com uma quantidade igual de 0,4% solução de Trypan Blue.
3. Use um contador de células automatizado ou um hemocitômetro manual para contar e obter a concentração ea viabilidade celular da suspensão celular.

4. Co-cultura:

1. Misture os três tipos de células (HiPSC-CM, HCFs e HUVECs) em meios celulares RPMI / B-27 para gerar um estoque de solução celular mista em um tubo cônico de 50 mL, em uma relação de células HiPCC-CM: HCF: HUVEC de 70:15:15 e concentração de 165,000 células por mL.
2. Distribua a solução de células misturadas para placas de fundo em U de 96 poços de ultra-baixa em 200 μL por poço, ou 33,000 células por poço, usando uma pipeta multicanal.
3. Incubar os pratos de 96 poços durante 3 dias (37 ° C, 5% de diox de carbonoIde, 95% de umidade).
4. Inspecione a presença de esferóides multicelulares de células misturadas no centro e na parte inferior dos poços individuais, sob microscopia óptica.
   NOTA: Em uma projeção microscópica bidimensional, esses esferóides aparecerão de forma circular ( Figura 1 ). Os esferóides devem se formar dentro de 24 h, após a semeadura de células em placas de 96 poços de inserção ultra baixa. Os esferóides devem começar a bater dentro de 48 h, após a semeadura de células em placas de 96 poços. Os esferóides que não estão batendo não devem ser usados ​​para a bioprinção em 3D para garantir que o patch cardiológico 3D bioprinted final seja funcional. A imunofluorescência de esferóides para a conexina 43 (Cx43) e troponina pode ser utilizada para avaliar a composição e a qualidade celular esferoidais ¹⁵ .

5. Bioprintagem 3D de tecidos cardíacos isentos de andaimes

1. Carregue as placas que contêm os esferoides nas revistas da bioprintura 3D à base de esferóides isqueiro.
2. Ligue o bioprinter 3D e execute o software de bioprinção 3D.
   1. Clique em "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspect Mode" e depois "Home Return".
   2. Clique no ícone verde em "Iniciar" para iniciar a inspeção esferóide.
   3. Observe se os diâmetros esferoidais aparecerão na coluna "(2) Dia (μm)" na tela.
3. Para estimar o diâmetro esferoide médio para os 100 μm mais próximos, clique em "Configurações iniciais" e digite o diâmetro médio da esferóide no passo Stack Z (μm).
4. Clique em "Total", o número em "Camadas" deve ser ajustado automaticamente. Clique em "Aplicar" para confirmar as configurações.
5. Clique em "Mapa da Arraise da Agulha", vá para "No. da Camada", selecione a camada desejada para a biologia biológica em 3D e desenhe o desenho de bioprinção 3D desejado no mapa à esquerda da tela, selecionando posições esferoidais individuais. ClicK "Aplicar" para confirmar o desenho 3D bioprinting.
6. Clique em "Controle da Armazenagem da Agulha" para iniciar a inspeção da matriz de agulhas. Se a disposição da agulha estiver fora de foco, introduza valores em "OffsetZ (μm)", variando de 0 a 500 μm para ajustar a focagem da câmera, começando com 500 μm e diminuindo de 100 μm a 0 μm.
7. Clique em "Parâmetros de inspeção", "Tipo 1" e defina "Diâmetro (μm)" para a faixa de diâmetro desejada. Defina "Redondeza (%)" e "Suavidade (%)" para as porcentagens desejadas. Clique em "Aplicar" para confirmar as configurações.
   NOTA: Aqui os diâmetros esferoidais foram ajustados de 450 μm a 550 μm. "Roundness (%)" e "Smoothness (%)" são calculados pela computação de cada esferóide individual. Aqui, as configurações usadas para "Roundness (%)" são 60% e "Loughness (%)" é de 70%.
8. Clique em "Presença" e atualize o "Diâmetro (μm)" para a mesma configuraçãoS no passo anterior. Clique em "Aplicar" para confirmar as configurações.
9. Clique em "Modo de pilha", depois no ícone verde em "Iniciar" para iniciar a retirada de esferóides usando o bocal da bioprítica 3D por aspiração de vácuo e colocação de esferoides em locais específicos em uma disposição de agulhas.
   NOTA: Para um adesivo cardíaco consistindo de 81 esferóides (9 esferóides x 9 esferóides), a bioprinção 3D deve demorar cerca de 20 a 30 minutos.
10. Após a bioprintagem, usando fórceps esterilizados, pegue o conjunto de agulhas contendo o patch 3D bioprinted e transfira-o para um copo esterilizado de 250 mL contendo 150 mL de meio celular RPMI / B-27.
11. Incubar o patch 3D bioprinted com o conjunto de agulhas durante 3 dias (37 ° C, 5% de dióxido de carbono, 95% de umidade).

6. Remoção do Patch Bioprinted 3D da Matriz de Agulhas e Maturação de Patch

1. Após 3 dias de incubação, com uma mão na base do conjunto de agulhas e a outra na tampa de plástico sob tEle patch, deslize suavemente a tampa de plástico para cima para remover o patch 3D bioprinted da matriz de agulhas.
   NOTA: A lubrificação com solução salina tamponada com fosfato (PBS) pode ser aplicada às agulhas imediatamente antes desta etapa, conforme necessário, para uma remoção mais suave e fácil.
2. Usando um par de pinças estéreis, pegue a tampa de plástico com o remendo bioprinológico 3D em cima dele e transfira o patch e a tampa de plástico para um prato de 35 mm contendo mídia celular RPMI / B-27.
3. Agite suavemente a tampa de plástico com o patch na mídia celular RPMI / B-27, com a pinça ainda segurando a tampa de plástico, para liberar o patch na mídia.
4. Inspecione o patch 3D bioprinted sob microscópio de luz para visualizar se está batendo para garantir que o patch 3D bioprinted seja funcional.
5. Incubar o patch 3D bioprinted no prato de 35 mm por 3 dias ou mais (37 ° C, 5% de dióxido de carbono, 95% de umidade).
   NOTA: Após 3 dias, os esferóides se fundem e os orifícios emO patch, onde as agulhas estavam, não deveria mais ser visível.

Resultados

No final do passo 4.4 (co-cultura), as células em cada poço devem agregar no fundo das placas de fundo em U de 96 poços de montagem ultra baixa para formar esferóides por gravidade. Esses esferóides contêm hiPSC-CM, HCFs e HUVECs e podem ser vistos visualmente sob microscopia de luz, onde devem aparecer de forma circular por projeção bidimensional ( Figura 1 ). No final do passo 6.3, o remendo cardíaco bioprinted 3D deve conter vazios de tecido, dev...

Discussão

It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.

One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Invitrogen	A1413202
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher	15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125%	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell Media	Invitrogen	11875-093	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement	Thermo Fisher	17504044	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type)	Sciencell	6310
Human umbilical vein endothelial cells	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antibody	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher	P36935