יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

Summary

פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials, באמצעות תאים בלבד. Cardiomyocytes, תאים אנדותל fibroblasts מבודדים הראשון, נספר ומעורב ביחסים התא הרצוי. הם שיתוף תרבותי בארות בודדים נמוך מאוד מצורף 96-טוב צלחות. תוך 3 ימים, להכות בצורת spheroids. אלה spheroids אז הרימו ידי זרבובית באמצעות יניקה ואקום התאספו על מערך מחט באמצעות bioprinter 3D. את spheroids מותר אז כדי fuse על מחט מערך. שלושה ימים לאחר bioprinting 3D, spheroids מוסרים כתיקון שלם, אשר כבר ספונטני מכות. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.

Introduction

ישנן שיטות רבות ושונות של 3D bioprinting ^{1 , 2 , 3} . 3D bioprinting מסווגת לעתים קרובות על ידי טכנולוגיית הדפסה ¹ , עם דוגמאות כגון bioprinting דיו, biocrinting microextrusion, לייזר בסיוע bioprinting, שילוב של שיטות, או גישות חדשות יותר. 3D bioprinting יכול גם להיות מסווגים לתוך ללא פיגומים או שיטות פיגום תלוי ⁴ . רוב השיטות של bioprinting 3D הם תלויים פיגום, שם יש צורך biomaterials, למשל ביוינקים ⁵ או פיגומים ⁶ . עם זאת, תלוי 3D פיגום bioprinting פנים בעיות רבות ומגבלות ^{4 , 7} , כגון immunogenicity של חומר פיגום, עלות bioinks קניינית, מהירות איטית ורעילות של השפלה מוצרים.

סקאףהנדסת רקמת לב ללא קפל באמצעות spheroids כבר ניסה ⁸ , עם פוטנציאל להתגבר על החסרונות האלה של הנדסת רקמות תלוי פיגום. עם זאת, כפי שהוכיחו על ידי המחברים באותו נייר, זה היה קשה לטפל בחוזקה מיקום spheroids במקומות קבועים, בתהליך של biofabrication. השימוש המלווה של bioprinting 3D ו הנדסת רקמות מבוסס spheroid יש פוטנציאל להתגבר על קשיים אלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים bioprinting 3D של רקמת לב ללא biomaterials אחרים, תוך שימוש רק בתאים בצורת spheroids.

פיגומים מבוססי spheroid מבוססי spheroid 3D יש את היכולת להרים spheroids בודדים באמצעות שאיבה ואקום ולמקם אותם על מערך מחט. הרעיון של מיקום spheroids על מערך מחט ב bioprinting 3D, הוא בהשראת השימוש של מערכי מחט (המכונה " קנזאן ") של Japa העתיקהNese, אומנות, סידור פרחים, ikebana. מערכת זו מאפשרת spheroids להיות ממוקם במדויק בכל תצורה ותוצאות הספירואידים הפרט fusion יחד לאורך תקופה קצרה כדי ליצור רקמות bioprinted 3D. שיטה זו מאפשרת spheroids להיות מניפולציה בקלות, עם השלכות פוטנציאליות לעתיד של ביו-אפורציה אורגנית ללא פיגום.

Protocol

1. הכנת Cardiomyocytes

1. יצירת ותרבות האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) על 6-גם צלחות מצופה מטריצה ​​במרתף במרתף כמתואר ¹⁰ .
2. הבדל hiPSCs לתוך cardiomyocytes hiPSC נגזר (hiPSC-CMs) באמצעות שיטות המתוארות לעיל ^{11 , 12} .
3. ביום 19 לאחר הבחנה, לבודד את cardiomyocytes באמצעות 2 מ"ל של טריפסין / EDTA 0.05% בכל טוב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. צג cardiomyocytes תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לצפות דיסוציאציה התא.
5. לנטרל טריפסין באמצעות 2 מ"ל של מעכב טריפסין 0.0125%.
6. בריכת cardiomyocytes מבודדים ולהעביר אותם לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי אחד באמצעות מילוי פיפטה ממונע.
7. צנטריפוגה ההשעיה התא עבור 5 דקות ב 250 xg בטמפרטורת החדר להשיג גלולה.
8. Resuspend גלולה ב 5 מ"ל של רוזוול פארקמדיה ממוריאל (RPMI) התקשורת התא בתוספת B-27 (RPMI / B-27 התקשורת התא).
9. פיפטה 20 μL של תאים בתקשורת התא כתם עם כמות שווה של פתרון 0.4% Trypan כחול.
10. השתמש מונה תא אוטומטי או hemocytometer ידנית לספור ולקבל את הריכוז ואת הכדאיות התא ההשעיה התא.

2. הכנת פיברובלסטים

1. ליזום fibroblast הלב של הלב (HCF) (סוג החדר הבוגר) קו התא ¹³ .
2. המעבר לבודד אותם בהתאם HCF פרוטוקולים culturing ¹³ .
3. פיפטה 20 μL של תאים בתקשורת התא כתם עם כמות שווה של פתרון טריפאן כחול 0.4%.
4. השתמש מונה תא אוטומטי או hemocytometer ידנית לספור ולקבל את הריכוז ואת הכדאיות התא ההשעיה תא חדש.

3. הכנת תאים אנדותל

1. ליזום את המטלית האנושיתוריאלי של תא תא אנדותלי (HUVEC) כמתואר ¹⁴ . המעבר לבודד אותם בהתאם HUVEC פרוטוקולים culturing כמתואר ¹⁴ .
2. פיפטה 20 μL של תאים בתקשורת התא כתם עם כמות שווה של פתרון 0.4% Trypan כחול.
3. השתמש מונה תא אוטומטי או hemocytometer ידנית לספור ולקבל את הריכוז ואת הכדאיות התא ההשעיה התא.

4. שיתוף תרבות:

1. מערבבים את שלושת סוגי התאים (hiPSC-CM, HCFs ו- HUVECs) בתקשורת RPMI / B-27 כדי ליצור מלאי של תמיסת תאים מעורבים בצינור חרוטי 50 מ"ל, ב- hiPSC-CM: HCF: יחס תא HUVEC של 70:15:15 וריכוז של 165,000 תאים לכל מ"ל.
2. להפיץ את הפתרון התא המעורב לתוך מצורף נמוך במיוחד 96-טוב צלחות U- התחתונה ב 200 μL לכל טוב, או 33,000 תאים לכל טוב, באמצעות פיפטה רב ערוצי.
3. דגירה צלחות 96-היטב במשך 3 ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצניאידיאל, לחות 95%).
4. בדיקת נוכחות של ספיראידים תאיים רב תאיים מעורבים במרכז ובתחתית בארות בודדים, תחת מיקרוסקופ אור.
   הערה: בהקרנה מיקרוסקופית דו מימדי, אלה spheroids יופיע עגול בצורת ( איור 1 ). Spheroids צריך טופס בתוך 24 שעות, לאחר זריעת תאים לתוך נמוך מאוד מצורף 96-טוב צלחות. Spheroids צריך להתחיל להכות בתוך 48 שעות, לאחר זריעת תאים לתוך צלחות 96-היטב. Spheroids שאינם מכות לא צריך לשמש 3D bioprinting כדי להבטיח כי הסופי bioprinted 3D תיקון הלב הוא פונקציונלי. Immunofluorescence של spheroids עבור connexin 43 (Cx43) וטרופונין ניתן להשתמש כדי להעריך הרכב הסלולר spheroid ואיכות ¹⁵ .

5. 3D ביופרינטינג של רקמות ללא קרם רקמות

1. טען את הצלחות המכילות את spheroids לתוך מגזינים של bioprinter ללא פיגום 3D מבוסס פיגום.
2. הפעל את bioprinter 3D ולבצע את התוכנה bioprinting 3D.
   1. לחץ על "עזר", "מבצע הכנה", "בדיקת מצב", ולאחר מכן "דף הבית לחזור".
   2. לחץ על הסמל הירוק תחת "התחל" כדי להתחיל בדיקה spheroid.
   3. צפה בקטעי spheroid להופיע מתחת לעמודה "(2) Dia (מיקרומטר)" על המסך.
3. כדי להעריך את קוטר spheroid הממוצע של 100 מיקרומטר הקרוב, לחץ על "הגדרות ראשוניות" והזן את קוטר spheroid הממוצע לתוך המגרש Z ערמה (מיקרומטר).
4. לחץ על "סה"כ", המספר תחת "שכבות" צריך להתאים באופן אוטומטי. לחץ על "החל" כדי לאשר את ההגדרות.
5. לחץ על "מפת מערך מחט", עבור "שכבה לא", בחר את השכבה הרצויה עבור bioprinting 3D, ולצייר את העיצוב bioprintinting 3D הרצוי על המפה בצד שמאל של המסך על ידי בחירת עמדות ספרואיד בודדים. קלישK "החל" כדי לאשר את העיצוב bioprinting 3D.
6. לחץ על "מחט מערך בדוק" כדי להתחיל בדיקת מערך המחט. אם מערך המחט הוא מתוך המוקד, ערכי קלט לתוך "OffsetZ (מיקרומטר)", החל מ 0 עד 500 מיקרומטר כדי להתאים את המיקוד המצלמה, החל עם 500 מיקרומטר ירידה של 100 מיקרומטר עד 0 מיקרומטר.
7. לחץ על "פרמטרים ביקורת", "סוג 1", ולהגדיר "קוטר (מיקרומטר)" אל טווח קוטר הרצוי. הגדר "סיבוב (%)" ו "חלקות (%)" לאחוזים הרצוי. לחץ על "החל" כדי לאשר את ההגדרות.
   הערה: כאן בקוטר spheroid נקבעו מ 450 מיקרומטר עד 550 מיקרומטר. "סיבוב (%)" ו "חלקות (%)" הם מחשב מחושב הערכה של כל הספרואיד הפרט. כאן, ההגדרות המשמשות "עגול (%)" הוא 60% ו "חלקות (%)" הוא 70%.
8. לחץ על "נוכחות" ועדכן את "קוטר (מיקרומטר)" לאותה הגדרהS בשלב הקודם. לחץ על "החל" כדי לאשר את ההגדרות.
9. לחץ על "מצב מחסנית", ולאחר מכן את הסמל הירוק תחת "התחל" כדי להתחיל spheroid להרים באמצעות הזרבובית של bioprinter 3D על ידי שאיבת ואקום, ואת המיקום של spheroids במקומות ספציפיים במערך מחט.
   הערה: עבור תיקון לב המורכב 81 spheroids (9 spheroids x 9 spheroids), 3D bioprinting צריך לקחת על 20 עד 30 דקות.
10. לאחר bioprinting, באמצעות מלקחיים סטרילית, להרים את מחט מערך המכיל את התיקון bioprinted 3D ולהעביר אותו לתוך כוס מ"ל סטרילי 250 מ"ל המכיל 150 מ"ל של RPMI / B-27 התקשורת התא.
11. דגירה תיקון 3D bioprinted עם מערך מחט במשך 3 ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, לחות 95%).

6. הסרת תיקון 3D Bioprinted ממערך מחט תיקון התבגרות

1. לאחר 3 ימים של הדגירה, עם יד אחת בבסיס מערך המחט והשני על כיסוי פלסטיק תחת tהוא תיקון, בעדינות להחליק את כיסוי הפלסטיק כלפי מעלה כדי להסיר את תיקון 3D bioprinted ממערך המחט.
   הערה: סיכה עם מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) ניתן להחיל על המחטים רק לפני שלב זה, לפי הצורך, להסרה חלקה וקלה יותר.
2. באמצעות זוג מלקחיים סטרילית, להרים את כיסוי פלסטיק עם תיקון bioprinted 3D על גבי זה ולהעביר את התיקון ואת כיסוי פלסטיק לתוך צלחת 35 מ"מ המכיל RPMI / B-27 התקשורת התא.
3. נער בעדינות את כיסוי הפלסטיק עם המדבקה בתקשורת ה - RPMI / B-27, עם המלקחיים המחזיקים עדיין בכיסוי הפלסטיק, כדי לשחרר את התיקון לתקשורת.
4. בדוק את התיקון bioprinted 3D תחת מיקרוסקופ אור לדמיין אם זה מכות על מנת להבטיח כי תיקון bioprinted 3D הוא פונקציונלי.
5. דגירה תיקון 3D bioprinted בצלחת 35 מ"מ במשך 3 ימים או יותר (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, לחות 95%).
   הערה: לאחר 3 ימים, spheroids להתמזג יחד את החורים באת הטלאי, שבו היו המחטים, כבר לא יהיה גלוי.

תוצאות

בסוף שלב 4.4 (שיתוף תרבות), התאים בכל טוב צריך צבירה בתחתית של מצורף נמוך במיוחד 96-טוב U-bottom צלחות כדי ליצור spheroids על ידי כוח הכבידה. אלה spheroids להכיל hiPSC-CM, HCFs, ו HUVECs, והוא יכול להיות בחן ויזואלית תחת מיקרוסקופ אור, שם הם צריכים להופיע מעגלית על ידי היטל דו מ?...

Discussion

It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.

One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Invitrogen	A1413202
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher	15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125%	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell Media	Invitrogen	11875-093	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement	Thermo Fisher	17504044	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type)	Sciencell	6310
Human umbilical vein endothelial cells	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antibody	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher	P36935