Создание сердечной ткани, обеспечивающей механическую интеграцию сфероидов с использованием 3D-биопреобразования

Резюме

Этот протокол описывает трехмерную биотрансляцию сердечной ткани без использования биоматериалов. 3D-биотрансгированные сердечные патч демонстрируют механическую интеграцию компонентов сфероидов и являются многообещающими в регенерации сердечной ткани и в качестве трехмерных моделей сердечных заболеваний.

Аннотация

Этот протокол описывает трехмерную биотрансляцию сердечной ткани без использования биоматериалов, используя только клетки. Кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты сначала выделяют, подсчитывают и смешивают при желательных соотношениях клеток. Они совместно культивируются в отдельных лунках в планшетах с ультра-низкой насадкой с 96 лунками. В течение 3 дней формируются бейбинг-сфероиды. Затем эти сфероиды подбирают с помощью вакуумного всасывания и собирают на игольчатой ​​матрице с использованием 3D-биопринтера. Затем сфероидам разрешается сливаться с иглой. Через три дня после трехмерного биотрансляции сфероиды удаляются как неповрежденный патч, который уже спонтанно избивается. 3D-биотрансгированные сердечные патч демонстрируют механическую интеграцию компонентов сфероидов и являются многообещающими в регенерации сердечной ткани и в качестве трехмерных моделей сердечных заболеваний.

Введение

Существует много разных методов 3D-биотрансляции ^{1 , 2 , 3} . 3D-биотрансляция часто классифицируется с помощью технологии печати ¹ , например, с использованием биотрансформации для струйной печати, биопреобразования микроэкструзии, биопринтинга с использованием лазера, комбинации методов или более новых подходов. 3D-биотрансляция также может быть отнесена к незамерзающим или зависящим от леса методам ⁴ . Большинство методов 3D-биопринтинга являются зависимыми от лесов, где существует потребность в биоматериалах, например биоиндикаторах ⁵ или лесах ⁶ . Тем не менее, зависящий от лесов трехмерный биотрансляции сталкивается со многими проблемами и ограничениями ^{4 , 7} , такими как иммуногенность материала лесов, стоимость патентованных биоиндикаторов, низкая скорость и токсичность продуктов разложения.

ScafБыла предпринята попытка создания бессердечной кардиальной ткани с использованием сфероидов ⁸ с потенциалом преодоления этих недостатков инженерной инженерии, зависящей от лесов. Однако, как признали авторы в этой статье, было трудно надежно обрабатывать и позиционировать сфероиды в фиксированных местах в процессе биообработки. Сопутствующее использование 3D-биопреобразования и тканевой инженерии на основе сфероидов может преодолеть эти трудности. В этом протоколе мы описываем 3D-биотрансляцию сердечной ткани без других биоматериалов, используя только клетки в форме сфероидов.

3D-биопринтеры ⁹ на основе сфероидов, основанные на основах, имеют возможность подбирать отдельные сфероиды с помощью вакуумного отсоса и размещать их на игольчатой ​​матрице. Концепция позиционирующих сфероидов на игольчатой ​​матрице в 3D-биотрансляции основана на использовании игольчатых массивов (известных как « kenzan ») в древней ДжапеНежное искусство цветочной композиции, икебана. Эта система позволяет точно расположить сфероиды в любой конфигурации и приводит к тому, что отдельные сфероиды сплавляются вместе в течение короткого периода времени для создания трехмерной ткани с биотрансформацией. Таким образом, этот метод позволяет легко манипулировать сфероидами с потенциальными последствиями для будущего биообработки биомассы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Получение кардиомиоцитов

1. Генерировать и культивировать индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) на 6-луночных планшетах, покрытых матрицей подвальной мембраны, как описано ¹⁰ .
2. Различают hiPSC в hiPSC-производные кардиомиоциты (hiPSC-CMs) с использованием ранее описанных методов ^{11 , 12} .
3. На 19-й день после дифференцировки выделите кардиомиоциты, используя 2 мл трипсина / EDTA 0,05% в каждой лунке в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Контролируйте кардиомиоциты под оптическим микроскопом для наблюдения за диссоциацией клеток.
5. Нейтрализуйте трипсин, используя 2 мл ингибитора трипсина 0,0125%.
6. Слейте изолированные кардиомиоциты и перенесите их в одну коническую трубку объемом 50 мл с помощью моторизированного наполнителя для пипетки.
7. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 мин при 250 × g при комнатной температуре, чтобы получить гранулу.
8. Ресуспендируют гранулу в 5 мл Roswell ParkMemorial Institute (RPMI), дополненную B-27 (ячейками среды RPMI / B-27).
9. Пипетируют 20 мкл клеток в клеточных средах и окрашивают равным количеством 0,4% раствора Trypan Blue.
10. Используйте счетчик автоматических клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения концентрации и жизнеспособности клеток суспензии клеток.

2. Получение фибробластов

1. Инициировать клеточную линию ¹³ кардиального фибробласта (HCF) (взрослого желудочкового типа).
2. Пройдите и изолируйте их в соответствии с протоколами культивирования HCF ¹³ .
3. Пипетируют 20 мкл клеток в клеточной среде и окрашивают равным количеством раствора Trypan Blue 0,4%.
4. Используйте счетчик автоматических клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения концентрации и жизнеспособности клеток новой клеточной суспензии.

3. Получение эндотелиальных клеток

1. Инициировать человекаЛинией эндотелиальных клеток лилии (HUVEC), как описано ¹⁴ . Пройдите и изолируйте их в соответствии с протоколами культивирования HUVEC, как описано ¹⁴ .
2. Пипетируют 20 мкл клеток в клеточных средах и окрашивают равным количеством 0,4% раствора Trypan Blue.
3. Используйте счетчик автоматических клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения концентрации и жизнеспособности клеток суспензии клеток.

4. Совместная культура:

1. Смешайте три типа клеток (hiPSC-CM, HCFs и HUVEC) в средах с ячейками RPMI / B-27, чтобы создать запас раствора смешанных клеток в конической трубке объемом 50 мл при соотношении клеток hiPSC-CM: HCF: HUVEC 70:15:15 и концентрации 165 000 клеток на мл.
2. Распределите раствор смешанных клеток в планшеты с ультра-низким прилипанием с 96 лунками на 200 мкл на лунку или 33 000 клеток на лунку с использованием многоканальной пипетки.
3. Инкубируйте 96-луночные планшеты в течение 3 дней (37 ° С, 5% диоксида углерода, Влажность 95%).
4. Осмотрите наличие смешанных клеточных многоклеточных сфероидов в центре и в нижней части отдельных лунок под световой микроскопией.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В двумерной микроскопической проекции эти сфероиды окажутся круглыми по форме ( рис. 1 ). Сфероиды должны образовываться в течение 24 ч, после посева клеток в пластинки с 96 лунками с ультранизким наложением. Сфероиды должны начинать избивать в течение 48 часов, после посева клеток в 96-луночные планшеты. Сфероиды, которые не избивают, не должны использоваться для 3D-биотрансляции, чтобы гарантировать, что конечный трехмерный биотрансферный пластырь функционирует. Иммунофлуоресценцию сфероидов для коннексина 43 (Cx43) и тропонина можно использовать для оценки состава и качества сфероида.

5. 3D Bioprinting без каркасных сердечных тканей

1. Загрузите пластины, содержащие сфероиды, в журналы бескаркасного сферического 3D-биопринтера.
2. Включите 3D-биопринтер и выполните программное обеспечение для трехмерного биотрансляции.
   1. Нажмите «Вспомогательный», «Подготовка к операции», «Режим проверки», а затем «Возврат домой».
   2. Нажмите зеленую иконку в разделе «Старт», чтобы начать проверку сфероида.
   3. Следите за тем, чтобы диаметры сфероидов отображались под колонкой «(2) Dia (μm)» на экране.
3. Чтобы оценить средний диаметр сфероида до ближайших 100 мкм, нажмите «Начальные настройки» и введите средний диаметр сфероида в шаг Stack Z (мкм).
4. Нажмите «Всего», номер под «Слои» должен автоматически отрегулироваться. Нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки.
5. Нажмите «Карта массивов игл», перейдите к «Layer No», выберите нужный слой для 3D-биотрансляции и нарисуйте желаемый 3D-проект bioprinting на карте слева от экрана, выбрав отдельные положения сфероида. ClicK «Применить», чтобы подтвердить дизайн 3D-биотрансляции.
6. Нажмите «Проверка решетки игл», чтобы начать проверку игольной матрицы. Если игольчатая матрица находится вне фокуса, введите значения «OffsetZ (μm)» в диапазоне от 0 до 500 мкм, чтобы отрегулировать фокусировку камеры, начиная с 500 мкм и уменьшаясь на 100 мкм до 0 мкм.
7. Нажмите «Параметры проверки», «Тип 1» и установите «Диаметр (мкм)» в нужный диапазон диаметров. Установите «Roundness (%)» и «Smoothness (%)» на желаемые проценты. Нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь диаметры сфероида были установлены от 450 до 550 мкм. «Круглость (%)» и «Гладкость (%)» - это компьютерная расчетная оценка каждого отдельного сфероида. Здесь настройки, используемые для «Roundness (%)», составляют 60%, а «Гладкость (%)» - 70%.
8. Нажмите «Присутствие» и обновите «Диаметр (мкм)» до той же настройкиС на предыдущем шаге. Нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки.
9. Нажмите «Режим стека», затем зеленый значок «Старт», чтобы начать сфероид, забрать с помощью сопла 3D-биопринтера вакуумным всасыванием и разместить сфероиды в определенных местах в игольной решетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для сердечного патча, состоящего из 81 сфероида (9 сфероидов x 9 сфероидов), трехмерная биотрансляция должна занимать около 20-30 минут.
10. После биотрансляции, используя стерильные щипцы, возьмите иглу, содержащую трехмерный биотрансмент, и перенесите его в 250 мл стерильный стакан, содержащий 150 мл среды RPMI / B-27.
11. Инкубируйте трехмерный биотрансмент с игольной матрицей в течение 3 дней (37 ° C, 5% углекислого газа, влажность 95%).

6. Удаление 3D Bioprinted Patch из массива игл и паттерна

1. После 3 дней инкубации, с одной стороны, у основания иглы, а другой на пластиковой крышке под tОн патч, осторожно сдвиньте пластиковую крышку вверх, чтобы удалить трехмерный биотрансмент из массива игл.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Смазывание забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) может быть применено к иглам непосредственно перед этим шагом, если необходимо, для более плавного и легкого удаления.
2. Используя пару стерильных щипцов, поднимите пластиковую крышку с помощью трехмерного биотрансляционного патча поверх нее и перенесите патч и пластиковую крышку в 35-миллиметровое блюдо, содержащее среду с ячейками RPMI / B-27.
3. Аккуратно встряхните пластиковую крышку с помощью патча в среде с ячейками RPMI / B-27, при этом щипцы все еще удерживаются на пластиковой крышке, чтобы выпустить патч в носитель.
4. Осмотрите 3D-биотрансляционный патч под световой микроскопией, чтобы визуализировать, является ли это побочным эффектом, чтобы функционировать трехмерный биотрансмент.
5. Инкубируйте трехмерный биотрансплантат в 35-миллиметровой тарелке в течение 3 дней или дольше (37 ° C, 5% углекислого газа, влажность 95%).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Через 3 дня сфероиды сливаются вместе, а отверстия вПатч, где игла была, больше не должна быть видимой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В конце этапа 4.4 (совместная культура) клетки в каждой лунке должны собираться в нижней части пластин U-образного основания с ультра-низким прикреплением с 96 лунками для образования сфероидов под действием силы тяжести. Эти сфероиды содержат hiPSC-CM, HCF и HUVEC и могут быть в?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.

One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Invitrogen	A1413202
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher	15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125%	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell Media	Invitrogen	11875-093	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement	Thermo Fisher	17504044	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type)	Sciencell	6310
Human umbilical vein endothelial cells	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antibody	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher	P36935