Un método para la obtención de secciones seriadas ultrafinas de microorganismos en microscopía electrónica de transmisión

Resumen

Este estudio presenta procedimientos confiables y fáciles para la obtención de secciones ultrafinas seriales de un microorganismo sin equipo costoso en microscopía electrónica de transmisión.

Resumen

Observación de células y componentes de la célula en tres dimensiones en el gran aumento en microscopía electrónica de transmisión requiere la preparación de secciones ultrafinas seriales de la muestra. Aunque la preparación de secciones ultrafinas seriales es considerado como muy difícil, es bastante fácil si se utiliza el método apropiado. En este documento, se muestra un procedimiento paso a paso para la obtención segura de las secciones ultrafinas seriales de microorganismos. Los puntos claves de este método son: 1) a utilizar gran parte de la muestra y ajustar el borde de la superficie y cuchillo de muestra para que sean paralelas entre sí; 2) para cortar secciones seriales en grupos y evitar dificultades en la separación de las secciones con un par de mechones de pelo al recuperar un grupo de secciones seriadas en las rejillas de ranura; 3) usar un 'lazo de retención de sección' y evitar mezclar el orden de los grupos de sección; 4) para utilizar un bucle de aumento de superficie de agua y asegúrese de que las secciones se colocan en el ápice del agua y que tocan la red en primer lugar, con el fin de colocarlos en la posición deseada sobre las rejillas; 5) para utilizar la película de soporte en un bastidor de aluminio y que sea más fácil recuperar las secciones en las rejillas y evitar el arrugamiento de la película de soporte; y 6) a utilizar un tubo de coloración y evitar romper accidentalmente las películas de soporte con las pinzas. Este nuevo método permite obtener secciones seriadas ultrafinas sin dificultad. El método permite analizar las estructuras celulares de los microorganismos en alta resolución en 3D, que no puede lograrse mediante el método automático de recogida de cinta ultramicrótomo y serie bloque-cara o viga de ion enfocada microscopía electrónica de barrido.

Introducción

Técnica de seccionamiento ultrafina serie adecuada es indispensable para el estudio de las células y los componentes de la célula tridimensionalmente en el nivel microscópico de electrones. Hemos estudiado la dinámica del cuerpo de polo del huso en el ciclo celular de las células de levadura y reveló cambios morfológicos de su ultraestructura durante el ciclo celular y el tiempo de duplicación^{1,2,3, 4,5}. En 2006, acuñó una nueva palabra 'structome' mediante la combinación de 'estructura' y '-ome' y se define como la 'información cuantitativa y tridimensional estructural de una célula entera en el nivel microscópico de electrones' ^6,7.

Por el análisis de structome, que requiere técnica de seccionamiento ultrafino serial, se encontró que una célula de levadura de Saccharomyces cerevisiae y Exophiala dermatitidis tenía unos 200.000 ribosomas^7,8, un Escherichia coli celular tenía 26.000 ribosomas⁹, un celular de la Mycobacterium tuberculosis tenía 1.700 ribosomas¹⁰ y bacterias en espiral Myojin tenían los ribosomas sólo 300¹¹. Esta información es útil en la estimación no solo de la tasa de crecimiento en cada organismo, pero también en la identificación de especies⁹.

Además, structome análisis conducido al descubrimiento de un nuevo organismo; Parakaryon myojinensis fue encontrado en el mar frente a las costa de Japón, cuya estructura de la célula fueron un intermedio entre los de procariotas y eucariotas,^12,13,14,15. En la actualidad, serie técnica de seccionamiento ultrafino se considera tan difícil que tomaría mucho tiempo al maestro. En este estudio, hemos desarrollado un método fiable en la que cualquiera puede realizar seccionamiento ultrafino serial sin dificultad.

Protocolo

Nota: Los especímenes utilizados en este estudio fueron microorganismos, propano rápidamente congelados en nitrógeno líquido, congelarán substituido en acetona que contiene tetróxido de osmio 2% y embebidos en resina epoxy^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18}.

1. preparación de película de soporte (figura 1-3)

Nota: Película de soporte Formvar color plateado está preparada usando el método de fundición en vidrio¹⁹.

1. Añadir 100 mL de 1,5% Formvar en dicloruro de etileno a un aparato de fabricación de Formvar (figura 1). Sumerja la mitad de un portaobjetos de cristal (76 x 26 x 1,3 mm) en la solución de Formvar en la columna superior del aparato presionando la solución con el aire a través de la 'a' usando una bola de caucho¹⁹.
   1. Vaciar la solución de la columna abriendo la llave de tres vías y liberación de aire a través de 'b' para reducir la presión. Sacar el portaobjetos de cristal del aparato y se secan en el aire para formar una película en la superficie de lo portaobjetos de vidrio. Usar una lámpara incandescente para acelerar el secado de la película de Formvar.
2. Después de raspar de los cuatro bordes de la película en la diapositiva de cristal con una cuchilla de afeitar (Figura 2a) y la respiración sobre el portaobjetos para facilitar la separación de la película de la diapositiva²⁰, flotan de la película de agua sumergiendo el portaobjeto en el agua lentamente en un ángulo horizontal baja (aproximadamente 10°, figura 2b).
3. Sacar con pala encima de la película de Formvar del agua usando un bastidor de aluminio (30 x 25 x 3 mm) con agujeros (4 mm de diámetro) (figura 3a). No la rejilla con la película de Formvar en un desecador hasta su uso (figura 3b).

2. Ajuste el bloque de muestra con una cuchilla de ultrasonidos y una hoja de afeitar ²¹ bajo un estereomicroscopio (figura 4)

1. Asegúrese de que hay células en la superficie del bloque mediante la observación de la punta del bloque con un microscopio de luz (figura 4a).
2. Montar el bloque de muestra en el plato (soporte del bloque) y el mandril en un recorte etapa²¹ (Figura 4b). Esta etapa de recorte tiene un mecanismo de iluminación de la parte posterior de la muestra.
3. Cortar el bloque a un tamaño de 0,7 x 1,0 mm (figuras 4C, 5D). Puesto que la resina de epoxy es muy dura, cortar los bloques primero usando una cuchilla cortadora ultrasónica. La cuchilla cortadora ultrasónica es una máquina recientemente introducida, y los bloques se recortan fácilmente. Luego cortar el bloque de más con una cuchilla de afeitar. Corte un hombro para marcar la dirección del corte (ver Figura 5D, figura 8).

3. Ajuste el bloque de muestras con cuchilla de diamante utilizando el micrótomo (figura 5)

1. Establecer el bloque muestra tirada en el soporte de espécimen de la ultramicrotomía. Coloque la muestra 90° hacia la izquierda contra la posición actual cuando el seccionamiento ultrafino serial es realizado (ver Figura 5D).
2. Cortar la superficie del bloque con un cuchillo de corte de diamante (ver Figura 5D). Ajuste el borde del cuchillo de diamante paralelo a la cara del bloque de muestra y corte la cantidad mínima de superficie de la muestra para no perder a ningún espécimen (Figura 5D).
   Nota: Este paso se hace para suavizar la superficie de la muestra. La parte de la superficie de la muestra de la parte delgada queda intacta (por lo tanto, esta parte no es brillante como un espejo, Figura 5D), para que no se pierde ninguna parte de la muestra para el seccionamiento serial. Esto es porque la muestra es expuesta en la superficie del bloque.
3. Coloque un espejo (corte de Mesa, M) en el escenario de cuchillo para controlar el corte del bloque del espécimen (figura 5C).
4. Corte el borde izquierdo (esto se convierte en la parte superior, figura 5 d, de la muestra en el seccionamiento serial) del bloque usando el cuchillo de cortar girando la etapa cuchillo 30 ° a la izquierda (figura 5a).
5. Cortar la cara del bloque en cerca de 100 μm desde el borde izquierdo de la muestra (esto se convierte en la parte inferior de la muestra en el seccionamiento serial, figura 5 d) girando la etapa cuchillo 30 ° a la derecha (figura 5b).
   Nota: Las secciones seriales serán cortadas de la parte delgada de la muestra de cerca de 90 nm x 1 mm de tamaño. La mayor parte se utilizará para ajustar la superficie de la muestra y el borde de cuchillo que son paralelas. Después de ajustar la superficie de la muestra para ser paralela al borde de cuchillo, se eliminará la mayor parte con una cuchilla de afeitar. Cortando los lados superiores e inferiores de la muestra con el microtomo, ambos lados de la muestra se convierten en suave y exactamente paralelas entre sí (Figura 5D), que es necesario para tener secciones rectas e ininterrumpidas de la cinta.

4. Ajuste el borde de la superficie y cuchillo de muestra para que corren paralelo a ²¹

1. Quitar la cuchilla de corte y gire el bloque de la muestra 90° hacia la derecha.
2. Establezca una cuchilla de seccionamiento ultrafino en la etapa de cuchillo.
3. Ajustar la superficie de la muestra y el filo para que corren paralelo con gran parte de la superficie del espécimen.
   Nota: Gran parte de la muestra se utiliza para el ajuste porque la cara de corte de seccionamiento serial es tan pequeña, lo que dificulta ajustar el espécimen de la superficie y cuchillo el borde usando esta parte solamente, sobre todo en dirección vertical. Así, utilizando gran parte de la pieza facilita el ajuste.

5. difundir la solución de neopreno en el bloque de la muestra (figura 6)

1. Para colocar el portabrocas del espécimen en exactamente la misma posición como la posición original, aplique la cinta en el mandril y el mandril del microtomo y corte en el límite (Figura 6a).
2. Sacar a la muestra de tirada del microtomo y se coloca bajo el estereomicroscopio (figura 6b). Cortar la parte grande de la muestra con una cuchilla de afeitar, dejando la parte delgada, de la cual se obtendrán las secciones seriales.
3. Utilizando una pipeta Pasteur, gota de 1 μl 0.5% neopreno solución (figura 6b) en la muestra a utilizarse para seccionamiento serial, para hacer el pegamento de lados de la sección. Cubrir a la muestra entera con solución de neopreno. Absorba la solución de neopreno exceso inmediatamente con un pedazo de papel de filtro colocado cerca de la muestra. Una cinta de las secciones es esencial para tomar fotografías de las secciones de la serie de la célula, y pegamento de neopreno es muy útil para pegar las secciones juntas.
4. Preparar rejillas de ranura 3 (tamaños de ranuras: medio, 0,4 mm x 2,2 mm, ambos lados 0,2 mm x 2,2 mm) (figura 6 c) para recoger las secciones seriales doblando el mango de las rejillas a 60 °, tratamiento de las rejillas con solución de neopreno de 0,5% y haciendo hidrofílica de las rejillas resplandor descarga²².

6. hacer las secciones seriales (figura 7-9)

1. Lugar el bloque de muestra de la tirada en el micrótomo en la misma posición como 5.1 (Figura 6a) alineando las piezas con cinta. Esto mantiene la cara del bloque y el borde de cuchillo perfectamente paralelos entre sí. A continuación, llevar el cuchillo cerca de la muestra.
2. Llene el bote de cuchillo con agua.
3. Cubra el micrótomo con un plástico para prevenir el flujo de aire (figura 7).
   Nota: Flujo de aire durante el seccionamiento ultrafino y la recuperación de las secciones a menudo causa problemas. La tapa de plástico tiene tres agujeros: un agujero es para las lentes de binoculares, y son los otros dos agujeros para que los brazos permitir la operación mientras que la cubierta es en. Los apoyabrazos de madera se utilizan para la colocación de los brazos mientras hacía trabajos delicados, como recuperar las secciones seriales con rejillas. Los apoyabrazos de madera se colocan en diferentes tablas de la mesa del micrótomo (figura 7, flechas), para no transmitir la vibración de las manos del operador para el micrótomo.
4. Empiece a cortar al espécimen en el espesor de sección de 200 nm (figura 8). Ajuste de grosor de nm 200 ahorrará tiempo en llevar el cuchillo a la superficie de la muestra.
5. Después de la primera sección, se establece el espesor de la sección a 70 nm (figura 8).
6. Cuando el número de secciones seriadas alcanza 20 (precisamente hablando, después de los tramos de cinta aproximadamente 1.8 mm; el número de secciones varía dependiendo del ancho de las secciones), el espesor de la sección a 10 nm (figura 8) sin dejar de cortar.
   Nota: Puesto que el micrótomo no puede cortar 10 nm de espesor secciones, ninguna nueva sección aparece, y se separan las secciones anteriormente cortadas desde el borde de cuchillo. Es importante que los grupos separados de la sección (figura 9) para que levantar secciones seriadas evitar dificultades en la separación de secciones manualmente usando un par de filamentos del pelo. Desde el campo de visión en el microscopio electrónico de transmisión es de 2,0 mm, secciones deberían ser 1,8 mm de largo como máximo.
7. Ajustar el espesor de la sección a 60 nm (figura 8). Esto producirá 70 secciones de nm (figura 8) porque la máquina añadir el grueso de nm 10 anterior.
8. Ajustar el espesor de la sección a 70 nm (figura 8) y corte hasta que se obtienen secciones de 1.8 mm de longitud.
9. Repita 6.6-6.8 hasta cinco secciones largas de 1,8 mm se obtienen (figura 9). Generalmente hacemos cinco grupos de sección ya que hay cinco sostenedores del espécimen en el microscopio electrónico de transmisión disponibles en nuestro laboratorio, pero cinco no es el límite.

7. recoger las secciones seriales (figura 10-12)

1. Colocar el 'lazo de retención de sección'²³ (diámetro interior del bucle: 5.0 mm) (figura 10a) en el tercer grupo de la sección (figura 10b).
   Nota: Es necesario recuperar las secciones en el orden de sus secciones para tomar fotos en el orden adecuado. Sin embargo, puesto que hay cinco grupos de sección en el barco de cuchillo, lo a menudo obtiene confusos que los grupos que son. Colocando el lazo sobre el tercer grupo, está claro que los dos grupos cerca del operador son la primera y segunda y los dos distantes del operador son los grupos cuarto y quinto (figura 10b). Esto evitará que el orden de mezcla.
2. Lugar de 'bucle de agua superficie de sensibilización'²³ (WSRL, diámetro interno del lazo: 4.0m m) (figura 11a) en la etapa de cuchillo (Figura 11b). El WSRL estará firmemente en la escena del cuchillo ya que está equipada con un imán en la parte inferior.
   1. Coloque el lazo de la WSRL justo por encima de las secciones seriadas mediante el movimiento de su eje y manija. Baje el lazo de la WSRL sobre la superficie del agua para que el lazo rodea las secciones.
   2. Empuje el bucle girando el tornillo hacia abajo para que la superficie del agua se eleve por tensión superficial (figuras c 11-d). Mover la sección hasta el centro del lazo, colóquelo sobre el vértice del agua y ajuste la dirección de la sección utilizando un filamento de cabello²¹.
   3. Recoger grupos de sección al tocarla con una cuadrícula de raja pelada, que es sostenida por pinzas y se mantiene paralela a la superficie del agua (figura 11 d). Es importante para las secciones tocar la red en primer lugar, no el agua, colocar las secciones precisamente en el centro de la cuadrícula (figura 11 d).
3. Coloque las rejillas con secciones junto con una pequeña gota de agua en la de película de Formvar en apoyo¹⁶ (figura 12) y quite el exceso de agua utilizando papel de filtro.
   Nota: Arrugamiento de la película de soporte suele ser un problema cuando las secciones son recogidas con una red de película de soporte porque la membrana (secciones) abarca (película de soporte) la membrana directamente. El problema de obtener las arrugas en la película de soporte se reduce significativamente mediante la colocación de una rejilla de sección de rodamiento junto con una gota de agua el de película de Formvar apoyo¹⁶.

8. tinción de secciones^16,24 (figura 13)

1. Después de las secciones están completamente secas, rasgar la película de Formvar desde alrededor de las rejillas y sacar las rejillas con las secciones.
2. Las rejillas en la ranura del tubo tinción¹⁶ en el orden adecuado (figura 13) y mancha secciones con uranilo acetato y plomo citrato²⁴.
   Nota: Hay una ranura 0,6 mm de profundidad en el eje largo del tubo de corte con una cuchilla de afeitar. El tubo es útil para evitar la rotura accidental de las películas de soporte al utilizar pinzas, ya que la manipulación directa de las redes no es necesario durante el proceso de tinción y lavado¹⁶.

9. observación de secciones seriadas (figura 14)

1. Coloque las 5 rejillas en el soporte de múltiples muestra en el orden adecuado (figura 14a), orientando el eje largo de la ranura de la rejilla perpendicular al eje sostenedor de la muestra. Los mangos (flecha) de las rejillas no debe cortar, porque las 'fijadores de rejilla' no va a tocar las manijas.
2. Fijar las rejillas con 'red-fijadores' (figura 14b) e Inserte el soporte de espécimen en el microscopio electrónico de transmisión.
   Nota: A menudo es útil tomar imágenes de ampliación baja de todas las secciones de la célula (figura 15) para encontrar interesantes microorganismos o células en buen estado sin contaminación y con buena fijación, antes de tomar fotografías de la célula diana.
3. Tomar fotografías de las células blanco en todas las secciones de la célula en gran aumento.

Resultados

En este protocolo, rejillas de ranura en tres fueron utilizadas para recoger las secciones seriales. Las redes están hechas de níquel o cobre. Las secciones seriales se colocan en la ranura central. Las ranuras en ambos lados son necesarias para ver las secciones al aspirar con la rejilla. Para mantener las rejillas paralelas con secciones seriales al recoger con las pinzas (figura 11 d), el mango se dobla (figura 6 c, derecha)...

Discusión

El método presentado aquí no requiere de costoso equipo. Requiere sólo un bastidor de aluminio (figura 3), hendidura de tres rejillas (figura 6 c), sección explotación bucles (figura 10a), lazo de aumento de superficie de agua (figura 11a) y un tubo de tinción (figura 13). Hay muchas características del método actual. Gran parte de la muestra se utiliza para ajustar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar making apparatus	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	652	W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide	Matsunami Co. Ltd., Osaka	-	76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	658	W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SM-LW 61 Ji
Trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Diamond knife for ultrathin sectioning	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna	-	Ultracut S
Mesa cut	Leica Microsystems, Vienna	-	Mirror
0.5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Special 3-slit nickel grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2458	Refer to this paper
Special 3-slit copper grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2459	Refer to this paper
Section-holding loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	526	Refer to this paper
Water-surface-raising loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	527	Refer to this paper
Staining tube	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Refer to this paper
Multi-specimen holder	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	Transmission electron microscope