Transmisyon elektron mikroskobu mikroorganizmaların seri Ultrathin bölümler elde etmek için bir yöntem

Özet

Bu çalışmada bir mikroorganizma transmisyon elektron mikroskobu içinde pahalı aletler olmadan seri ultrathin bölümleri elde etmek için güvenilir ve kolay yordamları sunar.

Özet

Hücreleri ve hücre bileşenleri transmisyon elektron mikroskobu yüksek büyütmede üç boyutlu gözlem ultrathin bölümlerini seri: numune hazırlama gerektirir. Seri ultrathin bölümler hazırlama çok zor olarak kabul edilir, uygun yöntemi kullanılırsa oldukça kolay olsa da. Bu yazıda, güvenli bir şekilde mikroorganizmaların seri ultrathin bölümler elde etmek için bir adım adım yordam göstereceğiz. Bu yöntem anahtar noktaları vardır: 1) numune büyük bölümünü kullanmak ve böylece birbirine; paralel numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlamak için 2) seri grupları bölümlerde kesme ve saç iplikçiklerinin dibinde bir çift yarık Izgaralar üzerine seri bölümler bir grup alınırken kullanma bölümlerine ayırmak zorluk önlemek için; 3) bir 'bölüm-holding loop' kullanın ve bölüm grupları sipariş kadar karıştırma önlemek için; 4) bölümleri su tepe üzerinde konumlandırılmış ve ızgara önce onları Izgaralar üzerinde istediğiniz konuma yerleştirmek için dokundukları olduğunu emin olun ve bir 'su yüzeyi yükselterek loop' kullanmak için; 5) destek film bir alüminyum raf kullanabilir ve Izgaralar bölümleri kurtarmak için ve destek film kırışıklıklar önlemek için kolaylaştırmak için; ve 6) Boyama bir tüp kullanın ve destek filmleri cımbızla yanlışlıkla kesmemek için. Bu yeni yöntem zorluk olmadan seri ultrathin bölümler elde sağlar. Yönteminin Otomatik teyp toplama ultramicrotome yöntemi ve seri blok-yüz veya elektron mikroskobu tarama odaklı iyon ışını kullanarak elde edilemez 3D yüksek çözünürlükte mikroorganizmaların hücre yapıları analiz olanak sağlar.

Giriş

Hücreleri ve hücre bileşenleri üç boyutlu en elektron mikroskobik düzeyde çalışmaya uygun seri ultrathin parça tekniği vazgeçilmezdir. Biz Milli direk vücutta hücre döngüsünün Maya hücreleri dinamikleri okudu ve hücre döngüsü ve çoğaltma^1,2,3, saat onların ultrastructure morfolojik değişiklikler ortaya ^4,5. 2006'da, biz 'structure' birleştirerek yeni bir kelime 'structome' icat ve '-ome' ve 'nicel ve üç boyutlu yapısal bilgi elektron mikroskobik düzeyde bütün bir hücrenin' ^6,7olarak tanımlanır.

Seri ultrathin parça tekniği gerektiren structome analiz, bu Maya hücre Saccharomyces cerevisiae ve Exophiala kemiğin yaklaşık 200.000 ribozomlara^7,8, bir vardı bulundu Escherichia coli hücre 26.000 ribozomlara⁹, Mycobacterium tüberküloz hücre 1,700 ribozomlara¹⁰ vardı ve Myojin sarmal bakterilerin vardı sadece 300 ribozomlara¹¹. Bu bilgiler sadece büyüme oranı her organizma, aynı zamanda tür⁹tanımlaması tahmininde yararlı olur.

Ayrıca, structome analiz yeni bir organizma keşfi yol açtı; Kapalı hücre yapısı vardı bir ara bu^12,13,14,15prokaryot ve Ökaryotlar arasında Japonya sahillerine, derin deniz Parakaryon myojinensis bulundu. Şu anda, seri ultrathin parça tekniği master için uzun bir süre süreceğini zor olarak kabul edilir. Bu çalışmada, hangi içinde kimse seri ultrathin zorlanmadan kesit yerine güvenilir bir yöntem geliştirdik.

Protokol

Not: Bu çalışmada kullanılan numuneler mikroorganizmaların hızla sıvı azot içinde propanla donmuş, Don % 2 Osmiyum tetroxide içeren aseton içinde değiştirilen ve epoksi reçine^{1,2,3gömülü olduğunu, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18}.

1. destek film (Resim 1-3) hazırlanması

Not: Gümüş renkli Formvar destek film¹⁹cam üzerinde döküm yöntemi kullanılarak hazırlanır.

1. %1,5 100 mL ekleyin Formvar etilen ve için bir Formvar yapma aparatı (şekil 1). Yarım saniyeden Formvar çözüm cihazları üst sütununda bir cam slayt (76 x 26 x 1,3 mm) 'a' bir kauçuk top¹⁹kullanarak üzerinden hava ile çözüm basarak daldırma.
   1. Üçlü stopcock açarak ve basıncı azaltmak için 'b' havada serbest sütun çözümden drenaj. Gelen ve kuru havada cam kaymak dışarı cam slayt için bir film yüzeyinde biçiminde. Bir akkor lamba Formvar film kurutma hızlandırmak için kullanın.
2. Bir tıraş bıçağı (şekil 2a) ile cam slaytta filmin dört kenarları kapalı kazıma ve film ayrılması slayt²⁰, kolaylaştırmak için slayda nefes su filmde kapalı cam kaymak içine çeker tarafından float sonra yavaş yavaş bir düşük yatay açı (yaklaşık 10 °, şekil 2b) su.
3. (Çapı 4 mm) delikli alüminyum raf (30 x 25 x 3 mm) kullanarak su Formvar filmden kaldırsanız (şekil 3a). Formvar film ile raf bir desiccator kadar kullanmak (şekil 3b) tutmak.

2. numune blok bir ultrasonik kesme bıçağı ve bir stereomicroscope (şekil 4) altında bir jilet ²¹ ile düzeltme

1. Hücre bloğu yüzeyinde bir ışık mikroskobu ile (şekil 4a) blok ucu gözlemleyerek emin olun.
2. Chuck (blok sahibi) numune bloğunda mount ve chuck bir düzeltme sahne²¹ tarihinde (şekil 4b) bağlayabilirsiniz. Bu düzeltme aşamasında numune arkasından bir aydınlatma mekanizması vardır.
3. Bir boyut için blok 0.7 mm x 1.0 mm (rakamlar 4 c, 5 d) kırpın. Epoksi reçine çok zor olduğundan, ilk bir ultrasonik kesme bıçağı kullanarak blok döşeme. Ultrasonik kesme bıçağı Yeni tanıtılan bir makinedir ve bloklar kolayca atılır. O zaman daha fazla bir tıraş bıçağı ile blok döşeme. (Bkz: şekil 5 d, şekil 8) kesme doğrultusunda işaretlemek için bir omuz kesti.

3. microtome (şekil 5) kullanarak elmas bıçak ile numune caddenin kırparak

1. Numune caddenin chuck ultramicrotome numune sahibinin ayarlayın. Örnek yer 90° saat yönünün tersine seri ultrathin kesit olduğunda gerçek pozisyon karşı gerçekleştirilen (bkz şekil 5 d).
2. Blok yüzeyini bir elmas kesme bıçak (bkz şekil 5 d) ile kesmek. Elmas bıçak kenarı örnek blok yüzüne paralel ayarla ve numune yüzeyi herhangi bir numune (şekil 5 d) kaybetmek en az miktarda kesti.
   Not: Bu adım numune yüzeyi düzeltmek için yapılır. Numune yüzeyi ince bölümünün parçası değişmeden kalır (Bu nedenle bu bölümü şekil 5 dbir ayna gibi parlıyor değil), bu yüzden örnek herhangi bir bölümünü seri kesit kaybetmemek için. Numune caddenin yüzeyinde maruz olmasıdır.
3. Bir ayna (Mesa kesim, M) (şekil 5 c) numune blok kesme izlemek için bıçak sahnesinde yerini.
4. (Bu Yakası, şekil 5 d, seri kesit içinde örnek olur) bıçak sahne soldaki (şekil 5a) 30 ° döndürerek kesme bıçağı kullanarak blok sol kenarına kesti.
5. Bıçak Sahne Alanı'nda 30 ° (şekil 5b) sağa döndürerek (Bu seri kesit, şekil 5 diçinde örnek alt tarafında olur) numune sol kenarına gelen yaklaşık 100 µm blok surata kesti.
   Not: Numune yaklaşık 90 ince kısmından seri bölümleri kesilir x 1 mm boyutunda nm. Büyük ölçüde paralel olduklarını öyle ki numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlamak için kullanılır. Bıçak kenarına paralel olmak numune yüzeyi ayarladıktan sonra büyük ölçüde bir tıraş bıçağı ile kaldırılacak. Microtome kullanarak örnek alt ve üst kenarlarında keserek, her iki örnek düz ve kırılmamış şerit bölümler almak gerekli olan düzgün ve tam olarak birbirlerine (şekil 5 d), paralel haline.

4. paralel olarak birbirine ²¹ karşılaştıkları böylece numune yüzeyi ve bıçak kenar ayarlama

1. Kesme bıçağı çıkarmak ve numune blok 90 ° saat yönünde döndür.
2. Ultrathin bir parça bıçak bıçak Sahne Alanı'na ayarlayın.
3. Her numune yüzeyi büyük bölümünü kullanarak diğer paralel karşılaştıkları numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlanır.
   Not: seri kesit, kesme yüz numune yüzeyi ve bıçak kenar bu bölüm yalnızca, özellikle dikey yönde kullanarak ayarlamak üzere çok küçük olduğu için örnek büyük kısmı ayarı için kullanılır. Böylece, örnek büyük bölümünü kullanarak ayarlamayı kolaylaştırır.

5. yaymak neopren çözüm örnek blok (şekil 6)

1. Özgün konum olarak tam olarak aynı konumda numune chuck yerleştirmek için chuck ve microtome chuck sahibinin teyp uygulayın ve sınırında (şekil 6a) kesti.
2. Numune chuck microtome çıkar ve stereomicroscope (şekil 6b) altında yerleştirin. Bir tıraş bıçağı ile numune büyük kısmını kesti, ince parça seri halinde hangi bölümlerden bırakarak elde edilir.
3. Pasteur pipet kullanmadan, yaklaşık 1 µL % 0.5 neopren çözüm (şekil 6b) seri kesit için bölüm tarafı yapışkan yapmak için kullanılmak üzere numune bırak. Neopren çözüm ile tüm örnek kapak. Aşırı neopren çözüm hemen filtre kağıdı numune yerleştirilen bir parçası ile absorbe. Bir şerit bölümlerin almak seri halinde hücre bölümleri fotoğrafını çekmek esastır ve neopren tutkal bölümleri birbirine yapışmasını için çok yararlıdır.
4. 3-yarık Izgaralar hazırlamak (yırtmaçlı boyutları: Orta, 0.4 mm x 2.2 mm, her iki taraf 0.2 mm x 2.2 mm) (şekil 6 c) 60 ° ila Izgaralar tanıtıcısı bükme tarafından seri bölümleri seçmek için Izgaralar % 0.5 neopren çözüm ile tedavi ve Izgaralar tarafından hidrofilik yapma kızdırma deşarj²².

6. yapım seri bölümler (Şekil 7-9)

1. Yer numune caddenin chuck içeri 5.1 (şekil 6a) olarak aynı konumda microtome bantlanmış parçaları hizalayarak. Bu blok yüz ve bıçak kenarı birbirine mükemmel paralel tutar. Sonra örnek yakın bıçak getir.
2. Bıçak teknenin su ile doldurun.
3. Microtome hava akımı (Şekil 7) önlemek için plastik bir kapak ile kapak.
   Not: Hava akımı ultrathin kesit ve sık sık bölümleri alımı sırasında sorunlara neden. Plastik kapak üç delik vardır: tek bir delik için dürbün lensler ve kapağı açıkken işlemi izin vermek silah diğer iki delik vardır. Ahşap kol dayama Izgaralar ile seri bölümleri alma gibi hassas iş yaparken silah yerleştirmek için kullanılır. Ahşap kol dayama operatörün el microtome için titreşim iletimi vermemek için microtome tablo (Şekil 7, oklar), farklı tablolarda yerleştirilir.
4. 200 nm bölüm kalınlığı (şekil 8) Numune kesme başlatın. 200 nm kalınlık ayarı numune yüzeyinin bıçak getirmekte zaman kazandıracak.
5. İlk bölüm kestikten sonra bölüm kalınlığı 70 için ayarla nm (şekil 8).
6. Seri bölüm sayısı (tam olarak, yaklaşık 1,8 mm; bölüm sayısı değişir bölümlerinin genişliğini bağlı olarak şerit ulaştığı sonra konuşma) 20 ulaştığında, bölüm kalınlığı 10 değerine ayarlayın kesmeye devam ederken nm (şekil 8).
   Not: microtome 10 nm-kalın kesitler kesemezsin beri yeni bölüm yok görünür ve daha önce kesme bölümleri bıçak kenarından ayrılmış olmak. El ile bir çift saç iplikçiklerinin kullanma bölümlerine ayırmak zorluk önlemek seri bölümleri seçmek için ayrılmış bölüm grupları (Şekil 9) almak önemlidir. Transmisyon elektron mikroskop görüş alanı 2.0 mm olduğu için bölümler en az 1.8 mm uzunluğunda olmalıdır.
7. Bölüm kalınlığı 60'a ayarla nm (şekil 8). Makine önceki 10 nm kalınlığı eklediğinden bu 70 nm bölümler (şekil 8) üretecektir.
8. Bölüm kalınlığı 70 için ayarla nm (şekil 8) ve kesim 1,8 mm uzun bölümler elde edilen kadar devam edin.
9. Beş 1.8 mm uzun bölümler (Şekil 9) elde edilen kadar 6,6-6.8 yineleyin. Biz genellikle beş bölüm grupları mevcuttur beş örnek sahipleri transmisyon elektron mikroskobu bizim laboratuarımızda, ancak beş sınırı değil yapmak.

7. alarak seri bölümler (şekil 10-12)

1. 'Bölüm-holding loop'²³ yerleştirin (döngü iç çapı: 5.0 mm) (şekil 10a) üçüncü bölüm grubu (şekil 10b) üzerinde.
   Not: Uygun sırada fotoğraf çekmek için onların kesit sırasına göre bölümler almak gereklidir. Bıçak teknede beş bölüm grupları olduğundan, ancak, bu kez hangi grupları olan kafa karıştırıcı alır. Üçüncü grup üzerinde döngü yerleştirerek, iki grup işleci yakın olduğunu ortaya çıkıyor ve operatör üzerinden uzak iki ilk ve ikinci dördüncü ve beşinci gruplarının (şekil 10b) vardır. Bu-ecek önlemek sipariş karıştırma.
2. 'Su yüzeyi yükselterek loop'²³ yerleştirin (WSRL, döngü iç çap: 4.0 mm) (şekil 11a) (şekil 11b) bıçak sahnede. Alt bir mıknatıs ile donatılmış WSRL sıkıca bıçak sahnede stand.
   1. WSRL döngü sadece seri bölümler onun mili ve kolu hareket ettirerek yerleştirin. Böylece döngü bölümleri çevreleyen su yüzeyine WSRL döngü indirin.
   2. Böylece su yüzeyi yüzey gerilimi (rakamlar 11 c-d) tarafından arttıracak vidayı aşağı doğru çevirerek döngü bastır. Bölümü döngünün ortasına doğru taşımak, su tepe üzerinde konumlandırın ve bir saç strand²¹kullanarak bölümü yönünü ayarlayın.
   3. Bölüm grupları ile bir çıplak yarık-cımbız tarafından düzenlenen ve su yüzeyine (Şekil 11 d) paralel tutulan GRID, dokunarak seçin. İlk olarak, grid dokunmak değil su bölümleri tam olarak ızgara (Şekil 11 d) ortasına yerleştirmek için bölümler için önemlidir.
3. Bölümleri ile birlikte küçük bir damla su ile Izgaralar Formvar destek film¹⁶ üzerinde (şekil 12) yerleştirin ve aşırı su filtre kağıdı kullanarak kaldırın.
   Not: bölümler membran (bölümler) membran (destek film) doğrudan dokunuyor çünkü bir destek film ile kullanılması çekildiği zaman destek film kırışıklıklar genellikle bir sorundur. Destek filmde kırışıklar çıkıyor sorun Formvar destek film¹⁶üzerinde küçük bir damla su ile birlikte bir bölümü taşıyan kılavuz yerleştirerek önemli ölçüde azalır.

8. bölüm^16,24 (şekil 13) Boyama

1. Sonra bölümleri tamamen kurutulur, Formvar filmin Izgaralar çevresinde gözyaşı ve bölümleri taşıyan ızgaraları kaldırmak.
2. Doğru sırada (şekil 13) Boyama tüp¹⁶ oluk Izgaralar ayarlayın ve uranyl asetat ve kurşun sitrat²⁴bölümlerle leke.
   Not: Bir oluk 0.6 mm derin 's tüp uzun ekseni boyunca kesilmiş bir tıraş bıçağı ile. Tüp doğrudan ızgaraları kullanımı boyama ve yıkama işlemi¹⁶sırasında gerekli olmadığından cımbız, kullanırken destek filmlerin yanlışlıkla kırılma önlemek için yararlıdır.

9. gözlem seri bölümler (Şekil 14)

1. Numune tutucu eksenine dikey kılavuz slit uzun ekseninin yönlendirme 5 Izgaralar çok numune tutucu (şekil 14a), doğru sırayla ayarlayın. 'Kılavuz-fixers' tutamaçları dokunmatik değil çünkü Izgaralar kolları (ok uçları) kesilecek, yok.
2. Izgaralar 'kılavuz-fixers ile' (şekil 14b) düzeltmek ve numune tutucu transmisyon elektron mikroskobu yerleştirin.
   Not: Hedef hücre Fotoğraf çekmeden önce tüm hücre bölümleri (iyi fiksasyon ile hayır kirlenme ile iyi durumda ilginç mikroorganizmaların veya hücreleri bulmak için,şekil 15) düşük büyütme görüntüleri almak yararlıdır.
3. Yüksek büyütmede tüm hücre bölümlerde hedef hücreleri resimlerini çekmek.

Sonuçlar

Bu protokol için üç-yarık Izgaralar seri bölümleri seçmek için kullanılmıştır. Izgaralar nikel veya bakır yapılmıştır. Seri bölümleri orta slit yerleştirilir. Her iki tarafta yırtmaçlı kılavuzla aldığın zaman bölümleri görüntülemek gereklidir. Izgaralar seri bölümleri ile paralel (Şekil 11 d) cımbızla almaya devam etmek, kolu bükülmüş (şekil 6 c, sağ). Küçük bir kolu ciddi sorunlara n...

Tartışmalar

Burada sunulan yöntem hiçbir pahalı ekipman gerektirir. Sadece bir alüminyum raf (şekil 3), üç-yarık Izgaralar (şekil 6 c), bölüm-holding döngüler (şekil 10a), su yüzeyi yükselterek döngü (şekil 11a) ve boyama tüp (şekil 13) gerektirir. Mevcut yöntemin birçok özellikleri vardır. Numune büyük bölümünü birbirine paralel karşılaştıkları numu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar making apparatus	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	652	W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide	Matsunami Co. Ltd., Osaka	-	76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	658	W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SM-LW 61 Ji
Trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Diamond knife for ultrathin sectioning	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna	-	Ultracut S
Mesa cut	Leica Microsystems, Vienna	-	Mirror
0.5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Special 3-slit nickel grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2458	Refer to this paper
Special 3-slit copper grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2459	Refer to this paper
Section-holding loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	526	Refer to this paper
Water-surface-raising loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	527	Refer to this paper
Staining tube	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Refer to this paper
Multi-specimen holder	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	Transmission electron microscope