שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Summary

מחקר זה מציג אמין וקל נהלי קבלת טורי ודק במיוחד חלקים מיקרואורגניזם ללא ציוד יקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

Abstract

התבוננות תאים ומרכיבים תא בשלושה ממדים בהגדלה גדולה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מחייב הכנת טורי זגוגית מקטעים של הדגימה. למרות הכנת מקטעים זגוגית טורי נחשב להיות קשה מאוד, זה די קל אם שימוש בשיטה הנכונה. בנייר זה, אנו מראים תהליך צעד אחר צעד בבטחה קבלת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים. נקודות המפתח של שיטה זו הם: 1) כדי להשתמש בחלק גדול הדגימה ולהתאים לקצה משטח והסכין הדגימה כך הם מקבילים זה לזה; 2) כדי לחתוך קטעים טוריים בקבוצות ולהימנע קושי להבחין. בין האיזורים השונים בחשבון בעזרת זוג קווצות שיער בעת אחזור קבוצה של מקטעים טורית על גבי הרשתות שסע; 3) כדי להשתמש לולאה סעיף החזקת ולמנוע ערבוב את הסדר של קבוצות סעיף; 4) כדי להשתמש 'הרמת-מים-פני לולאה' וודא כי הסעיפים ממוקמות על השיא של המים, הם נוגעים הרשת קודם, על מנת למקם אותם במיקום הרצוי על הרשתות; 5) כדי להשתמש הסרט תמיכה על מתלה אלומיניום וכדי שיהיה קל יותר להתאושש הסעיפים על הרשתות וכדי למנוע קמטים של הסרט תמיכה; ו- 6) כדי להשתמש שפופרת מכתימים ולהימנע לשבור את הסרטים תמיכה עם פינצטה. שיטה חדשה זו מאפשרת קבלת מקטעים זגוגית טורי ללא קושי. השיטה מאפשרת לנתח את מבנה התא של מיקרואורגניזמים ברזולוציה גבוהה ב- 3D, אשר אינה יכולה להיות מושגת באמצעות שיטת ultramicrotome איסוף קלטות אוטומטיים, פרצוף-בלוק טורי או יון ממוקדת קרן סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים.

Introduction

טורי זגוגית אופטים הטכניקה הנכונה הוא חיוני ללמוד תאים ומרכיבים תא three-dimensionally ברמה המיקרוסקופית אלקטרון. יש ללמוד את הדינמיקה של גוף קוטב פלך במחזור התא של תאי שמרים, ואנו חשף שינויים מורפולוגיים של ultrastructure שלהם במהלך מחזור התא ואת הזמן של שכפול^{1,2,3, 4,5}. בשנת 2006, אנחנו נטבע מילה חדשה 'structome' על-ידי שילוב 'מבנה', '-הביתה ', והוא הגדיר זאת כ ^6,'כמותית ותלת ממדית מבניים מידע של כל תא ברמה המיקרוסקופית אלקטרון'⁷.

על ידי ניתוח structome, אשר דורשת טכניקה אופטים זגוגית טורי, התברר שיש תא שמרים של האפייה , Exophiala dermatitidis ^7,כ-200,000 הריבוזומים⁸, Escherichia coli תא היה הריבוזומים 26,000⁹, תא שחפת Mycobacterium הריבוזומים 1,700¹⁰ והיה מיוג'ין ספירלה חיידקים הריבוזומים רק 300¹¹. מידע זה שימושי באומדן לא רק את שיעור הצמיחה כל אורגניזם, אלא גם בזיהוי מינים⁹.

ניתוח structome נוסף, הובילו לגילוי של אורגניזם חדש; Parakaryon myojinensis נמצאה במעמקי הים החוף של יפן, מבנה תאים אשר היו ביניים בין אלה של אאוקריוטים פרוקריוטים ו-^12,13,14,15. בזמן הנוכחי, טורי טכניקה אופטים זגוגית נחשב להיות כל כך קשה. שזה ייקח זמן רב להתמחות. במחקר זה, פיתחנו שיטה אמינה שבו כל אחד יכול לבצע חלוקתה זגוגית טורי ללא קושי.

Protocol

הערה: דגימות השתמשו במחקר זה היו מיקרואורגניזמים, במהירות קפוא עם גז חנקן נוזלי, להקפיא שהוחלפו ב אצטון המכיל 2% אוסמיום ארבע-חמצני, ומוטבעים אפוקסי שרף^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18}.

1. הכנת הסרט תמיכה (איור 1-3)

הערה: Formvar בצבע כסף תמיכה הסרט מוכן באמצעות שיטת יצוקה על-זכוכית¹⁹.

1. להוסיף 100 מ של 1.5% Formvar של-אתילן dichloride אל מנגנון יצירת Formvar (איור 1). טובלים חצי אחד של שקופית מזכוכית (76 מ מ x 26 מ"מ x 1.3 מ"מ) בתמיסה Formvar בעמודה העליון של המנגנון על ידי לחיצה על הפתרון עם האוויר דרך 'a' באמצעות כדור גומי¹⁹.
   1. סוחטים את הפתרון מן העמודה על-ידי פתיחה של צימוד-כיוונית של שחרור האוויר דרך 'b' כדי להפחית את הלחץ. להוציא את השקופית זכוכית מן המנגנון ויבש באוויר כדי ליצור סרט על פני השטח של השקופית זכוכית. השתמש מנורת להט להאיץ הייבוש של הסרט Formvar.
2. לאחר מגרדים ארבעת הקצוות של הסרט בשקופית זכוכית עם סכין גילוח (איור 2 א), ונשימה אותן לשקופית כדי להקל על ההפרדה של הסרט שקופית²⁰, ימחאו הסרט על המים במועט השקופית זכוכית לתוך מים לאט בזווית אופקית נמוכה (בערך 10°, איור 2b).
3. תגרדו את הסרט Formvar מן המים באמצעות ארון תקשורת של אלומיניום (30 מ מ x 25 מ"מ x 3 מ"מ) עם חורים (4 מ מ קוטר) (איור 3 א). שמור על האצטבה עם הסרט Formvar desiccator עד לשימוש (איור 3b).

2. קיצוץ הרחוב דגימה של להב חיתוך אולטראסוניות, גילוח ²¹ תחת stereomicroscope (איור 4)

1. ודא כי ישנם תאים על פני השטח של גוש על ידי התבוננות קצה הרחוב עם מיקרוסקופ אור (איור 4a).
2. הר הרחוב דגימה ב הצ'אק (בלוק מחזיק), והר הצ'אק על הבמה זמירה²¹ (איור 4b). בשלב זה זמירה יש מנגנון תאורה מהחלק האחורי של הדגימה.
3. חתוך שאבן בגודל של 0.7 מ"מ x 1.0 מ"מ (איורים 4 c, 5d). מאז שרף אפוקסי הוא מאוד קשה, לקצץ את אבני הראשון באמצעות להב חיתוך אולטרה סאונד. להב חיתוך אולטראסוניות מכונה הציג לאחרונה, הבלוקים, נסגרים בקלות. אז לקצץ את גוש נוסף עם סכין גילוח. חותכים כתף אחת כדי לסמן את הכיוון של חיתוך (ראה איור 5 d, איור 8).

3. זמירה את הרחוב דגימה בסכין יהלום באמצעות את האזמל הקטן (איור 5)

1. להגדיר הרחוב דגימה צ'אק הדגימה האוחז ultramicrotome. מקם את הדגימה ב- 90° נגד כיוון השעון בניגוד לעמדת בפועל בעת חלוקתה זגוגית טורי שבוצעה (ראה איור 5 d).
2. חותכים את השטח של גוש עם סכין חיתוך יהלום (ראה איור 5-d). להגדיר את קצה סכין יהלום מקביל פני בלוק הדגימה, לחתוך את הכמות המינימלית של משטח הדגימה כדי לא לאבד את כל הדגימה (איור 5 d).
   הערה: שלב זה נעשית להחליק פני השטח הדגימה. חלק משטח הדגימה של החלק הדק הוא נותר ללא פגע (לכן החלק הזה לא זורחת כמו מראה, איור 5 d), כדי לא לאבד חלק כלשהו של הדגימה על חלוקתה טורי. הסיבה לכך היא הדגימה נחשף על פני הרחוב.
3. להציב מראה (Mesa קאט, ז) על הבמה את הסכין כדי לנטר את חיתוך הרחוב דגימה (איור 5 c).
4. חותכים את הקצה השמאלי (זה הופך סייד, איור 5 d, המדגם ב טורי חלוקתה) של גוש באמצעות סכין חיתוך על ידי סיבוב על הבמה סכין 30 מעלות שמאלה (איור 5a).
5. חתכו את הפנים בלוק-כ-100 מיקרומטר מהקצה השמאלי של הדגימה (זה הופך בצד התחתון של הדגימה ב טורי חלוקתה, איור 5 d) על-ידי סיבוב על הבמה סכין 30 מעלות ימינה (איור 5b).
   הערה: הסעיפים טורי יהיה לחתוך חלק רזה של הדגימה כ- 90 ננומטר x בערך בגודל 1 מ מ בלבד. החלק הגדול ישמש כדי להתאים את השטח הדגימה ואת קצה הסכין כך הם מקבילים. לאחר התאמת השטח הדגימה כדי להיות מקביל עד קצה הסכין, החלק גדול יוסרו עם סכין גילוח. על ידי גזירה את הצדדים העליון והתחתון של הדגימה באמצעות את האזמל הקטן, בשני הצדדים של הדגימה הופך בדיוק מקבילים זה לזה (איור 5 d), וחלקה אשר הכרחי לקבל את הכלים ישר ואינו רצופה מקטעים.

4. התאמת לקצה משטח והסכין הדגימה כך שהם פונים במקביל אחד לשני ²¹

1. להסיר את הסכין זמירה, וסובב את הרחוב דגימה 90° בכיוון השעון.
2. הגדר את הסכין אופטים זגוגית של השלב הסכין.
3. התאם משטח הדגימה לבין קצה הסכין כך שהם פונים במקביל זו לזו באמצעות חלק גדול משטח הדגימה.
   הערה: חלק גדול הדגימה משמש עבור התאמה כי הפנים חיתוך של טורי חלוקתה כל כך קטנה, ומקשה על התאם משטח הדגימה קצה הסכין באמצעות החלק הזה בלבד, בעיקר בכיוון אנכי. לכן, באמצעות החלק הגדול של הדגימה הופך התאמה קלה.

5. מריחה אטומה פתרון על הרחוב דגימה (איור 6)

1. כדי למקם את צ'אק הדגימה-בדיוק באותה העמדה המיקום המקורי, להחיל את הקלטת של הצ'אק, צ'אק האוחז האזמל הקטן ושרטתי הגבול (איור 6a).
2. סעו הדגימה צ'אק האזמל הקטן, מניחים אותה מתחת stereomicroscope (איור 6b). לחתוך את החלק הגדול של הדגימה עם סכין גילוח, עוזב את החלק הדק, שממנו ניתן להשיג חלקים טורי.
3. באמצעות פיפטה של פסטר, ירידה בערך µL 0.5% אטומה פתרון (איור 6b) על גבי הדגימה שישמש עבור חלוקתה טורי, לעשות הדבק הצדדים בסעיף. מכסים את הדגימה כל פתרון אטומה. לספוג עודפי אטומה פתרון מיד עם חתיכת נייר סינון ממוקם בסמוך הדגימה. מקבל סרט סעיפים חיוני עבור צילום תמונות סעיפים תא טורי, אטומה דבק הוא מאוד שימושי עבור מנתחות את הסעיפים.
4. להכין 3 םיקדסה רשתות (בגדלים של חריצים: באמצע, 0.4 מ מ x 2.2 מ מ, שני הצדדים 0.2 מ"מ x 2.2 מ"מ) (איור 6 c) עבור אוסף קטעים סדרתי על ידי כיפוף בידית של הרשתות עד 60 ° צלזיוס, בטיפול הרשתות עם 0.5% אטומה פתרון, ולהפוך את הרשתות הידרופילית על ידי זוהר פריקה²².

6. ביצוע סעיפים טורי (איור 7-9)

1. המקום הרחוב דגימה צ'אק פנימה את האזמל הקטן במיקום זהה כמו 5.1 (איור 6a) על ידי יישור החלקים מוקלט. פעולה זו שומרת את פני בלוק לבין קצה הסכין מקבילים זה לזה באופן מושלם. ואז להביא את הסכין קרוב הדגימה.
2. למלא את הסירה את הסכין במים.
3. מכסים את האזמל הקטן עם כיסוי פלסטיק כדי למנוע זרימת אוויר (איור 7).
   הערה: זרימת אוויר במהלך חלוקתה ודק במיוחד, שליפת מקטעים לעיתים קרובות לגרום לבעיות. מכסה פלסטיק יש שלושה חורים: חור אחד הוא עבור עדשות המשקפת, שני החורים אחרים נועדו הזרועות לאפשר פעולה בעוד השער נמצא על. משענת עץ משמשת להנחה הידיים בזמן ביצוע עבודה עדינה, כגון אחזור מקטעים טורית בעזרת רשתות. משענת עץ מושם על שולחנות שונים מן השולחן מיקרוטום (איור 7, חצים), כדי לא לשדר את הרטט של הידיים של המפעיל האזמל הקטן.
4. לחתוך את הדגימה-עובי סעיף 200 ננומטר (איור 8). הגדרה-200 ננומטר בעובי יחסוך זמן להביא את הסכין אל פני השטח של הדגימה.
5. לאחר החלק הראשון הוא נחתך, להגדיר את עובי סעיף ל-70 ננומטר (איור 8).
6. כאשר מספר קטעים סדרתי מגיע ל- 20 (בדיוק מדברים, לאחר מגיע סרט כ 1.8 מ"מ; מספר קטעים משתנה בהתאם לרוחב של סעיפים), להגדיר את עובי סעיף 10 ננומטר (איור 8) תוך לחתוך.
   הערה: מאז האזמל הקטן לא יכול לחתוך קטעים ננומטר בעובי 10, אין סעיף חדש שמופיע ולאחר הסעיפים בעבר לחתוך המופרדות קצה הסכין. חשוב לקבל קבוצות מקטעים נפרדים (איור 9) עבור אוסף טורי מקטעים למנוע קושי הפרדת המקטעים באופן ידני באמצעות זוג קווצות שיער. כיוון התצוגה של השדה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים הוא 2.0 מ מ, החתכים צריכים להיות באורך 1.8 מ מ לכל היותר.
7. להגדיר את עובי סעיף 60 ננומטר (איור 8). זה יהיה לייצר nm 70 חלקים (איור 8) כי המכונה יוסיף את עובי nm 10 הקודם.
8. להגדיר את עובי סעיף חזרה ל-70 ננומטר (איור 8) ולהמשיך חיתוך עד 1.8-מ מארוך מקטעים מתקבלים.
9. חזור על 6.6-6.8 עד לחמישה מדורים ארוך מ מ 1.8 מתקבלים (איור 9). אנו מבצעים בדרך כלל חמש קבוצות מקטעים מאז יש חמש מחזיקי הדגימה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים זמינים במעבדה שלנו, אבל חמש דקות הם לא הגבול.

7. אוסף טורי מקטעים (איור 10-12)

1. במקום 'סעיף החזקת loop'²³ (בקוטר הפנימי של הלולאה: 5.0 מ"מ) (איור 10a) על קבוצת המקטע השלישי (איור 10 ב').
   הערה: זה הכרחי לאחזר את הסעיפים לפי סדר שלהם חלוקתה כדי לצלם תמונות בסדר הנכון. עם זאת, מאז יש חמש קבוצות מקטעים על הסירה את הסכין, זה לעתים קרובות מקבל מבלבל אילו קבוצות הם אשר. על ידי הנחת את הלולאה על הקבוצה השלישית, מתברר כי שתי הקבוצות ליד המפעיל הן הראשון, השני, ושני מרוחק מהמרכזן הן הקבוצות הרביעית והחמישית (איור 10 ב'). פעולה זו תמנע ערבוב את ההזמנה.
2. במקום 'הרמת-מים-פני לולאה'²³ (WSRL, הקוטר הפנימי של הלולאה: 4.0 מ"מ) (איור 11 א) על הבמה הסכין (איור 11b). WSRL לעמוד ביציבות על הבמה סכין כי הוא מצויד מגנט בתחתית.
   1. במקום הלולאה של WSRL ממש מעל הסעיפים טורי על-ידי הזזת מוט וידית שלה. להוריד את הלולאה של WSRL על גבי משטח מים כך הלולאה מקיף הסעיפים.
   2. לדחוף את הלולאה למטה על-ידי סיבוב הבורג כלפי מטה כך פני המים יעלה על ידי מתח (דמויות 11c-d). להעביר את המקטע למרכז הלולאה, למקם אותו על השיא של המים, ולהתאים את הכיוון של המקטע באמצעות קווצת שיער²¹.
   3. לאסוף קבוצות מקטעים על ידי נגיעה בו עם חשוף חריץ-רשת, אשר מוחזק על ידי פינצטה, המשיך מקביל פני המים (איור 11 d). חשוב עבור מקטעים הרשת נוגעת, לא המים, למקם קטעים בדיוק מרכז הרשת (איור 11 d).
3. מניחים את הרשתות עם מקטעים יחד עם טיפה קטנה של מים על ה Formvar תמיכה הסרט¹⁶ (איור 12), ולהסיר עודפי מים באמצעות נייר סינון.
   הערה: התקמטות של הסרט התמיכה הוא לעיתים קרובות בעיה כאשר מקטעים לאסוף באמצעות רשת תמיכה הסרט כי הממברנה (סעיפים) נוגע ישירות ממברנה (סרט, תמיכה). הבעיה של מקבל קמטים על הסרט תמיכה פוחת באופן משמעותי על-ידי הצבת רשת סעיף מניבי יחד עם טיפת מים זעירים הסרט תמיכה Formvar¹⁶.

8. צביעת סעיפים^16,24 (איור 13)

1. לאחר הסעיפים הם יבשים לחלוטין, לקרוע את הסרט Formvar מ סביב הרשתות, ולהסיר את רשתות הנושאת את המקטעים.
2. להגדיר את הרשתות לקצב של ה צינור מכתימים¹⁶ בסדר הנכון (איור 13), כתם מקטעים עם uranyl אצטט ולהוביל ציטראט²⁴.
   הערה: יש חריץ עמוק 0.6 מ"מ לאורך הציר הארוך של הצינור לחתוך עם סכין גילוח. הצינור שימושית למניעת שבירה מקרית של סרטים תמיכה כאשר באמצעות פינצטה, שכן טיפול ישיר של רשתות אין צורך במהלך ה מכתימים והניקיונות תהליך¹⁶.

9. תצפית סעיפים טורי (איור 14)

1. הגדר את רשתות 5 ב בעל הדגימה מרובות בסדר הנכון (איור 14 א'), המכוונת לציר הארוך של הסדק רשת בניצב לציר מחזיק הדגימה. הידיות (חץ) הרשתות לא צריך לחתוך, כי "הרשת-מקובל" לא תיגע האחיזה.
2. לתקן את הרשתות עם 'רשת-מקובל' (איור 14 ב) והכנס את מחזיק הדגימה לתוך המיקרוסקופ האלקטרוני שידור.
   הערה: לעתים קרובות שימושי לקחת תמונות הגדלה נמוכה של תא כל המקטעים (איור 15) למצוא מעניין מיקרואורגניזמים או תאים במצב טוב ללא זיהום, עם קיבוע טוב, לפני לקיחת תמונות של תא היעד.
3. לצלם תמונות של תאי היעד בכל המדורים תא בהגדלה.

תוצאות

ב פרוטוקול זה, שימשו םיקדסה שלוש רשתות אוסף קטעים טורי. הרשתות עשויות ניקל או נחושת. הסעיפים טורי ממוקמות על הסדק האמצעי. החריצים משני הצדדים יש צורך להציג את המקטעים בעת לאסוף אותם עם הרשת. כדי להשאיר את הרשתות במקביל הסעיפים טורי בעת לאסוף אותם עם פינצטה (איור...

Discussion

השיטה המוצגת כאן דורש אין ציוד יקר. זה דורש רק על מתלה אלומיניום (איור 3), םיקדסה שלוש רשתות (איור 6 ג), סעיף החזקת לולאות (איור 10a), לולאה הרמת-מים-פני השטח (איור 11 א) וצינור מכתימים (איור 13). ישנן תכונות רבות של השיט...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar making apparatus	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	652	W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide	Matsunami Co. Ltd., Osaka	-	76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	658	W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SM-LW 61 Ji
Trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Diamond knife for ultrathin sectioning	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna	-	Ultracut S
Mesa cut	Leica Microsystems, Vienna	-	Mirror
0.5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Special 3-slit nickel grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2458	Refer to this paper
Special 3-slit copper grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2459	Refer to this paper
Section-holding loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	526	Refer to this paper
Water-surface-raising loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	527	Refer to this paper
Staining tube	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Refer to this paper
Multi-specimen holder	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	Transmission electron microscope