Un metodo per ottenere il seriale sezioni ultrasottili di microrganismi in microscopia elettronica a trasmissione

Riepilogo

Questo studio presenta procedure affidabili e facili per ottenere sezioni ultrasottili seriale di un microorganismo senza costose attrezzature in microscopia elettronica di trasmissione.

Abstract

Osservazione di cellule e componenti delle cellule in tre dimensioni ad alto ingrandimento in microscopia elettronica di trasmissione richiede la preparazione di sezioni ultrasottili di serie dell'esemplare. Anche se la preparazione di sezioni ultrasottili seriale è considerato essere molto difficile, è piuttosto facile se viene utilizzato il metodo corretto. In questa carta, indichiamo una procedura dettagliata per ottenere in modo sicuro seriale sezioni ultrasottili di microrganismi. I punti chiave di questo metodo sono: 1) per utilizzare la gran parte dell'esemplare e regolare il bordo di superficie e coltello di esemplare affinché siano paralleli tra loro; 2) per tagliare le sezioni di serie in gruppi ed evitare difficoltà di separare sezioni usando un paio di ciocche di capelli durante il recupero di un gruppo di sezioni di serie sulle griglie a fessura; 3) utilizzare un 'sezione-holding loop' e evitare di confondere l'ordine dei gruppi di sezione; 4) per utilizzare un ciclo di acqua di superficie-sensibilizzazione e assicurarsi che le sezioni siano posizionate all'apice dell'acqua e che toccano la griglia in primo luogo, al fine di metterli nella posizione desiderata sulle griglie; 5) per utilizzare il film di supporto su un rack di alluminio e rendere più facile per recuperare le sezioni sulle griglie ed evitare grinze della pellicola supporto; e 6) utilizzare un tubo di colorazione ed evitare accidentalmente rompere il film di supporto con le pinzette. Questo nuovo metodo permette di ottenere sezioni ultrasottili seriale senza difficoltà. Il metodo permette di analizzare la struttura cellulare dei microrganismi ad alta risoluzione in 3D, che non può essere realizzato utilizzando il metodo ultramicrotomo raccolta nastro automatico e blocco-faccia seriale o fascio ionico focalizzato, microscopia elettronica a scansione.

Introduzione

Tecnica di sezionamento ultrasottile seriale corretta è indispensabile per lo studio di cellule e componenti cellulari tridimensionalmente a livello microscopico dell'elettrone. Abbiamo studiato la dinamica del corpo del mandrino palo nel ciclo cellulare delle cellule di lievito e ha rivelato i cambiamenti morfologici delle loro ultrastruttura durante il ciclo cellulare ed il tempo di duplicazione^{1,2,3, 4,5}. Nel 2006, abbiamo coniato una nuova parola 'structome' combinando 'struttura' e '-ome' e l'ha definita il 'informazioni strutturali quantitative e tridimensionale di una cella intera a livello microscopico dell'elettrone' ^6,7.

Dall'analisi di structome, che richiede tecnica seriale di sezionamento ultrasottile, si è constatato che una cellula di lievito Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis ha circa 200.000 ribosomi^7,8, un Escherichia coli cella aveva 26.000 ribosomi⁹, una cella di tubercolosi del micobatterio avuto 1.700 ribosomi¹⁰ e batteri a spirale Myojin avevano solo 300 ribosomi¹¹. Queste informazioni sono utili nella stima non solo il tasso di crescita in ogni organismo, ma anche nell'identificazione di specie⁹.

Inoltre, analisi di structome ha portato alla scoperta di un nuovo organismo; Parakaryon myojinensis è stato trovato nel mare profondo al largo delle coste del Giappone, la cui struttura di cella erano un intermedio tra quelli dei procarioti e negli eucarioti^12,13,14,15. Allo stato attuale, tecnica di sezionamento ultrasottile seriale è considerato essere così difficile che ci vorrebbe molto tempo per master. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo affidabile in cui chiunque può eseguire il sezionamento seriale ultrasottile senza difficoltà.

Protocollo

Nota: I campioni utilizzati in questo studio sono stati microrganismi, rapidamente congelati con propano in azoto liquido, congelare sostituiti in acetone contenente 2% tetrossido di osmio e incorporati in resina epossidica resina^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18}.

1. preparazione del supporto pellicola (Figura 1-3)

Nota: Color argento Formvar supporto pellicola viene preparata utilizzando il metodo di fusione su vetro¹⁹.

1. Aggiungere 100 mL di 1,5% Formvar in dicloruro di etilene a un apparato di Formvar-making (Figura 1). Tuffo a metà di una lastra di vetro (76 x 26 x 1,3 mm) nella soluzione di Formvar nella colonna superiore dell'apparecchio premendo la soluzione con l'aria attraverso la 'a' utilizzando una palla di gomma¹⁹.
   1. Scaricare la soluzione dalla colonna aprendo il rubinetto a tre vie e rilasciando aria attraverso 'b' per ridurre la pressione. Estrarre il vetrino dall'apparecchio e asciugare all'aria per formare una pellicola sulla superficie del vetrino. Utilizzare una lampada ad incandescenza per accelerare l'essiccazione del film Formvar.
2. Dopo raschiando i quattro bordi del film sul vetrino con una lama di rasoio (Figura 2a) e la respirazione sulla diapositiva per facilitare la separazione del film dalla diapositiva²⁰, galleggiare fuori la pellicola sull'acqua immergendo il vetrino nella acqua lentamente ad un angolo orizzontale basso (circa 10°, Figura 2b).
3. Raccogliere il film Formvar dall'acqua utilizzando un rack in alluminio (30 x 25 x 3 mm) con fori (4 mm di diametro) (Figura 3a). Mantenere il rack con il film di Formvar in un essiccatore fino all'utilizzo (Figura 3b).

2. tagliare il blocco di campione con una lama di taglio ad ultrasuoni e una lama di rasoio ²¹ sotto un microscopio stereoscopico (Figura 4)

1. Assicurarsi che non vi siano cellule sulla superficie del blocco osservando la punta del blocco con un microscopio ottico (Figura 4a).
2. Montare il blocco di esemplare nel mandrino (supporto del blocco) e montare il mandrino su un taglio fase²¹ (Figura 4b). Questa fase di taglio ha un meccanismo di illuminazione dal retro dell'esemplare.
3. Tagliare il blocco a una dimensione di 0,7 x 1,0 mm (figure 4 c, 5d). Poiché la resina epossidica è molto difficile, tagliare i blocchi in primo luogo usando una lama di taglio ad ultrasuoni. La lama di taglio ad ultrasuoni è una macchina appena introdotta, e i blocchi vengono facilmente eliminati. Quindi tagliare il blocco ulteriormente con una lama di rasoio. Tagliare una spalla per contrassegnare la direzione di taglio (Vedi Figura 5 d, Figura 8).

3. tagliare il blocco di esemplare con lama di diamante usando il microtomo (Figura 5)

1. Impostare il blocco di esemplare chuck nel portacampioni dell'ultramicrotomo. Collocare il campione 90° in senso antiorario contro la posizione effettiva quando sezionamento seriale ultrasottile è eseguita (Vedi Figura 5d).
2. La superficie del blocco di taglio con un coltello di taglio del diamante (Vedi Figura 5 d). Impostare il bordo del coltello di diamante parallelo alla faccia del blocco campione e tagliare la quantità minima di superficie del campione per non perdere alcun esemplare (Figura 5d).
   Nota: Questo passaggio viene fatto per lisciare la superficie del campione. La parte della superficie del campione della parte sottile è lasciata intatta (quindi questa parte non è brillante come uno specchio, Figura 5d), per non perdere qualsiasi parte dell'esemplare per sezionamento seriale. Questo è perché l'esemplare è esposto sulla superficie del blocco.
3. Posizionare uno specchio (taglio di Mesa, M) sul palco coltello per monitorare il taglio del blocco campione (Figura 5C).
4. Tagliare il bordo sinistro (che diventa il lato superiore, Figura 5d, del campione nella divisione di serie) del blocco utilizzando il coltello multiuso ruotando la fase coltello 30 ° a sinistra (Figura 5a).
5. Tagliare il volto di blocco a circa 100 µm dal bordo sinistro dell'esemplare (che diventa il lato inferiore del provino in sezionamento seriale, Figura 5d) ruotando la fase coltello 30 ° a destra (Figura 5b).
   Nota: Le sezioni di serie saranno tagliate dalla parte sottile dell'esemplare di circa 90 nm x circa 1 mm di dimensioni. La gran parte serviranno per regolare la superficie del campione e il bordo della lama in modo che sono parallele. Dopo aver regolato la superficie del campione per essere parallela al bordo del coltello, la gran parte verrà rimosso con una lama di rasoio. Tagliando i lati superiori e inferiori del campione usando il microtomo, entrambi i lati del provino diventano liscia ed esattamente parallelo a vicenda (Figura 5d), che è necessario per ottenere sezioni di nastro dritto e ininterrotta.

4. regolazione bordo esemplare di superficie e coltello in modo che si trovano ad affrontare parallelo a vicenda ²¹

1. Rimuovere il coltello multiuso e ruotare il blocco campione 90° in senso orario.
2. Impostare un coltello di taglio ultrasottile per la fase di coltello.
3. Regolare la superficie del campione e il bordo della lama in modo che si trovano ad affrontare parallelo a vicenda utilizzando la gran parte della superficie del campione.
   Nota: La maggior parte del campione viene utilizzata per la regolazione perché il volto di taglio di sezionamento seriale è così piccolo, rendendo difficile regolare il bordo di superficie e coltello esemplare utilizzando questa parte solo, soprattutto in direzione verticale. Così, utilizzando la grande parte dell'esemplare di facile regolazione.

5. diffusione soluzione in neoprene sul blocco campione (Figura 6)

1. Per posizionare il mandrino di esemplare esattamente nella stessa posizione come la posizione originale, applicare il nastro sul mandrino e titolare del mandrino del microtomo e tagliata sul confine (Figura 6a).
2. Prendere il campione chuck dal microtomo e posizionarlo sotto lo stereomicroscopio (Figura 6b). Tagliare la parte grande del campione con una lama di rasoio, lasciando la parte sottile, da cui si otterranno le sezioni di serie.
3. Utilizzando una pipetta Pasteur, cadere il campione da utilizzare per il sezionamento seriale, per rendere l'adesivo di lati di sezione soluzione di circa 1 µ l 0,5% in neoprene (Figura 6b). Coprire l'intero campione con soluzione in neoprene. Assorbire la soluzione in eccesso in neoprene immediatamente con un pezzo di carta da filtro posizionato vicino l'esemplare. Ottenere un nastro delle sezioni è essenziale per scattare foto di sezioni seriali delle cellule, e colla neoprene è molto utile per attaccare le sezioni insieme.
4. Preparare 3-fessura griglie (dimensioni delle fessure: centrale, 0,4 mm x 2,2 mm, entrambi i lati di 0,2 mm x 2,2 mm) (Figura 6C) per raccogliere le sezioni di serie piegando la maniglia delle griglie a 60 °, trattando le griglie con soluzione in neoprene 0,5% e rendendo le griglie idrofila di di scarico di incandescenza²².

6. rendere le sezioni di serie (Figura 7-9)

1. Posto il blocco campione chuck torna nel microtomo nella stessa posizione come 5.1 (Figura 6a) allineando le parti nastrate. Ciò mantiene il volto di blocco e il bordo della lama perfettamente parallelo a vicenda. Quindi portare il coltello vicino al campione.
2. Riempire la barca di coltello con acqua.
3. Coprire il microtomo con una copertura di plastica per impedire il flusso d'aria (Figura 7).
   Nota: Il flusso d'aria durante il sezionamento ultrasottile e il recupero di sezioni spesso causare problemi. Il coperchio di plastica ha tre fori: un buco è per le lenti del binocolo, e sono gli altri due fori per le braccia permettere il funzionamento mentre la copertura è su. Il bracciolo in legno è usato per posizionare le braccia mentre si fa un lavoro delicato, come il recupero di sezioni di serie con griglie. Il bracciolo in legno è posto su tabelle diverse dalla tabella microtomo (Figura 7, frecce), per non trasmettere le vibrazioni delle mani dell'operatore per il microtomo.
4. Iniziare a tagliare il campione allo spessore di sezione 200 nm (Figura 8). Impostazione a spessore di 200 nm farà risparmiare tempo nel portare il coltello alla superficie del provino.
5. Dopo la prima sezione è tagliata, è possibile impostare lo spessore di sezione a 70 nm (Figura 8).
6. Quando il numero delle sezioni di serie raggiunge 20 (precisamente parlando, dopo la raggiunge nastro circa 1.8 mm; il numero di sezioni varia a seconda della larghezza delle sezioni), impostare lo spessore di sezione a 10 nm (Figura 8) pur continuando a tagliare.
   Nota: Poiché il microtomo non può tagliare 10 nm di spessore sezioni, nessuna nuova sezione viene visualizzato, e le sezioni tagliate precedentemente diventano separate dal bordo della lama. È importante arrivare gruppi di sezioni separate (Figura 9) per raccogliere le sezioni di serie evitare difficoltà di separare le sezioni manualmente usando un paio di ciocche di capelli. Poiché il campo visivo del microscopio elettronico a trasmissione è 2.0 mm, sezioni dovrebbero essere al massimo 1,8 mm di lunghezza.
7. Impostare lo spessore di sezione a 60 nm (Figura 8). Questo produrrà 70 sezioni nm (Figura 8), perché la macchina aggiungerà spessore precedente 10 nm.
8. Impostare lo spessore di sezione torna a 70 nm (Figura 8) e continuare a tagliare fino a 1,8-mm-lungo sezioni sono ottenuti.
9. 6.6-6.8 Ripetere cinque sezioni lunghe 1,8 mm sono ottenuti (Figura 9). Facciamo solitamente cinque gruppi di sezioni, poiché ci sono cinque portacampioni il microscopio elettronico a trasmissione disponibile nel nostro laboratorio, ma cinque non è il limite.

7. raccogliendo le sezioni di serie (Figura 10-12)

1. Posizionare la 'sezione-holding loop'²³ (diametro interno del loop: 5,0 mm) (Figura 10a) sul terzo gruppo di sezione (Figura 10b).
   Nota: È necessario recuperare le sezioni nell'ordine loro sezionamento per prendere le immagini nell'ordine corretto. Tuttavia, poiché ci sono cinque gruppi di sezioni sulla barca coltello, spesso ottiene confondendo quali gruppi sono che. Inserendo il ciclo il terzo gruppo, diventa chiaro che i due gruppi vicino all'operatore sono il primo e secondo e i due distanti dall'operatore sono i gruppi di quarto e quinto (Figura 10b). Ciò impedirà di miscelazione l'ordine.
2. Luogo 'acqua di superficie-sensibilizzazione loop'²³ (WSRL, diametro interno del loop: 4,0 mm) (Figura 11a) sul palco del coltello (Figura 11b). Il WSRL sarà stare saldamente sul palco coltello perché è dotato di un magnete nella parte inferiore.
   1. Posizionare l'ansa della WSRL appena sopra le sezioni seriale spostando il suo albero e maniglia. Abbassare il ciclo di WSRL sulla superficie dell'acqua in modo che il ciclo circonda le sezioni.
   2. Spingere l'anello verso il basso ruotando la vite verso il basso, così che la superficie dell'acqua genererà dalla tensione superficiale (figure 11c-d). Spostare la sezione al centro del loop, posizionarlo sull'apice dell'acqua e regolare la direzione della sezione utilizzando un filo di capelli²¹.
   3. Pick up gruppi sezione toccandola con una fessura nuda-griglia, che è detenuta da pinzette e mantenuta parallela alla superficie dell'acqua (Figura 11d). È importante per sezioni a toccare la griglia in primo luogo, non l'acqua, a porre sezioni proprio al centro della griglia (Figura 11d).
3. Posizionare le griglie con sezioni insieme una piccola goccia di acqua su Formvar supporto pellicola¹⁶ (Figura 12) e rimuovere l'acqua in eccesso con carta da filtro.
   Nota: Increspatura del film di supporto è spesso un problema quando sezioni vengono prelevati utilizzando una griglia con supporto pellicola perché membrana (sezioni) tocca la membrana (supporto pellicola) direttamente. Il problema di ottenere le rughe sul film di supporto risulta significativamente ridotto inserendo una griglia di sezione-cuscinetto insieme con una goccia di acqua sulla Formvar supporto pellicola¹⁶.

8. colorazione di sezioni^16,24 (Figura 13)

1. Dopo le sezioni sono completamente asciutta, strappare il film di Formvar da intorno le griglie e togliere le griglie, le sezioni del cuscinetto.
2. Impostare le griglie nella scanalatura del tubo colorazione¹⁶ nell'ordine corretto (Figura 13) e macchia sezioni con uranile acetato e piombo citrato²⁴.
   Nota: C'è un solco profondo 0,6 mm lungo l'asse del tubo tagliato con una lama di rasoio. Il tubo è utile per evitare rotture accidentali del film di supporto quando usando la pinzetta, poiché la manipolazione diretta di griglie non è necessario durante la colorazione e lavatrice processo¹⁶.

9. osservazione delle sezioni di serie (Figura 14)

1. Impostare il 5 griglie nel supporto multi-campione nell'ordine corretto (Figura 14a), orientando l'asse lungo della fessura griglia perpendicolare all'asse di supporto del campione. Le maniglie (sagittarie) delle griglie non devono essere tagliati, perché la 'griglia-fissatori' non toccherà le maniglie.
2. Fissare le griglie con 'griglia-fissatori' (Figura 14b) e inserire il supporto del campione al microscopio elettronico a trasmissione.
   Nota: È spesso utile scattare immagini di basso ingrandimento di tutte le sezioni delle cellule (Figura 15) per trovare interessante microrganismi o cellule in buone condizioni senza contaminazione e con buoni agganci, prima di scattare fotografie la cella obiettivo.
3. Scattare foto delle cellule bersaglio in tutte le sezioni di cellule ad alto ingrandimento.

Risultati

In questo protocollo, tre-fessura griglie sono stati utilizzati per raccogliere le sezioni di serie. Le griglie sono costituite di nichel o rame. Le sezioni di serie vengono inserite nella fessura centrale. Le fessure su entrambi i lati sono necessari per visualizzare le sezioni quando raccoglierli con la griglia. Per mantenere le griglie parallele con le sezioni di serie quando li raccogliendo con le pinzette (Figura 11d), la maniglia è piegata (

Discussione

Il metodo qui presentato non richiede costose attrezzature. Richiede solo un rack di alluminio (Figura 3), tre-fessura griglie (Figura 6C), tenuta di sezione loop (Figura 10a), acqua di superficie-sensibilizzazione loop (Figura 11a) e un tubo di colorazione (Figura 13). Ci sono molte caratteristiche del presente metodo. La gran parte del campione viene utilizzata per regola...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar making apparatus	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	652	W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide	Matsunami Co. Ltd., Osaka	-	76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	658	W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SM-LW 61 Ji
Trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Diamond knife for ultrathin sectioning	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna	-	Ultracut S
Mesa cut	Leica Microsystems, Vienna	-	Mirror
0.5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Special 3-slit nickel grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2458	Refer to this paper
Special 3-slit copper grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2459	Refer to this paper
Section-holding loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	526	Refer to this paper
Water-surface-raising loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	527	Refer to this paper
Staining tube	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Refer to this paper
Multi-specimen holder	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	Transmission electron microscope