Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.

Zusammenfassung

Beobachtung von Zellen und Zellbestandteile in drei Dimensionen bei hoher Vergrößerung im Transmissions-Elektronenmikroskopie erfordert Vorbereitung ultradünne Schnittserien der Probe. Obwohl Vorbereitung ultradünne Schnittserien gilt als sehr schwierig sein, ist es ziemlich einfach, wenn die richtige Methode verwendet wird. In diesem Beitrag zeigen wir eine schrittweise Anleitung für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen sicher. Die wichtigsten Punkte dieser Methode sind: 1) verwenden Sie den großen Teil der Probe und Probe Oberfläche und Messer Rand anpassen, so dass sie parallel zueinander; (2) zu schneiden Schnittserien in Gruppen und vermeiden Schwierigkeiten beim trennen Abschnitte mit ein paar Haarsträhnen, wenn eine Gruppe von Serienschnitte auf den Schlitz-Netzen abgerufen werden; (3) zu verwenden, eine "Abschnitt-Holding-Schleife" und zu vermeiden, mischen Sie die Reihenfolge der Abschnittsgruppen; (4), verwenden Sie eine Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife, und stellen Sie sicher die Abschnitte auf der Spitze des Wassers positioniert sind und dass sie das Raster zuerst berühren, um sie in die gewünschte Position auf den Gittern zu platzieren; (5), verwenden Sie die Trägerfolie auf ein Aluminium-Gestell und machen es einfacher, die Abschnitte auf den Gittern zu erholen und zu vermeiden, von der Trägerfolie Faltenbildung; und 6) verwenden Sie eine Färbung zu vermeiden, versehentlich brechen die Unterstützung-Filme mit einer Pinzette. Diese neue Methode ermöglicht ultradünne Schnittserien ohne Schwierigkeiten. Die Methode ermöglicht die Zellstrukturen von Mikroorganismen mit hoher Auflösung in 3D, zu analysieren, die nicht mithilfe der automatischen Band sammeln regungsloses Methode und serielle Block-Gesicht oder fokussierten Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie erreicht werden kann.

Einleitung

Richtige ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik ist unerlässlich, um Zellen und Zellbestandteile dreidimensional auf mikroskopischer Ebene Elektron zu studieren. Wir haben untersucht die Dynamik der Spindel Pol Körper im Zellzyklus von Hefezellen und offenbart morphologische Veränderungen ihrer Ultrastruktur während des Zellzyklus und die Zeit von Doppelarbeit^{1,2,3, 4,5}. Im Jahr 2006 haben wir ein neues Wort "Structome" durch die Kombination von "Struktur" geprägt und "-Ome", und als die 'quantitative und dreidimensionalen Strukturinformationen einer ganzen Zelle auf mikroskopischer Ebene Elektron' ^6,7definiert.

Durch eine Structome Analyse, die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik erfordert, wurde festgestellt, dass eine Hefezelle von Saccharomyces Cerevisiae und Exophiala Dermatitidis etwa 200.000 Ribosomen^7,8, ein hatte Escherichia coli Zelle 26.000 Ribosomen⁹, Mycobacterium Tuberculosis Zelle hatte 1.700 Ribosomen¹⁰ und Myojin Spirale Bakterien hatten nur 300 Ribosomen¹¹. Diese Informationen sind hilfreich bei der Abschätzung der nicht nur der Wachstumsrate in jedem Organismus, sondern auch bei der Identifizierung von Arten⁹.

Darüber hinaus Structome Analyse führte zu die Entdeckung eines neuen Organismus; Parakaryon Myojinensis fand in der Tiefsee vor der Küste Japans, deren Zellstruktur waren ein Zwischenprodukt zwischen denen der Prokaryoten und Eukaryoten^12,13,14,15. Derzeit gilt die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik so schwer sein, dass es lange, zu meistern dauern würde. In dieser Studie haben wir eine zuverlässige Methode entwickelt, in der jemand serielle ultradünnen Schneiden problemlos durchführen kann.

Protokoll

Hinweis: Die Proben, die in dieser Studie verwendet wurden, Mikroorganismen, schnell mit Propan in flüssigem Stickstoff eingefroren substituierte in Aceton, enthält 2 % Osmium ausgefällt und eingebettet in Epoxy Harz^{1,2,3Einfrieren, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18}.

1. Vorbereitung der Trägerfolie (Abbildung 1-3)

Hinweis: Silberne Formvar Trägerfolie wird mit der auf Gußglas Methode¹⁹zubereitet.

1. 100 mL 1,5 % zugeben Formvar in Ethylen Paraquatdichlorid zu einer Formvar-Herstellung-Apparatur (Abbildung 1). Tauchen Sie die Hälfte einer Glas-Folie (76 x 26 x 1,3 mm) in Formvar Lösung in der oberen Spalte des Geräts durch Drücken der Lösung mit Luft durch "a" mit einem Rubber Ball¹⁹.
   1. Lassen Sie die Lösung aus der Spalte durch die drei-Wege-Absperrhahn öffnen und loslassen Luft durch 'b', Druck zu verringern. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Gerät genommen und trockene Luft zu bilden einen Film auf der Oberfläche der Folie Glas. Verwenden Sie eine weißglühende Lampe zur Beschleunigung der Trocknung des Formvar Films.
2. Nachdem die vier Kanten des Films auf dem Objektträger mit einer Rasierklinge (Abbildung 2a) abschaben, und atmen auf der Folie, die Trennung des Films aus der Folie²⁰, zu erleichtern die Folie auf dem Wasser zu schweben, durch Eintauchen der Objektträger in der das Wasser langsam in einem niedrigen horizontalen Winkel (ca. 10°, Abb. 2 b).
3. Schöpfe die Formvar Film aus dem Wasser mit einem Alu-Rack (30 x 25 x 3 mm) mit Löcher (4 mm Durchmesser) (Abb. 3a). Halten Sie das Gestell mit dem Formvar Film in den Exsikkator gestellt bis zur Verwendung (Abb. 3 b).

2. Trimmen des Probe-Blocks mit einem Ultraschall trimmen Klinge und eine Rasierklinge ²¹ unter einem Stereomikroskop (Abbildung 4)

1. Stellen Sie sicher, dass gibt es Zellen auf der Oberfläche des Blocks durch die Beobachtung der Spitze des Blocks mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 4a).
2. Montieren des Probe-Blocks in das Spannfutter (Block-Halter), und das Futter auf ein trimmen Bühne²¹ (Abbildung 4 b). Diese trimmen-Etappe hat einen Beleuchtung-Mechanismus von der Rückseite der Probe.
3. Schneiden Sie den Block auf eine Größe von 0,7 mm x 1,0 mm (Abb. 4 c, 5d). Da das Epoxidharz sehr hart ist, schneiden Sie die Blöcke zuerst mit einem Ultraschall trimmen Klinge. Die Ultraschall trimmen Klinge ist eine neu eingeführte Maschine, und die Blöcke sind leicht getrimmt. Dann schneiden Sie den Block weiter mit einer Rasierklinge. Schneiden Sie eine Schulter markieren die Richtung des Schneidens (siehe Abbildung 5 d, Abbildung 8).

(3) trimmen des Probe-Blocks mit Diamant Messer mit dem Mikrotom (Abbildung 5)

1. Inmitten des Probe Blocks Chuck Probenhalter für die regungsloses. Legen Sie die Probe 90° gegen den Uhrzeigersinn gegen die tatsächliche Position, wenn serielle ultradünnen Schnitt durchgeführt (siehe Abbildung 5-d).
2. Schneiden Sie die Oberfläche des Blocks mit einem Diamant Trimmmesser (siehe Abbildung 5 d). Diamant Messerschneide parallel zur Fläche Probe-Block gesetzt, und schneiden Sie den Mindestbetrag der Probenoberfläche um nicht zu verlieren, jede Probe (Abb. 5D).
   Hinweis: Dieser Schritt ist getan, um die Probenoberfläche zu glätten. Der Teil der Probenoberfläche schlanke Teil intakt (daher dieser Teil ist nicht glänzend wie ein Spiegel, Abbildung 5 d), um keinen Teil der Probe für serielle Schnitt verlieren. Und zwar deshalb, weil das Muster auf der Oberfläche des Blocks ausgesetzt ist.
3. Setzen Sie einen Spiegel (Mesa Schnitt, M) auf der Bühne Messer zum Schneiden von der Probe-Block (Abbildung 5 c) überwachen.
4. Schneiden Sie den linken Rand (Dies wird die Oberseite, Abbildung 5 d, der Probe im seriellen Schnitt) des Blocks mit Trimmmesser durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach links (Abb. 5a).
5. Schneiden Sie die Block-Fläche an etwa 100 µm vom linken Rand der Probe (Dies wird die Unterseite der Probe in seriellen Schnitt, Abbildung 5 d) durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach rechts (Abb. 5 b).
   Hinweis: Die Schnittserien schneidet sie aus dem schlanken Teil der Probe von etwa 90 nm x ca. 1 mm groß. Der Großteil wird zur Probenoberfläche und der Messerschneide anpassen, so dass sie parallel sind. Nach dem Einstellen der Probenoberfläche parallel zur Messerschneide sein, wird der große Teil mit einer Rasierklinge entfernt. Von oberen und unteren Rand der Probe mit dem Mikrotom schneiden, werden beide Seiten der Probe glatt und genau parallel zueinander (Abb. 5D), die ist notwendig, um gerade und ununterbrochene Band Abschnitte.

4. anpassen der Probe Oberfläche und Messer Kante, so dass sie Parallel zu einander ²¹ Gesicht

1. Entfernen Sie das Schneidmesser, und drehen Sie den Probe Block 90° im Uhrzeigersinn.
2. Legen Sie eine ultradünne Stationspunkte Messer auf der Messer-Bühne.
3. Einstellen Sie die Probenoberfläche und der Messerschneide so, dass sie Parallel zueinander mit dem Großteil der Probenoberfläche konfrontiert.
   Hinweis: Der Großteil der Probe wird zur Einstellung verwendet, denn das Schneiden Gesicht des seriellen Schnitt so klein ist, macht es schwierig, Probe Oberfläche und Messer Rand mit diesen Teil nur, vor allem in vertikaler Richtung anpassen. So macht mit dem großen Teil der Probe Anpassung leicht.

5. Verbreitung Neopren-Lösung auf die Probe-Block (Abbildung 6)

1. Um die Probe Futter an genau der gleichen Position wie die ursprüngliche Position zu platzieren, bringen Sie Klebeband auf das Futter und Futter Inhaber Mikrotom und schneiden Sie an der Grenze (Abb. 6a).
2. Nehmen Sie das Präparat Chuck aus Mikrotom, und legen Sie es unter dem Stereomikroskop (Abb. 6 b). Schneiden Sie den Großteil der Probe mit einer Rasierklinge, indem man die schlanken Teil, unter dem Schnittserien erhältlich sind.
3. Mit einer Pasteurpipette, fallen Sie ca. 1 µL 0,5 % Neopren Lösung (Abb. 6 b) auf die Probe, für serielle Schnitt verwendet werden, um den Abschnitt Seiten Klebstoff zu machen. Decken Sie die gesamte Probe mit Neopren-Lösung. Absorbieren Sie überschüssige Neopren Lösung sofort mit einem Stück Filterpapier in der Nähe der Probekörpers. Eine Band der Abschnitte ist essentiell für die Bilder von seriellen Zellteile und Neoprenkleber ist sehr nützlich für die Abschnitte zusammenkleben.
4. 3-Schlitz-Netze vorzubereiten (Größe der Schlitze: Mitte, 0,4 mm x 2,2 mm, beide Seiten 0,2 mm x 2,2 mm) (Abbildung 6 c) für die Abholung Schnittserien durch Biegen des Griffs der Netze 60°, behandeln die Netze mit 0,5 % Neopren-Lösung, und machen die Netze von hydrophilen Leuchten Sie Entlastung²².

6. Herstellung Serienschnitte (Abbildung 7-9)

1. Ort der Probe Block Futter zurück in das Mikrotom an der gleichen Position wie 5.1 (Abb. 6a) durch Ausrichten der aufgezeichneten Teile. Dies hält die Block-Gesicht und die Messerschneide vollkommen parallel zueinander. Dann bringen Sie das Messer in der Nähe der Probe.
2. Füllen Sie das Messer-Boot mit Wasser.
3. Decken Sie das Mikrotom mit einer Kunststoff-Abdeckung, Luftstrom (Abbildung 7) zu verhindern.
   Hinweis: Luftstrom während der ultradünnen schneiden und Abruf der Abschnitte oft Probleme verursachen. Die Kunststoffabdeckung verfügt über drei Löcher: ein Loch ist für das Fernglas Objektive, und die beiden anderen Löcher sind für die Arme um den Betrieb zu ermöglichen, während der Deckel auf. Die hölzerne Armlehne dient für die Platzierung der Arme dabei heikle Arbeit, z. B. Abrufen von Schnittserien mit Gittern. Die hölzerne Armlehne befindet sich auf verschiedene Tabellen aus der Mikrotom-Tabelle (Abbildung 7, Pfeile), um nicht die Schwingung der Hände des Bedieners, Mikrotom zu übertragen.
4. Fang an zu schneiden die Probe bei 200 nm Dicke (Abbildung 8). Einstellung bei 200 nm Dicke sparen Zeit, darin das Messer an der Oberfläche der Probe.
5. Nach den ersten Schnitt gesetzt die Schnittdicke bis 70 nm (Abbildung 8).
6. Wenn die Anzahl der Schnittserien erreicht 20 (genau gesagt, nach der Band erreicht etwa 1,8 mm; die Anzahl der Abschnitte abhängig von der Breite der Abschnitte variiert), setzen die Schnittdicke bis 10 nm (Abbildung 8) gleichzeitig schneiden.
   Hinweis: Da das Mikrotom 10 nm dicke Abschnitte schneiden kann, keine neuer Abschnitt erscheint, und die zuvor Zuschnitte von der Messerschneide getrennt werden. Es ist wichtig, um getrennte Abschnittsgruppen (Abbildung 9) für die Abholung Serienschnitte, Schwierigkeiten bei der Trennung von Abschnitten, die manuell über ein paar Haarsträhnen zu vermeiden. Da das Sichtfeld in der Transmissions-Elektronenmikroskop 2,0 mm ist, sollte Abschnitte höchstens 1,8 mm lang sein.
7. Legen Sie die Schnittdicke bis 60 nm (Abbildung 8). Dies wird 70 nm Abschnitte (Abbildung 8) produzieren, weil die Maschine die letzten 10 nm Dicke hinzufügen wird.
8. Legen Sie die Schnittdicke wieder auf 70 nm (Abbildung 8) und das Schneiden fortsetzen, bis 1,8 mm lange Abschnitte erhalten sind.
9. Wiederholen Sie 6,6-6,8 bis fünf 1,8 mm lange Abschnitte (Abbildung 9) erreicht werden. Wir machen in der Regel fünf Abschnittsgruppen, da gibt es fünf Probenhalter in der Transmissions-Elektronenmikroskop in unserem Labor zur Verfügung, aber fünf nicht das Limit ist.

7. Abholung Serienschnitte (Abbildung 10-12)

1. Legen Sie die "Abschnitt-Holding-Schleife"²³ (innerer Durchmesser der Schleife: 5,0 mm) (Abb. 10a) auf die dritte Abschnittsgruppe (Abbildung 10).
   Hinweis: Es ist erforderlich, um die Abschnitte in der Reihenfolge ihrer schneiden zu fotografieren in der richtigen Reihenfolge abzurufen. Aber da auf dem Messer Boot gibt es fünf Abschnittsgruppen, ruft es oft verwirrend, welche Gruppen sind. Wenn Sie die Schleife auf der dritten Gruppe, wird klar, dass die beiden Gruppen in der Nähe der Betreiber sind die erste und zweite und entfernte zwei vom Betreiber sind die vierten und fünften Gruppen (Abbildung 10). Dadurch wird verhindert, die Reihenfolge vertauschen.
2. Legen Sie "Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife"²³ (WSRL, Innendurchmesser der Schleife: 4,0 mm) (Abb. 11a) auf der Bühne Messer (Abbildung 11 b). Die WSRL wird fest auf der Messer-Bühne stehen, weil es mit einem Magneten an der Unterseite ausgestattet.
   1. Legen Sie die Schleife der WSRL oberhalb der Schnittserien durch bewegte seinen Schaft und Griff. Senken Sie die Schlaufe des WSRL auf die Wasseroberfläche, so dass die Schleife in den Abschnitten umkreist.
   2. Drücken Sie die Schleife durch Drehen der Schraube nach unten, so dass die Wasseroberfläche durch Oberflächenspannung (Zahlen 11 c-d) auslöst. Verschieben Sie den Abschnitt in der Mitte der Schleife, positionieren Sie es an die Spitze des Wassers und passen Sie die Richtung des Abschnitts mithilfe einer Haar-Strang-²¹.
   3. Abschnittsgruppen durch Berührung mit einem nackten Schlitz-Raster, die von einer Pinzette gehalten und immer parallel zur Wasseroberfläche (Abbildung 11 d) abholen. Es ist wichtig für Abschnitte, das Netz zuerst berühren nicht das Wasser, um Abschnitte genau in der Mitte des Rasters (Abbildung 11 d) zu platzieren.
3. Legen Sie die Gitter mit Abschnitten zusammen mit einem Tropfen Wasser auf Formvar Unterstützung Film¹⁶ (Abbildung 12), und entfernen Sie überschüssiges Wasser mit Filterpapier.
   Hinweis: Faltenbildung der die Trägerfolie ist oft ein Problem wenn Abschnitte mithilfe eines Rasters mit Trägerfolie abgeholt werden, weil Membran (Abschnitte) Membran (Trägerfolie) direkt berührt. Das Problem der immer Falten auf der Trägerfolie wird deutlich reduziert, indem ein Abschnitt tragenden Raster zusammen mit einem Tropfen Wasser auf die Formvar Unterstützung Film¹⁶.

(8) Färbung Abschnitte^16,24 (Abbildung 13)

1. Nach die Abschnitten vollständig getrocknet sind, reißen Sie den Formvar Film von rund um die Netze zu, und entfernen Sie die Gitter mit den Abschnitten.
2. Legen Sie die Gitter in die Nut der die Färbung Rohr¹⁶ in der richtigen Reihenfolge (Abbildung 13), und Flecken Sie Abschnitte mit Uranyl Acetat und Blei Citrat²⁴.
   Hinweis: Befindet sich eine Nut 0,6 mm tief entlang der Längsachse des Rohres mit einer Rasierklinge geschnitten. Die Röhre ist nützlich zur Vermeidung versehentlichen Bruch der Unterstützung Filme Verwendung einer Pinzette, da direkte Handhabung von Grids während der Färbung und waschen Prozess^{16 entfällt}.

9. Beobachtung der Schnittserien (Abbildung 14)

1. Legen Sie die 5 Raster im Multi-Probenhalter in der richtigen Reihenfolge (Bild 14a), Ausrichtung der Längsachse der Raster Schlitz senkrecht zur Probe Halter. Die Griffe (Pfeilspitzen) der Netze müssen nicht geschnitten werden, da die Raster-Fixierer die Griffe nicht berührt werden.
2. Befestigen Sie die Gitter mit "Raster-Fixierer" (Abb. 14 b) und der Transmissions-Elektronenmikroskop einfügen Sie Probenhalter.
   Hinweis: Es ist oft nützlich, geringer Vergrößerung Bilder von allen Zellteile (Abbildung 15), interessante Mikroorganismen oder Zellen in gutem Zustand ohne Kontamination und mit gute Fixierung zu finden nehmen vor dem Fotografieren der Zielzelle.
3. Machen Sie Fotos von den Zielzellen in allen Zellteile bei hoher Vergrößerung.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurden 3-Schlitz-Raster für die Abholung Schnittserien verwendet. Die Gitter sind aus Nickel oder Kupfer gefertigt. Die Schnittserien befinden sich auf den mittleren Schlitz. Die Schlitze auf beiden Seiten sind notwendig, um die Abschnitte anzuzeigen, wenn sie mit dem Netz aufnehmen. Um die Netze parallel mit der Schnittserien halten, wenn sie mit einer Pinzette (Abbildung 11 d) aufnehmen, ist der Griff gebogen (Abb. ...

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode erfordert keine teure Ausrüstung. Es erfordert nur ein Alu-Rack (Abbildung 3), 3-Schlitz-Raster (Abbildung 6 c), Abschnitt-Holding Schleifen (Abb. 10a), Wasser-Oberfläche-Anhebung Schleife (Abbildung 11a) und eine Färbung Rohr (Abbildung 13). Es gibt viele Features des vorliegenden Verfahrens. Der große Teil der Probe wird verwendet, um die...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar making apparatus	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	652	W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide	Matsunami Co. Ltd., Osaka	-	76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	658	W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SM-LW 61 Ji
Trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Diamond knife for ultrathin sectioning	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna	-	Ultracut S
Mesa cut	Leica Microsystems, Vienna	-	Mirror
0.5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Special 3-slit nickel grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2458	Refer to this paper
Special 3-slit copper grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2459	Refer to this paper
Section-holding loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	526	Refer to this paper
Water-surface-raising loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	527	Refer to this paper
Staining tube	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Refer to this paper
Multi-specimen holder	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	Transmission electron microscope