전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

요약

이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.

초록

셀 및 전송 전자 현미경 검사 법에서 고배율에서 3 차원 구성 요소 셀을 관찰 표본의 직렬 ultrathin 섹션을 준비 해야 합니다. 직렬 ultrathin 섹션 준비는 매우 어려운 것으로 간주 됩니다, 하지만 그것은 오히려 쉬운 경우 적절 한 메서드를 사용 하입니다. 이 종이에 우리는 안전 하 게 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 단계별 절차를 보여줍니다. 이 방법의 핵심 포인트는: 1)는 시료의 큰 부분을 사용 하 여 견본 표면 및 칼 가장자리; 서로 평행 하 게 되도록 조정 하 2)을 그룹에서 직렬 섹션을 잘라내어 슬릿 격자;에 직렬 섹션의 그룹을 검색할 때 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 3) '섹션 지주 루프'를 사용 하 여 섹션 그룹;의 순서를 혼합 하지 마십시오 4) 사용 하 여 '물 표면 높이 루프' 확인 섹션의 꼭대기에 위치 하는 그들은 터치 그리드 첫째, 격자;에 원하는 위치에 배치 하려면 5) 사용 하 여 지원 영화는 알루미늄 선반에 쉽게 격자에 섹션을 복구 하 고 지원 영화;의 주름을 방지 하 그리고 6) 얼룩 튜브를 사용 하 여 실수로 핀셋으로 지원 영화를 위반을 피하기 위해. 이 새로운 메서드는 어려움 없이 직렬 ultrathin 섹션을 취득 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 3d, 집중 된 이온 빔 전자 현미경 검사 및 직렬 블록-얼굴 또는 자동 테이프 수집 ultramicrotome 메서드를 사용 하 여 얻을 수 없는 높은 해상도에서 미생물의 세포 구조를 분석 가능 하 게.

서문

적절 한 직렬 ultrathin 단면 기술은 세포와 세포 구성 요소 전자 현미경 수준에서 3 차원으로 공부에 불가결 이다. 우리 효 모 세포의 세포 주기에서 스핀 들 극 본문의 역학을 공부 하 고 세포 주기 및 중복^1,2,3, 의 시간 동안 그들의 열 대권 외의 형태학 변화 공개 ^4,5. 2006 년에, 우리는 '구조'를 결합해 새로운 단어 'structome'를 만들어낸와 '-오 ', '양적 및 3 차원 구조 정보 전자 현미경 수준에 전체 셀의 ' ^6,7로 정의.

Structome 분석, 직렬 ultrathin 단면 기술을 요하는 그것 발견 Saccharomyces cerevisiae 와 Exophiala dermatitidis 효 모 세포 약 200000 리보솜^7,8, 는 했다 대장균 셀 26000 리보솜⁹, 결핵균 셀 했다 1700 리보솜¹⁰ 고 묘 진 나선형 박테리아만 300 리보솜¹¹했다. 이 정보 뿐만 아니라 각 유기 체 뿐만 아니라 종⁹의 성장 율을 예측에 유용 합니다.

또한, 새로운 유기 체;의 발견에 지도 하는 structome 분석 Parakaryon myojinensis 는 누구의 셀 구조 원핵생물과 진핵생물^12,13,,1415의 그들 사이 중간 했다 일본의 해안 떨어져 깊은 바다에서 발견 되었다. 현재, 직렬 ultrathin 단면 기술 너무 어려운 마스터 오랜 시간이 걸릴 것으로 간주 됩니다. 이 연구에서는 아무도 직렬 ultrathin 단면 어려움 없이 수행할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 개발 했습니다.

프로토콜

참고:이 연구에 사용 된 표본은 미생물, 액체 질소, 프로 판으로 급속 하 게 냉동 동결 2% 오스뮴 tetroxide, 포함 된 아세톤에 대체 및 에폭시 수 지^1,2,3,^{에에서 포함 된 4,5,6,7,,89,10,11,12,13 ,,1415,,1617,18}.

1. 지원 영화 (그림 1-3)의 준비

참고: 은색 Formvar 지원 영화 캐스팅에 유리 방법¹⁹를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다.

1. 100 mL 1.5%의 추가 Formvar Formvar 만드는 장치 (그림 1)을 에틸렌 dichloride에. 공기 고무 공¹⁹를 사용 하 여 'a'를 통해 솔루션을 눌러 유리 슬라이드 (76 m m 26 m m x 1.3 m m x) 기구의 상단 열에서 Formvar 솔루션에서의 절반을 찍어.
   1. 3-방법으로 자 지를 열고 공기 압력을 줄이기 위해 'b'를 발표 하 여 열에서 솔루션을 배출. 유리 슬라이드 표면에 필름 형태의 유리 슬라이드와 공기에서 건조 장치에서 꺼내 주세요. 백열 램프를 사용 하 여 Formvar 영화의 건조를 가속.
2. 영화 (그림 2a), 면도날으로 유리 슬라이드에 4 개의 가장자리에서 근 근이, 슬라이드²⁰에서 영화의 분리를 촉진 하기 위해 슬라이드에 호흡으로 유리 슬라이드를 immersing 하 여 물에 영화에서 부동 하는 후에 물이 천천히 낮은 수평 각도 (약 10 °, 그림 2b).
3. 구멍 (지름 4 mm) 알루미늄 랙 (25 m m x 3 m m x 30)를 사용 하 여 물에서 Formvar 영화 올리다 (그림 3a). 사용 (그림 3b)까지 한 desiccator Formvar 영화와 함께 랙 유지.

2. 초음파 트리밍 블레이드와 면도날 ²¹ stereomicroscope (그림 4)에서 표본 블록 트리밍

1. 셀 블록의 표면에는 블록의 끝 (그림 4a) 가벼운 현미경으로 관찰 하 여 다는 것을 확인 하십시오.
2. 척 (블록 홀더), 표본 블록을 탑재 하 고 트리밍 단계²¹ (그림 4b)에 물림 쇠를 탑재. 이 트리밍 단계는 표본 뒤쪽에서 조명 메커니즘이 있습니다.
3. 0.7 m m x 1.0 m m (그림 4, 5)의 크기에 블록을 잘라. 에폭시 수 지 매우 하드 이기 때문에, 먼저 초음파 트리밍 블레이드를 사용 하 여 블록을 잘라. 초음파 트리밍 블레이드는 새로 도입된 된 기계 이며 블록 쉽게 잘립니다. 다음에 면도날으로 더 블록 트림. (참조 그림 5 d, 그림 8) 절단의 방향을 표시 한 어깨를 잘라.

3. 톰 (그림 5)를 사용 하 여 다이아몬드 칼으로 표본 블록 트리밍

1. ultramicrotome의 견본 홀더 척 견본 블록 설정 합니다. 장소는 표본 90도 시계 반대 방향으로 직렬 ultrathin 단면 때 실제 위치에 대 한 수행 (참조 그림 5 d).
2. 다이아몬드 트리밍 나이프 (참조 그림 5 d)와 블록의 표면을 잘라. 다이아몬드 칼 날 견본 블록 얼굴에 평행 하 게 설정 하 고 어떤 견본 (그림 5 d)을 잃을 수 없습니다 견본 표면의 최소 금액을 잘라.
   참고:이 단계 표본 표면을 매끄럽게 수행 됩니다. 슬림 부분의 견본 표면의 일부는 그대로 (따라서이 부분은 아니라 처럼 빛나는 거울, 그림 5 d), 직렬 단면에 대 한 표본의 일부를 잃을 수 없습니다. 이것은 표본 블록의 표면에 노출 되어 있기 때문 에입니다.
3. 표본 블록 (그림 5c)의 절단을 모니터링 하는 데 칼 스테이지의 거울 (메사 컷, M)를 배치 합니다.
4. 잘라 칼 무대 왼쪽 (그림 5a)에 30 ° 회전 하 여 트리밍 나이프를 사용 하 여 블록의 왼쪽된 가장자리 (이것은 상단에, 그림 5 d, 직렬 단면에 샘플의 된다).
5. 칼 무대 오른쪽 (그림 5b)에 30 ° 회전 하 여 표본 (이 됩니다 직렬 단면, 그림 5 d에 견본의 더 낮은 측)의 왼쪽된 가장자리에서 약 100 µ m에서 블록 얼굴을 잘라.
   참고: 직렬 섹션은 약 90의 견본의 슬림 부분에서 삭감 될 것 이다 nm 크기에서 약 1 m m x. 큰 부분은 평행 되도록 견본 표면 및 칼 날을 조정 하기 위해 사용 됩니다. 칼 날에 평행 되도록 견본 표면 조정 후 큰 부분 면도날으로 제거 됩니다. 톰을 사용 하 여 견본의 상단 및 하단 측면을 절단 하 여 표본 양쪽 모두 될 원활 하 고 정확 하 게 서로 평행 하 게 (그림 5 d)는 직선과 끊어지지 리본 섹션을 얻을 필요가 있다.

4. 조정 견본 표면 및 칼 가장자리를 서로 ²¹ 병렬 마주

1. 트리밍 나이프를 제거 하 고 표본 블록 시계 방향으로 90 ° 회전.
2. 칼 단계로 ultrathin 단면 나이프를 설정 합니다.
3. 서로 견본 표면의 큰 부분을 사용 하 여 병렬 마주 견본 표면 및 칼 날을 조정 합니다.
   참고: 큰 표본 부분의 사용 됩니다 조정 직렬 단면 절단 얼굴 너무 작습니다, 어렵게 견본 표면 및 칼 지만,이 부분을 사용 하 여 수직 방향에 특히 조정 때문에. 따라서, 표본의 큰 부분을 사용 하 여 쉽게 조정 합니다.

5. 견본 블록 (그림 6)에 네오프렌 솔루션 확산

1. 원래 위치와 정확히 같은 위치에 견본 척을 배치 하는 척 척 홀더는 톰의에 테이프를 적용 하 고 경계 (그림 6a)에서 잘라.
2. 톰에서 표본 척 밖으로 하 고 stereomicroscope (그림 6b)에서 그것을 배치. 면도날으로 견본의 큰 부분을 잘라, 슬림 부분 직렬 섹션에서 떠나는 것입니다 얻을 수 있습니다.
3. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 섹션 측 접착제 있도록 직렬 단면에 사용할 표본에 약 1 µ L 0.5 %neoprene 솔루션 (그림 6b) 드롭. 커버 neoprene 솔루션 전체 표본. 필터 종이 시료 근처에 배치와 함께 과잉 neoprene 솔루션을 즉시 흡수. 섹션의 리본을 얻기 직렬 셀 섹션의 사진 촬영을 위한 필수적 이며 neoprene 접착제 섹션을 함께 튀어나와 매우 유용.
4. 준비 3-슬릿 격자 (슬릿의 크기: 중간, 0.4 m m x 2.2 m m, 모두 양쪽 0.2 m m x 2.2 m m) (그림 6c) 60 ° 격자의 핸들 여 직렬 섹션을 따기 위한 치료 0.5 %neoprene 솔루션, 격자 및 격자에 의해 친수성 만들기 글로우 방전²².

6. 직렬 섹션 (그림 7-9)

1. 장소 견본 블록 녹화 부분을 정렬 하 여 5.1 (그림 6a)와 같은 위치에서 톰에 다시 척. 이 블록 얼굴과 칼 날 완벽 하 게 서로 평행 하 게 유지합니다. 다음에 견본에 가까운 칼가지고.
2. 물으로 칼 보트를 채우십시오.
3. 공기 (그림 7)를 방지 하기 위해 플라스틱 커버는 톰을 커버.
   참고: 공기 ultrathin 단면화 및 섹션의 자주 검색 하는 동안 문제가 발생할. 플라스틱 덮개는 3 개의 구멍: 한 구멍 쌍 안 렌즈 이며 다른 두 구멍 덮개에 사용 하는 동안 작업을 허용 하도록 무기에 대 한. 나무 팔걸이 격자와 직렬 섹션을 검색 하는 등 섬세 한 작업을 하 고 있는 동안 무기를 배치 하는 데 사용 됩니다. 나무 팔걸이 톰 연산자의 손의 진동 전송 수 없습니다 톰 테이블 (그림 7, 화살표), 다른 테이블에 배치 됩니다.
4. 200 nm 섹션 두께 (그림 8)에 시료를 절단 시작 합니다. 200 nm 두께 시료의 표면에 칼을 데 려에 시간을 절약할 것 이다.
5. 첫 번째 섹션을 잘라 후 설정 섹션 두께 70 nm (그림 8).
6. 직렬 섹션의 수에 (정확 하 게 말하기, 약 1.8 m m; 섹션의 수에 따라 섹션의 폭의 리본에 도달 후) 20를 도달 하는 경우, 설정 섹션 두께 10 nm (그림 8)을 계속 하는 동안.
   참고: 이후는 톰 10 nm 두꺼운 섹션을 잘라낼 수 없는, 아니 새로운 섹션 나타나고 이전 컷된 섹션에서 칼 날 분리 되. 그것은 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 수동으로 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 직렬 섹션을 따기 위한 분리 된 섹션 그룹 (그림 9)를 얻는 것이 중요. 전송 전자 현미경에서 시야 2.0 m m 이므로, 섹션에서 가장 긴 1.8 m m 이어야 한다.
7. 설정 섹션 두께 60 nm (그림 8). 이 기계는 이전 10 nm 두께 추가 합니다 때문에 70 nm 섹션 (그림 8)을 생산할 예정 이다.
8. 섹션 두께 70 다시 설정 nm (그림 8) 절단 1.8 m m 긴 섹션 얻을 때까지 계속.
9. 6.6-6.8를 반복 하 여 1.8 m m 긴 섹션 5 (그림 9) 얻을 수 있습니다. 우리가 일반적으로 이후 5 견본 홀더 전송 전자 현미경에서 우리의 실험실에서 사용할 수 있지만 5도 아니다 5 섹션 그룹을 확인 합니다.

7. 직렬 섹션 (그림 10-12)를 따기

1. '루프 섹션 지주'²³ 장소 (루프의 내부 직경: 5.0 m m) (그림 10a)에 세 번째 섹션 그룹 (그림 10b).
   참고: 그것은 적절 한 순서로 사진을 찍을 그들의 단면 순서 섹션을 검색 하는 데 필요한입니다. 그러나 칼 보트에 5 섹션 그룹 이후, 그것은 종종 되 면 혼동 그룹은. 세 번째 그룹에는 루프를 두어서, 그것은 분명해 연산자 가까이 두 그룹은 첫 번째 및 두 번째, 그리고 연산자에서 먼 2는 네 번째 및 다섯 번째 그룹 (그림 10b). 이 순서를 혼합 되지 것입니다.
2. '물 표면 높이 루프'²³ 장소 (WSRL, 루프의 내부 직경: 4.0 m m) (그림 11a) 칼 스테이지 (그림 11b). WSRL 하단에 자석으로 되어 있기 때문에 칼 무대에 굳게 설 것 이다.
   1. 그것의 축과 핸들을 이동 하 여 직렬 섹션 바로 위에 WSRL의 루프를 배치 합니다. 낮은 물 표면에 WSRL의 루프는 루프 encircles 섹션.
   2. 물 표면 표면 장력 (그림 11 c-d)에 의해 발생 합니다 있도록 나사를 아래쪽으로 선회 하 여 루프를 아래로 누릅니다. 섹션 루프의 중심을 이동, 물의 꼭대기에 위치 하 고 머리 가닥²¹을 사용 하 여 섹션의 방향을 조정 합니다.
   3. 벌 거 벗은 슬릿-그리드, 핀셋에 의해 개최 되 고 (그림 11 d) 물 표면에 평행 하 게 유지 하는 그것을 만져 섹션 그룹을 선택 합니다. 그것은 섹션 그리드를 먼저 터치 하는 물, 격자 (그림 11 d)의 중앙에 정확 하 게 섹션을 배치 하는 것이 중요.
3. 물 작은 방울과 함께 섹션 격자를 Formvar 지원 영화¹⁶ (그림 12)에 놓고 필터 종이 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다.
   참고: 지원 영화의 주름 때 종종 문제가 섹션 선택 사용 하 여 그리드 지원 영화 막 (섹션) 막 (지원 영화)를 직접 접촉 하기 때문에. 지원 영화에 주름을 지 고의 문제는 Formvar 지원 영화¹⁶에 물 작은 방울과 함께 섹션 베어링 그리드를 배치 하 여 크게 감소 된다.

8. 얼룩 섹션^16,24 (그림 13)

1. 섹션은 완전히 건조 후 격자, 주위에서 Formvar 영화 눈물 고 섹션 베어링 격자를 제거 합니다.
2. (그림 13), 적절 한 순서로 얼룩 튜브¹⁶ 의 홈에 격자를 설정 하 고 얼룩 uranyl 아세테이트 및 리드 시트르산²⁴섹션.
   참고: 저기 홈 깊이 0.6 m m 튜브의 긴 축을 따라 면도날으로 잘라. 튜브는 격자의 직접 처리 얼룩 및 세탁기 과정¹⁶동안 필요 하지 않습니다 이후 핀셋를 사용 하는 경우 지원 영화의 실수로 파손을 방지 하기 위한 유용 합니다.

9. 직렬 섹션 (그림 14)의 관찰

1. 방향을 견본 홀더 축에 수직 그리드 슬릿의 긴 축에 적절 한 순서로 (그림 14a), 멀티 견본 홀더 5 격자를 설정 합니다. 격자의 핸들 (화살촉) 할 필요가 없습니다 수 컷, ' 그리드 설치 ' 핸들 건드리지 않을 때문에.
2. ' 그리드-설치 ' (그림 14b)와 격자를 해결 하 고 전송 전자 현미경 견본 홀더를 삽입.
   참고: 그것은 종종 목표 셀의 사진을 복용 하기 전에 모든 셀 섹션 (그림 15) 좋은 조건 좋은 고정과 오염 없이 재미 있는 미생물 또는 세포를 찾을 수의 낮은 확대 이미지를 유용 합니다.
3. 높은 확대에 모든 셀 섹션에 대상 셀의 사진을 찍을.

결과

이 프로토콜에서는 3-슬릿 격자 직렬 섹션을 따기 위해 사용 되었다. 격자는 니켈 이나 구리의 만들어집니다. 직렬 섹션 중간 슬릿에 배치 됩니다. 양쪽에 슬릿 그리드와 그들을 따기 때 섹션을 볼 필요가 있습니다. 핀셋 (그림 11 d)으로 그들을 따기 때 격자를 직렬 섹션으로 병렬 계속 핸들 굽습니다 (그림 6 c, 오른쪽). 작은 핸들...

토론

여기에 제시 된 방법을 비싼 장비를 요구 한다. 그것은 필요로 한 알루미늄 랙 (그림 3), 3-슬릿 격자 (그림 6c), 섹션 지주 루프 (그림 10a), 루프 물 표면 높이 (그림 11a), 및 얼룩 튜브 (그림 13). 현재 방법의 많은 기능을 확인 하 고 있습니다. 시료의 큰 부분 그들은 얼굴을 서로 병렬 견본 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar making apparatus	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	652	W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide	Matsunami Co. Ltd., Osaka	-	76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	658	W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SM-LW 61 Ji
Trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Diamond knife for ultrathin sectioning	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna	-	Ultracut S
Mesa cut	Leica Microsystems, Vienna	-	Mirror
0.5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Special 3-slit nickel grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2458	Refer to this paper
Special 3-slit copper grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2459	Refer to this paper
Section-holding loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	526	Refer to this paper
Water-surface-raising loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	527	Refer to this paper
Staining tube	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Refer to this paper
Multi-specimen holder	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	Transmission electron microscope