Метод для получения последовательного ультратонких разделы микроорганизмов в просвечивающей электронной микроскопии

Резюме

Это исследование представляет надежный и простой процедуры получения последовательного ультратонких секции микроорганизмов без дорогостоящего оборудования в просвечивающей электронной микроскопии.

Аннотация

Наблюдения клеток и клеточных компонентов в трех измерениях с высоким увеличением в просвечивающей электронной микроскопии требует подготовки серийный ультратонких секции образца. Хотя подготовка серийный ультратонких секции считается очень сложно, это довольно легко, если используется правильный метод. В этой статье мы покажем пошаговые процедуры для безопасного получения последовательного ультратонких разделы микроорганизмов. Ключевые моменты этого метода являются: 1) чтобы использовать большую часть образца и отрегулировать краю образца поверхности и нож, так что они параллельны друг другу; 2) для резки серийный секции в группах и избежать трудностей в отделять разделы, используя пару пряди волос при извлечении группа последовательных секций на щели сетки; 3) использовать петлю раздел Холдинг и избегать смешивания порядок групп разделов; 4) чтобы использовать поверхность водоподъёмного цикл и убедитесь, что разделы располагаются на вершине воды и что они touch сетки во-первых, чтобы поместить их в нужное положение на сетках; 5) использовать поддержку фильма на алюминиевой стойке и сделать его легче восстановить разделы сетки и избежать складок фильма поддержки; и 6) использовать трубу окрашивание и избежать случайного нарушения поддержки фильмов с помощью пинцета. Этот новый метод позволяет получить серийный ультратонких разделы без затруднений. Этот метод делает возможным для анализа структуры клетки микроорганизмов с высоким разрешением в формате 3D, который не может быть достигнуто с помощью автоматического сбора ленты ultramicrotome метода и последовательный блок лицо или сфокусированные ионные пучка сканирующая электронная микроскопия.

Введение

Надлежащего последовательного ультратонких секущей техника является необходимым для изучения клеток и клеточных компонентов трехмерно на микроскопическом уровне электрона. Мы изучили динамику шпинделя полюс тела в клеточный цикл дрожжевых клеток и выявили морфологические изменения их ультраструктуру во время дублирования^1,2,3, и клеточный цикл ^4,5. В 2006, мы придумали новое слово «structome» путем объединения «структура» и '-ome' и определил его как «количественные и трехмерных структурная информация всей ячейки на микроскопическом уровне электрон» ^6,7.

Structome анализ, который требует последовательного ультратонких секущей технику, было установлено, что клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Exophiala dermatitidis было около 200.000 рибосомы^7,8, Кишечная палочка клеток имели 26000 рибосомы⁹, микобактерии ячейки 1700 рибосомы¹⁰ и Мёдзин спираль бактерий было только 300 рибосомы¹¹. Эта информация полезна не только оценки темпов роста в каждом организме, но и в идентификации видов⁹.

Кроме того анализ structome, привело к открытию нового организма; Parakaryon myojinensis был найден в глубокое море у побережья Японии, чьи клеточной структуры были промежуточным между теми прокариот и эукариот^12,13,14,15. В настоящее время серийный ультратонких секущей техника считается так трудно, что он примет долгое время освоить. В этом исследовании мы разработали надежный метод, в котором кто-нибудь может выполнять последовательный ультратонких секционирование без затруднений.

протокол

Примечание: Образцы, используемые в данном исследовании были что микроорганизмов, быстро заморожен с пропан в жидком азоте, заморозить замещенных в ацетоне, содержащий 2% осмия тетраоксид и встроенный в эпоксидной смолы^1,,^{2,3, 4,5,6,,78,9,10,11,12,13 ,14,,1516,17,18}.

1. Подготовка фильма поддержки (рис. 1-3)

Примечание: Серебряные Formvar поддержка фильм подготовлен с помощью метода cast на стекло¹⁹.

1. Добавить 100 мл 1,5% Formvar в дихлорэтан Formvar Изготовление аппарата (рис. 1). Окуните половины стеклянное скольжение (76 x 26 x 1,3 мм) в Formvar растворе в верхнем столбце аппарата нажатием решение с воздухом через «» с резиновый мяч¹⁹.
   1. Слейте раствор из столбца, открыв кран трехходовой и выпуская воздух через «b» для снижения давления. Вынимают стекло слайд из аппарата и сухой в воздухе в форме пленки на поверхности стекла слайд. Используйте лампы накаливания для ускорения сушки Formvar фильма.
2. После соскабливания четырех краев пленки на стекла слайд с лезвием бритвы (рис. 2a) и дыхание на слайд, чтобы облегчить разделение фильма от слайд²⁰, плавать покинуть фильм на воде, погружая стеклянное скольжение в вода медленно низкой горизонтальный угол (около 10°, Рисунок 2b).
3. Зачерпнуть Formvar фильм из воды с помощью алюминиевой стойке (30 мм x 25 мм x 3 мм) с отверстиями (4 мм в диаметре) (рис. 3a). Держите каре с Formvar фильм в эксикатор до использования (рис. 3b).

2. Обрезка блока образца с ультразвуковым ножом и лезвием ²¹ под стереомикроскопом (рис. 4)

1. Убедитесь, что есть клетки на поверхности блока, наблюдая за кончик блока с световой микроскоп (рисунок 4a).
2. Смонтировать блок образца в патроне (блок держатель) и смонтировать зажимный патрон на обрезки этапе²¹ (рис. 4В). Этот этап отделки имеет механизм освещения от задней части образца.
3. Отделка блок размером 0,7 x 1.0 мм (рисунки 4 c, 5d). Так как эпоксидная смола является очень тяжело, обрезки блоков, сначала с помощью ультразвуковым ножом. Ультразвуковым ножом это новые машины, и блоки легко удаляются. Затем обрежьте блок далее с лезвием бритвы. Вырежьте одно плечо чтобы отметить направление резки (см. рис. 5 d, рис. 8).

3. Обрезка блока образца с алмазным ножом, используя микротом (рис. 5)

1. Установите блок образца Чак в держатель образца ultramicrotome. Место образца 90° против часовой стрелки против фактической позиции когда серийный ультратонких секционирование выполнена (см. рис. 5 d).
2. Вырежьте на поверхности блока с ножом обрезки алмаз (см. рис. 5 d). Установите алмазной грани параллельно образца блок лица и сократить минимальный объем образца поверхности так, чтобы не потерять любого образца (рис. 5 d).
   Примечание: Этот шаг делается для сглаживания поверхности образца. Часть поверхности образца тонкий части остается без изменений (поэтому эта часть не сияют как зеркало, Рисунок 5 d), чтобы не потерять любой частью образца для последовательного секционирование. Это потому, что образец подвергается на поверхности блока.
3. Поместите зеркало (Меса вырезать, M) на сцене нож для мониторинга режущего блока образца (рис. 5 c).
4. Вырежьте левого края (это становится верхней стороне, Рисунок 5 d, образца в серийный секционирование) блока с помощью обрезки нож, поворачивая нож этап 30 ° влево (рис. 5a).
5. Вырежьте блок лицо на примерно 100 мкм от левого края образца (это становится нижнюю сторону образца в серийный секционирование, Рисунок 5 d), поворачивая нож этап 30 ° вправо (Рисунок 5b).
   Примечание: Последовательный секции будет вырезать из тонкий частью образца около 90 Нм x размером около 1 мм. Большая часть будет использоваться для корректировки поверхности образца и острие ножа, таким образом, чтобы они параллельны. После корректировки поверхности образца быть параллельно к краю ножа, большая часть будут удалены с лезвием бритвы. Путем разрезания верхней и нижней сторонах образца, используя микротом, обе стороны образца стать гладко и ровно параллельно друг другу (рис. 5 d), которая необходима для получения прямых и непрерывной ленты разделов.

4. Настройка образца поверхности и ножом края таким образом, чтобы они сталкиваются параллельно друг другу ²¹

1. Извлеките нож обрезки и вращать блок образца 90° по часовой стрелке.
2. Установите ультратонких секущей нож нож стадии.
3. Отрегулируйте поверхности образца и острие ножа, таким образом, чтобы они сталкиваются параллельно друг другу, используя большую часть поверхности образца.
   Примечание: Большая часть образца используется для регулировки потому что резки лицом серийный секционирование настолько мал, что делает его трудно настроить образец поверхности и ножом края с помощью этой части только, особенно в вертикальном направлении. Таким образом используя большую часть образца легко перестройки.

5. распространение неопрена решение на блоке образца (рис. 6)

1. Чтобы поместить патрон образца на точно таком же положении как исходное положение, применять ленту на патрон и патрон держателя микротома и сократить на границе (рис. 6a).
2. Возьмите образец патрона из микротома и поместите его под стереомикроскопом (Рисунок 6b). Отрежьте большую часть образца с лезвием бритвы, оставляя тонкий часть, из которого будут получены последовательные секции.
3. С помощью пипетки Пастера, перетащите образец использоваться для последовательного секционирование, чтобы сделать раздел стороны клей около 1 мкл 0,5% неопрен раствора (рис. 6b). Покрывают весь образец раствором из неопрена. Поглощают избыток неопрена решение немедленно с кусок фильтровальной бумаги, расположенный неподалеку от образца. Получение лента секций имеет важное значение для съемки последовательных ячеек секций, и клея неопрен является весьма полезным для склеивая секции.
4. Подготовка 3-щелевой сетки (размеры щелей: среднего, 0,4 мм x 2,2 мм, обе стороны 0,2 мм x 2,2 мм) (рис. 6 c) для собирание последовательных секций, сгибая ручки сеток до 60 °, рассматривая сетки с 0,5% раствором из неопрена и делая сетки гидрофильные, свечение разряд²².

6. Создание последовательных секций (рис. 7-9)

1. Место блок образца Чак обратно в микротом на той же позиции 5.1 (рис. 6А), совместив тесьмой частей. Это держит блок лицо и острие ножа идеально параллельны друг другу. Затем довести нож недалеко от образца.
2. Заполните лодки нож с водой.
3. Обложка микротом с пластиковой крышкой для предотвращения потока воздуха (рис. 7).
   Примечание: Воздушный поток во время ультратонких секционирование и извлечения разделов часто вызывают проблемы. Пластиковая крышка имеет три отверстия: одно отверстие для бинокулярного линзы, и другие два отверстия для оружия разрешить операции, пока крышка на. Деревянные подлокотник используется для размещения оружия при этом тонкая работа, такие как извлечение последовательных секций с сетками. Деревянные подлокотник помещается на различных таблиц из таблицы микротом (рис. 7, стрелки), чтобы не передавать вибрации рук оператора в микротома.
4. Начните сокращать образца в разделе толщина 200 Нм (рис. 8). Установка на 200 Нм толщина позволит сэкономить время в результате чего нож к поверхности образца.
5. После того, как первый раздел режется, установите толщина среза до 70 Нм (рис. 8).
6. Когда количество последовательных секций достигает 20 (точнее говоря, после ленты достигает около 1.8 мм; количество секций зависит от ширины секции), установить секции толщиной до 10 Нм (рис. 8) продолжая резать.
   Примечание: Поскольку микротома нельзя вырезать 10 Нм толстые разделов, не новый раздел появляется, и ранее сократить разделы стали отделены от края ножа. Важно получить отдельный раздел группы (рис. 9) для собирание серийный разделы избежать трудностей в отделять разделы вручную с помощью пары пряди волос. Поскольку поле зрения в просвечивающий электронный микроскоп 2,0 мм, сечение должно быть длиной 1,8 мм в большинстве.
7. Значение толщины среза 60 Нм (рис. 8). Это будет производить 70 нм секции (рис. 8), потому что машина будет добавить толщину предыдущие 10 Нм.
8. Значение толщины среза 70 Нм (рис. 8) и продолжить резки до получения секции длиной 1,8 мм.
9. Повторите 6,6-6,8 до тех пор, пока пять секций длиной 1,8 мм получены (рис. 9). Мы обычно делают пять групп разделов, так как имеются пять держатели образца в просвечивающий электронный микроскоп в нашей лаборатории, но пять это не предел.

7. собирание серийный секции (рис. 10-12)

1. Место «раздел Холдинг петля»²³ (внутренний диаметр цикла: 5,0 мм) (Рисунок 10А) на третьей секции группы (рис. 10б).
   Примечание: Это необходимо для извлечения разделов в порядке их секционирование принимать фотографии в нужном порядке. Однако поскольку существует пять групп секции на лодке, нож, он часто получает запутанным, какие группы, которые. Размещая петли на третьей группы, становится ясно, что эти две группы рядом с оператором являются первый и второй и далекие два оператора являются четвертой и пятой группы (рис. 10б). Это позволит предотвратить смешение порядок.
2. Место «поверхности водоподъёмного петля»²³ (WSRL, внутренний диаметр цикла: 4,0 мм) (рис. 11А) на сцене ножа (рис. 11b). WSRL будет твердо стоять на сцене нож, потому что она оснащена магнитом в нижней.
   1. Место цикл WSRL чуть выше серийный разделы, перемещая его вала и ручку. Нижняя петля WSRL на поверхность воды, так что цикла окружает разделы.
   2. Нажмите петлю поворотом винта вниз так, что поверхность воды будет поднять на поверхностное натяжение (цифры 11c-d). Переместить раздел в центре петли, расположите его на вершине воды и отрегулировать направление секции с помощью прядь волос²¹.
   3. Подобрать группы разделов, прикоснувшись с голыми щели сеткой, которая проводится с помощью пинцета и держал параллельно поверхности воды (рис. 11 d). Это важно для секций во-первых, прикоснуться к сетке не воду, чтобы поместить разделы точно по центру сетки (Рисунок 11 d).
3. Место сетки с разделами наряду с крошечной капли воды на Formvar поддержки фильм¹⁶ (рис. 12) и Удалите лишнюю воду с помощью фильтровальной бумаги.
   Примечание: Морщение фильма поддержки часто является проблемой, когда разделы выбираются с помощью сетки с поддержкой фильм потому что мембрана (разделы) непосредственно затрагивает мембраны (поддержка фильм). Проблема получения морщины на поддержку фильма значительно уменьшается, поместив раздел подшипник сетки вместе с крошечной капли воды на Formvar поддержки фильм¹⁶.

8. Окрашивание разделов^16,24 (рис. 13)

1. После секции полностью высох, слезной пленки Formvar от вокруг сетки и снимите решетки с учетом разделов.
2. Установка сетки в groove окрашивание трубку¹⁶ в правильном порядке (рис. 13) и пятно секции с уранила ацетат и свинца цитрат²⁴.
   Примечание: Есть паз глубиной 0,6 мм вдоль длинной оси трубки вырезать с лезвием бритвы. Трубка является полезным для предотвращения случайного обрыва поддержки фильмов, когда с помощью пинцета, поскольку прямой обработке сеток не является необходимым во время окрашивания и промывки процесса¹⁶.

9. наблюдение за последовательные секции (рис. 14)

1. Установите 5 сетки в держатель образца мульти в правильном порядке (рис. 14А), ориентация длинной оси сетки разрезом перпендикулярно оси держателя образца. Ручки (стрелок) сеток не должны быть сокращены, потому что «ГРИД пройдохи» не будет трогать ручки.
2. Исправьте сетки с «ГРИД пройдохи» (Рисунок 14b) и вставьте держатель образца в просвечивающий электронный микроскоп.
   Примечание: Это часто полезно принимать низкий масштаб изображения всех слоев клеток (рис. 15), чтобы найти интересные микроорганизмов или клеток в хорошем состоянии, без загрязнения и с хорошей фиксации, прежде чем принимать фотографии целевой ячейки.
3. Возьмите фотографии клеток-мишеней во всех разделах клеток с высоким увеличением.

Результаты

В этом протоколе три щелевой сетки использовались для собирание последовательных секций. Сетки изготавливаются из никеля или меди. Серийный разделы размещаются на среднем щели. Прорези на обеих сторон необходимы для просмотра разделов, когда их собирать с сеткой. Что...

Обсуждение

Представленные здесь метод требует не дорогое оборудование. Он требует только алюминиевые стойки (рис. 3), три щелевой сетки (рис. 6 c), раздел Холдинг петли (Рисунок 10А), поверхность водоподъёмного петлю (рис. 11А) и окрашивани?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar making apparatus	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	652	W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide	Matsunami Co. Ltd., Osaka	-	76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	658	W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SM-LW 61 Ji
Trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Diamond knife for ultrathin sectioning	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna	-	Ultracut S
Mesa cut	Leica Microsystems, Vienna	-	Mirror
0.5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Special 3-slit nickel grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2458	Refer to this paper
Special 3-slit copper grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2459	Refer to this paper
Section-holding loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	526	Refer to this paper
Water-surface-raising loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	527	Refer to this paper
Staining tube	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Refer to this paper
Multi-specimen holder	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	Transmission electron microscope