Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

Resumo

Este estudo apresenta procedimentos confiáveis e fácil de obtenção de seções ultra-finas seriais de um microorganismo sem equipamentos caros em microscopia eletrônica de transmissão.

Resumo

Observação de células e componentes da célula em três dimensões em alta ampliação em microscopia eletrônica de transmissão exige a preparação de seções ultra-finas seriais do espécime. Ainda preparar seções ultra-finas seriais é considerado muito difícil, é bastante fácil... se for usado o método adequado. Neste trabalho, mostramos um procedimento passo a passo para a obtenção de segurança seriais seções ultra-finas de microorganismos. Os pontos-chave deste método são: 1) para usar a grande parte da amostra e ajustar a borda de superfície e faca de amostra, de modo que eles são paralelos uns aos outros; 2) para cortar seções seriais em grupos e evitar a dificuldade em separar seções usando um par de fios de cabelo ao recuperar um grupo de seções seriais para as grades de fenda; 3) usar um 'loop' seção-exploração e evitar mistura-se a ordem dos grupos seção; 4) para usar um loop de' água de superfície-sensibilização' e certifique-se que as seções são posicionadas no ápice da água e que tocam a grade em primeiro lugar, a fim de colocá-los na posição desejada nas grades; 5) para usar o suporte de filme em um rack de alumínio e torná-lo mais fácil para recuperar as seções sobre as grades e evitar enrugar-se do filme suporte; e 6) para usar um tubo de coloração e evitar quebrar acidentalmente os filmes de apoio com uma pinça. Este novo método permite a obtenção de seções ultra-finas seriais sem dificuldade. O método torna possível analisar estruturas celulares dos microorganismos em alta resolução em 3D, que não pode ser alcançado usando o método de ultramicrotome de fita de coleta automática e bloco-rosto serial ou microscópio eletrônico de varredura de feixe de íon focalizado.

Introdução

Técnica de corte apropriada serial ultrafino é indispensável para o estudo de células e componentes celulares tridimensionalmente em nível microscópico elétrons. Temos estudado a dinâmica do corpo de polo do eixo no ciclo celular de células de levedura e revelou alterações morfológicas da sua ultra-estrutura durante o ciclo celular e o tempo de duplicação^{1,2,3, 4,5}. Em 2006, cunhou uma nova palavra 'structome' combinando 'estrutura' e '-ome' e definiu-o como o 'informações quantitativas e tridimensional estrutural de uma célula inteira em nível microscópico elétrons' ^6,7.

Pela análise de structome, que requer técnica de seccionamento serial ultrafino, verificou-se que uma célula de levedura Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis tinha cerca de 200.000 ribossomos^7,8, um Escherichia coli célula tinha 26.000 ribossomas⁹, uma célula de Mycobacterium tuberculosis tinha 1.700 ribossomas¹⁰ e bactérias de espiral Myojin tinham apenas 300 ribossomas¹¹. Esta informação é útil na estimativa não somente a taxa de crescimento em cada organismo, mas também na identificação das espécies⁹.

Análises posteriores, structome levado à descoberta de um novo organismo; Parakaryon myojinensis foi encontrado no fundo do mar na costa do Japão, cuja estrutura de célula era um intermediário entre aqueles de procariotas e eucariotas^12,13,14,15. Presentemente, técnica de corte ultrafino serial é considerada tão difícil que levaria muito tempo para dominar. Neste estudo, nós desenvolvemos um método confiável, no qual qualquer um pode executar seccionamento ultrafinos serial sem dificuldade.

Protocolo

Nota: As amostras utilizadas neste estudo foram microorganismos, rapidamente congelados com propano em nitrogênio líquido, congelam substituídos em acetona contendo 2% de tetróxido de ósmio e incorporado em epóxi resina^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18}.

1. preparação do filme de apoio (Figura 1-3)

Nota: Filme de suporte prateado Formvar é preparado usando o método de molde-em-vidro¹⁹.

1. Adicionar 100 mL de 1,5% Formvar no dicloreto de etileno, para um aparelho de fabricação de Formvar (Figura 1). Mergulhe metade de uma lâmina de vidro (76 x 26 x 1,3 mm) em solução de Formvar na coluna superior do aparelho, pressionando a solução com o ar através de 'um' usando uma bola de borracha¹⁹.
   1. Drene a solução da coluna abrindo a torneira de três vias e liberando o ar através de 'b' para reduzir a pressão. Retire a lâmina de vidro do aparelho e seco no ar para formar uma película na superfície do vidro slide. Use uma lâmpada de incandescência para acelerar a secagem do filme Formvar.
2. Depois de raspar as quatro bordas do filme sobre a lâmina de vidro com uma lâmina de barbear (Figura 2a) e respirando para o slide para facilitar a separação do filme do slide²⁰, flutuam o filme na água por imersão da lâmina de vidro para o água lentamente em um ângulo horizontal baixo (cerca de 10°, Figura 2b).
3. Colher-se o filme de Formvar da água usando um rack de alumínio (30 x 25 x 3 mm) com furos (4 mm de diâmetro) (Figura 3a). Manter o rack com o filme de Formvar num exsicador até à utilização (Figura 3b).

2. corte o bloco de amostra com uma lâmina de corte ultra-sônico e uma lâmina de barbear ²¹ sob um estereomicroscópio (Figura 4)

1. Certifique-se de que existem células na superfície do bloco, observando a ponta do bloco com um microscópio de luz (figura 4a).
2. O bloco de amostra no mandril (suporte de bloco) e montagem do mandril em um palco de aparamento²¹ (figura 4b). Nesta fase de aparamento tem um mecanismo de iluminação na parte de trás do espécime.
3. Apare o bloco para um tamanho de 0,7 x 1,0 mm (figuras 4C, 5D). Uma vez que a resina epóxi é muito difícil, apare os blocos primeiro usando uma lâmina de corte ultra-sônico. A lâmina de corte ultra-sônico é uma máquina recém introduzida, e os blocos são facilmente cortados. Então corte o bloco ainda mais com uma lâmina de barbear. Corte um ombro para marcar a direção de corte (consulte a Figura 5 d, Figura 8).

3. corte o bloco de amostra com faca de diamante usando o micrótomo (Figura 5)

1. Defina o bloco de amostra chuck no porta-amostra do ultramicrotome. Coloque o espécime 90° no sentido anti-horário contra a posição real quando ultrafinos de seccionamento serial é realizada (ver Figura 5D).
2. A superfície do bloco de corte com uma faca de corte de diamante (ver Figura 5 d). Definir a navalha de diamante paralelas na face do bloco de amostra e corte a quantidade mínima da superfície de amostra para não perder qualquer espécime (Figura 5D).
   Nota: Este passo é feito para suavizar a superfície da amostra. A parte da superfície do espécime da parte magro permanece intacta (por conseguinte, esta parte não brilha como um espelho, Figura 5D), para não perder nenhuma parte da amostra para seccionamento serial. Isto é porque o espécime é exposto na superfície do bloco.
3. Coloque um espelho (corte de Mesa, M) no palco faca para monitorar o corte do bloco de amostra (Figura 5C).
4. Corte a borda esquerda (isso se torna o lado superior, Figura 5D, da amostra no seccionamento serial) do bloco usando faca de aparar girando o palco faca 30 ° para a esquerda (Figura 5a).
5. Corte o rosto de bloco em cerca de 100 µm da borda esquerda da amostra (este torna-se o lado inferior da amostra no seccionamento serial, Figura 5D), rodando o palco faca 30 ° para a direita (Figura 5b).
   Nota: As seções seriais serão cortadas da parte magro da amostra de cerca de 90 nm x cerca de 1 mm de tamanho. A grande parte será usada para ajustar a superfície da amostra e a navalha, tal que eles são paralelos. Depois de ajustar a superfície do espécime para ser paralela à borda da faca, o grande parte será removida com uma lâmina de barbear. Cortando os lados superiores e inferiores da amostra usando o micrótomo, ambos os lados da amostra se tornar suave e exatamente paralelos uns aos outros (Figura 5D), que é necessário para obter as seções de fita reta e ininterrupta.

4. ajustar a borda de superfície e faca de espécime para que eles enfrentam paralelo a outro ²¹

1. Remover a faca de corte e rodar o bloco de amostra 90° no sentido horário.
2. Defina uma faca de corte ultrafino para a fase de faca.
3. Ajuste a superfície da amostra e a navalha para que eles enfrentam paralelos uns aos outros usando a grande parte da superfície do espécime.
   Nota: A grande parte da amostra é usada para o ajuste porque a face de corte de seccionamento serial é tão pequena, que dificulta a ajustar a borda de superfície e faca de amostra usando esta parte só, especialmente no sentido vertical. Assim, usando a grande parte da amostra facilita o ajuste.

5. espalhar a solução do neopreno do bloco de amostra (Figura 6)

1. Para colocar o chuck espécime em exatamente a mesma posição que a posição original, aplique a fita sobre o chuck e o chuck titular do micrótomo e cortar no limite do (Figura 6a).
2. Retire o espécime chuck do micrótomo e colocá-la sob o microscópio estereoscópico (Figura 6b). Corte a grande parte da amostra com uma lâmina de barbear, deixando a parte de magro, do qual seriais seções serão obtidas.
3. Com uma pipeta Pasteur, solte cerca de 1 µ l 0.5% do neopreno solução (Figura 6b) para a amostra a ser usada para o seccionamento serial, para fazer o adesivo de lados de seção. Cobrir o espécime com solução de neopreno. Absorva a solução de neopreno excesso imediatamente com um pedaço de papel de filtro colocado perto da amostra. Uma fita de seções é essencial para tirar fotos das seções de celular serial e cola neopreno é muito útil para furar as seções junto.
4. Preparar 3 fenda grades (tamanhos de fendas: médio, 0,4 mm x 2,2 mm, ambos os lados 0,2 x 2,2 mm) (Figura 6C) para pegar seriais seções dobrando o punho das grades para 60 °, tratando as grades com solução de neoprene de 0,5% e fazendo as grades hidrofílico por de descarga do fulgor²².

6. fazer seções seriais (Figura 7-9)

1. Lugar do bloco de amostra chuck volta em micrótomo na mesma posição como 5.1 (Figura 6a), alinhando as peças gravadas. Isso mantém a face do bloco e o fio da navalha perfeitamente paralelos uns aos outros. Depois trago a faca perto da amostra.
2. Encha o barco de faca com água.
3. Cubra o micrótomo com uma tampa de plástico para impedir o fluxo de ar (Figura 7).
   Nota: O fluxo de ar durante o seccionamento ultrafinos e recuperação das seções, muitas vezes causar problemas. A tampa de plástico tem três buracos: um buraco é para as lentes do binóculos, e outros dois furos são para os braços permitir a operação enquanto a tampa estiver ligada. O braço de madeira é usado para a colocação de braços enquanto fazia um trabalho delicado, como recuperar seriais seções com grades. O braço de madeira é colocado em tabelas diferentes da tabela micrótomo (Figura 7, setas), para não transmitir a vibração das mãos do operador para o micrótomo.
4. Comece a cortar a amostra em espessura de corte de 200 nm (Figura 8). Configuração em espessura de 200 nm poupará tempo em trazer a faca para a superfície da amostra.
5. Após a primeira seção é cortada, definir a espessura de corte de 70 nm (Figura 8).
6. Quando o número de seções seriais atinge 20 (precisamente falando, depois os alcances de fita cerca de 1,8 mm; o número de seções varia de acordo com a largura das seções), definir a espessura de corte de 10 nm (Figura 8), continuando a cortar.
   Nota: Desde o micrótomo não pode cortar 10 nm de espessura seções, nenhuma nova seção aparece, e as seções previamente cortadas se separaram da borda de faca. É importante obter grupos de seções separadas (Figura 9) para pegar seriais seções para evitar a dificuldade em separar seções manualmente usando um par de fios de cabelo. Desde o campo de visão no microscópio de elétron da transmissão é de 2,0 mm, seções devem ser no máximo 1,8 mm de comprimento.
7. Definir a espessura de corte de 60 nm (Figura 8). Isto produzirá 70 seções nm (Figura 8), porque a máquina irá adicionar a espessura de nm 10 anterior.
8. Definir a espessura de corte para 70 nm (Figura 8) e continue o corte até 1.8 mm-longo seções são obtidas.
9. Repita 6,6-6,8 até cinco seções longas de 1,8 mm são obtidas (Figura 9). Geralmente fazemos cinco grupos de seção, desde há cinco suportes de amostra no microscópio eletrônico de transmissão disponíveis em nosso laboratório, mas cinco não é o limite.

7. pegar seriais seções (Figura 10-12)

1. Coloque a 'seção-exploração loop'²³ (diâmetro interno do loop: 5,0 mm) (Figura 10a) sobre o terceiro grupo de seção (Figura 10b).
   Nota: É necessário recuperar as seções na ordem de sua corte para tirar fotos na ordem correta. No entanto, desde há cinco grupos de seção do barco de faca, isso muitas vezes Obtém confundindo quais os grupos que são. Colocando o loop no terceiro grupo, torna-se claro que os dois grupos perto do operador são o primeiro e o segundo e os dois distantes do operador são os grupos IV e v (Figura 10b). Isto impedirá que mistura-se a ordem.
2. Coloque a ''água de superfície-sensibilização loop²³ (WSRL, diâmetro interno do loop: 4,0 mm) (Figura 11a) na fase de faca (Figura 11b). O WSRL vai ficar firmemente no palco faca porque é equipado com um imã na parte inferior.
   1. Coloque o loop do WSRL acima as seções seriais movendo seu eixo e o punho. Baixe o loop do WSRL na superfície da água para que o laço circunda as seções.
   2. Empurre o loop através do parafuso para baixo para que a superfície da água irá disparar pela tensão de superfície (figuras 11-c-d). Mover a seção para o centro do laço, posicioná-lo no ápice da água e ajustar a direção da seção usando um fio de cabelo²¹.
   3. Buscar grupos de seção de tocá-lo com uma fenda-grade nua, que é realizada por uma pinça e mantida paralelo à superfície da água (Figura 11 d). É importante para as seções tocar na grelha em primeiro lugar, não a água, colocar seções precisamente no centro da grade (Figura 11 d).
3. Coloque as grelhas com seções juntamente com uma pequena gota de água sobre o Formvar suporte filme¹⁶ (Figura 12) e remover o excesso de água usando papel de filtro.
   Nota: Enrugamento do filme suporte é muitas vezes um problema quando seções são captadas usando uma grade com suporte de filme, porque a membrana (seções) toca a membrana (filme de apoio) diretamente. O problema de ficar com rugas no filme de apoio é significativamente reduzido, colocando uma grade de seção-rolamento juntamente com uma pequena gota de água sobre o suporte de Formvar filme¹⁶.

8. coloração de seções^16,24 (Figura 13)

1. Após as seções são completamente seco, rasgar o filme de Formvar ao redor das redes e retire as grades as seções do rolamento.
2. Definir as grades na ranhura do tubo coloração¹⁶ na ordem correta (Figura 13) e mancha seções com uranilo acetato e chumbo citrato²⁴.
   Nota: Há um sulco de 0,6 mm de profundidade ao longo do eixo do tubo de corte com uma lâmina de barbear. O tubo é útil para impedir a quebra acidental de suporte filmes quando usando uma pinça, uma vez que a manipulação direta de grades não é necessária durante o processo de coloração e lavagem¹⁶.

9. observação das seções seriais (Figura 14)

1. Defina as 5 grades no porta-amostra multi na ordem correta (Figura 14a), orientando o eixo longo da grade fenda perpendicular ao eixo de suporte do espécime. As alças (setas) das grades não tem que ser cortado, porque os 'grade-fixadores' não tocará as alças.
2. Fixar as grelhas com 'grade-fixadores' (Figura 14b) e introduza o suporte de amostra o microscópio eletrônico de transmissão.
   Nota: Muitas vezes é útil tomar baixa ampliação de imagens de todas as seções de célula (Figura 15) para achar interessante microorganismos ou células em bom estado com nenhuma contaminação e com boa fixação, antes de tirar fotos da célula alvo.
3. Tire fotos das células alvo em todas as seções de célula em alta ampliação.

Resultados

Neste protocolo, fenda três grades foram usados para pegar seriais seções. As grades são feitas de níquel ou cobre. As seções seriais são colocadas na ranhura do meio. As fendas em ambos os lados são necessárias para ver as seções quando pegá-los com a grade. Para manter as grades paralelas com as seções seriais quando pegá-los com uma pinça (Figura 11 d), o punho é dobrado (Figura 6C, direita). Uma pequena alç...

Discussão

O método apresentado aqui não requer nenhum equipamento caro. Requer apenas um rack de alumínio (Figura 3), grades de três-fenda (Figura 6C), seção-exploração loops (Figura 10a), loop de água de superfície-sensibilização (Figura 11a) e um tubo de coloração (Figura 13). Há muitas características do presente método. A grande parte da amostra é usada para aju...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar making apparatus	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	652	W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide	Matsunami Co. Ltd., Osaka	-	76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	658	W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo	-	SM-LW 61 Ji
Trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage	Sunmag Co.Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Diamond knife for ultrathin sectioning	Diatome Co. Ltd., Switzerland	-	45°
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna	-	Ultracut S
Mesa cut	Leica Microsystems, Vienna	-	Mirror
0.5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Special 3-slit nickel grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2458	Refer to this paper
Special 3-slit copper grid	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2459	Refer to this paper
Section-holding loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	526	Refer to this paper
Water-surface-raising loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	527	Refer to this paper
Staining tube	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Refer to this paper
Multi-specimen holder	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd., Tokyo	-	Transmission electron microscope