El modelo de pilocarpina de epilepsia del lóbulo Temporal y EEG monitoreo con radiotelemetría sistema en ratones

Resumen

Este manuscrito describe un método de inducir epilepticus del estado por la inyección sistémica de pilocarpina y vigilancia convulsiones recurrentes espontáneas en animales vivos con un sistema de electroencefalograma y telemetría inalámbrica video. Este protocolo puede ser utilizado para el estudio de los mecanismos patofisiológicos de epilepsia crónica, epileptogénesis y convulsiones agudas.

Resumen

Epilepsia del lóbulo temporal (ELT) es un trastorno neurológico común en la edad adulta. Estudios traslacionales de epilepsia crónica, inducida por la pilocarpina estado epiléptico (SE) se selecciona con frecuencia para recapitular convulsiones recurrentes espontáneas (SRS). Aquí presentamos un protocolo de inducción SE por inyección intraperitoneal (i.p.) de pilocarpina y el control de convulsiones recurrentes crónicas en animales vivos mediante un electroencefalograma (EEG) sistema de telemetría inalámbrica video y. Hemos demostrado notables cambios del comportamiento que requieren atención después de la inyección de pilocarpina y su correlación con la pérdida neuronal hippocampal en 7 días y pilocarpina después de 6 semanas. También describimos los procedimientos experimentales de la implantación de electrodos para el vídeo y la grabación de EEG y análisis de la frecuencia y duración de las convulsiones recurrentes crónicas. Finalmente, se discuten las posibles razones por qué los resultados esperados no se obtienen en cada caso. Esto proporciona una descripción básica de modelado epilepsia crónica en ratones y directrices para la solución de problemas. Creemos que este protocolo puede servir como base para modelos adecuados de la epilepsia crónica y epileptogenesis.

Introducción

ELT es una de las epilepsias adquiridas más comunes¹. Las personas con epilepsia experimentan convulsiones recurrentes como resultado de actividades neuronales anormales en el cerebro^2,3. Dado que TLE a menudo es insuperable, es crucial entender los mecanismos básicos subyacentes al desarrollo de la epilepsia.

Modelos animales que pueden recapitular las características claves de TLE humana pueden ofrecer mejor apreciación de la fisiopatología de la ELT, lo que nos permite fácilmente controlar y manipular los factores críticos en la epileptogénesis. Entre ellos, SE chemoconvulsants-inducida ha sido ampliamente utilizado^4,5. A diferencia de otros modelos de epilepsia, como estimulación eléctrica que no muestra esclerosis hippocampal y robusto SRS^6,7,8, la inyección sistémica de chemoconvulsants puede mímico patogenesia clínica de ELT humana, es decir, lesión cerebral inicial, un período de latencia y un epiléptico crónico etapa manifestación SRS^5,9,10. Por lo tanto, esta técnica puede ser utilizada en varios estudios, explicando los mecanismos de daño de cerebro agudo, epileptogenesis o supresión de la confiscación. Por otra parte, alteraciones histopatológicas inducidas por chemoconvulsants son similares a ésos vistos en TLE humano, proporcionando una justificación adicional para uso de TLE modelos de roedores^10,11,12. En particular, los daños estructurales que implican el hipocampo han sido reproducidos consistentemente en ambos modelos de ácido y pilocarpina-inducida SE kaínico. Sin embargo, comparados con la inyección de Ácido kaínico, el modelo de pilocarpina puede producir SRS más robusta en los ratones, que pueden ofrecer ventajas considerables para el estudio de epilepsia crónica cuando se considera la amplia disponibilidad de líneas de ratón transgénico^{5, 13 , 14 , 15}. por otra parte, progresión de convulsiones después de la inyección de pilocarpina es generalmente más rápida que en el modelo de Ácido kaínico, proporcionando evidencia adicional para el uso efectivo de un modelo de pilocarpina de epilepsia.

Aquí, demostramos un método SE induce mediante la inyección i.p. de pilocarpina y realizando la supervisión de EEG en epilepsia crónica y vídeo.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad Católica de Corea y se llevaron a cabo según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH publicaciones no. 80-23).

1. SE inducción

1. Comprar ratones C57BL/6NHsd machos de 8 semanas de edad y peso de cada ratón. Luego, use un rotulador para marcar las colas de los ratones para su fácil identificación durante la inducción SE.
2. Calcular la cantidad de escopolamina metilbromuro (escopolamina; 2 mg/kg), terbutalina hemisulfate (terbutalina; 2 mg/kg) y clorhidrato de pilocarpina (pilocarpina, 280 mg/kg) basada en el peso del ratón y añada solución salina (0,9% NaCl, 10 mL/kg) para hacer soluciones.
   Nota: Por ejemplo, si el peso del ratón es 25 g, se aplican las siguientes cantidades: escopolamina y terbutalina: 2 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 0,05 mg, solución salina: 10 mL/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL, pilocarpina: 280 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 7 mg , Salino: 10 mL/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL.
3. Coloque la mezcla de escopolamina y terbutalina en una jeringa de 1 mL con una aguja de 30 G. Inyectar la solución intraperitoneal cada ratón y luego regresar a los ratones a sus jaulas. A los 30 min después de la administración de escopolamina y terbutalina, inyectar solución de pilocarpina en cada ratón (i.p.; aguja de 30 G y jeringa de 1 mL). Inmediatamente después de la inyección de pilocarpina, coloque el ratón en una incubadora (28-30° C) para la observación.
4. Vigilar cuidadosamente el comportamiento de los ratones hasta que SE es inducido. Si se detectan límbicos asimientos del motor que corresponden a la etapa 3 o superior según la escala de Racine, registrar el tiempo y controlar los ratones para determinar si las convulsiones ocurren con más frecuencia. Una vez continuados asimientos del motor duran más de 2 minutos, colocar el ratón en una jaula nueva a temperatura ambiente y mantener monitoreo durante 3 horas determinar si continúan sus ataques convulsivos y SE es inducido. Eutanasia a los ratones que no pudieron entrar SE en aproximadamente 2 horas después de la inyección de pilocarpina.
   Nota: Escala de Racine; etapa 1, la boca y el movimiento facial; etapa 2, movimientos de cabeceo; etapa 3, clonus del miembro anterior; etapa 4, cría con clonus del miembro anterior; etapa 5, cría y caída con el miembro anterior clonus¹⁶. Si el ratón no se transfiere a la estructura a temperatura ambiente inmediatamente después de la inducción SE, el ratón puede morir debido a la hipertermia.
5. Terminar comportamiento convulsiones agudas a las 3 h después del inicio SE inyectando solución de diazepam (i.p.; 10 mg/kg; jeringa de 1 mL aguja de 30 G). Hacen de la solución de diazepam de 5 mg/mL de diazepam en 35 aceite de ricino hidrogenado polioxil 10% de dilución mediante la adición de solución salina (i.p.; 10 mL/kg; jeringa de 1 mL aguja de 30 G).
   Nota: 10% polioxil 35 hidrogenada el aceite de ricino solución: solución de 35 aceite de ricino hidrogenado polioxil 1 mL + solución salina 9 mL. Almacenar la solución a temperatura ambiente. Por ejemplo, si el peso del cuerpo del ratón es 25 g, inyectar 250 μl de solución de diazepam: 50 diazepam de 5 mg/mL μl + 200 μl 10% polioxil 35 hidrogenado castor aceite solución = diazepam de 1 mg/mL de 250 μl.
6. Para los ratones sham, realizar una inyección i.p. de la mezcla de hemisulfate escopolamina metilbromuro y terbutalina (i.p.; ambos 2 mg/kg, 10 mL/kg; jeringa de 1 mL y aguja de 30 G). 30 minutos más tarde, inyectar la solución salina por vía intraperitoneal (i.p.; 10 mL/kg; jeringa de 1 mL aguja de 30 G).
   Nota: Si el peso del cuerpo del ratón es 25 g, inyectar 250 μl de solución salina en lugar de pilocarpina.
7. Después de la inyección de diazepam (i.p.; aguja de 30 G y jeringa de 1 mL), administrar 1 mL de dextrosa 5% por cada ratón (i.p.; jeringa de 1 mL aguja 26 G).
   Nota: 1 mL de inyección de dextrosa 5% proporciona la fuente de energía e hidratación que puede aumentar la tasa de supervivencia.
8. Durante la atención en la incubadora (28-30 ° C), limpie el exceso secreciones como saliva, lágrimas y heces.
9. Día 1 después de la inducción SE pesan los ratones y mantenerlos en la incubadora (28-30 ° C) para un día extra. Día 2, después de la inducción SE pesan los ratones y devolverlos a su jaula casera. Proporcionar chow húmedo para facilitar su recuperación.
   Nota: En este experimento, la tasa de mortalidad de C57BL/6NHsd después de la terminación SE fue de 8.57% en promedio (3 a 35 ratones probado).
10. Medir diariamente el peso corporal de los animales hasta pilocarpina después de 7 días e inyectar a los ratones con dextrosa 5% (i.p.; jeringa de 1 mL aguja 26 G) cuando el peso no ha aumentado. Stop control de peso corporal cuando los ratones comienzan a recuperar el peso corporal y consumir chow húmedo sin dificultad en 2 días después de la inyección de pilocarpina.
    Nota: Si el peso corporal de un ratón no aumentó hasta 7 días post SE, excluyen el ratón del experimento y eutanasia por dióxido de carbono. Según el fondo del ratón, la muerte puede ocurrir de vez en cuando; sin embargo, en el caso de C57BL/6NHsd, menos del 1% de los ratones murió en estos experimentos. Con supervivencia de más de 7 días después de la inducción SE, los ratones mueren raramente durante el periodo de latencia.

2. implantación cirugía para la supervisión del vídeo-EEG

1. Ratones de 12 semanas de edad (4 semanas después de la inducción SE) se preparan para realizar la implantación de telemetría para monitoreo de EEG.
   Nota: Tiempo de implantación puede ser modificado dependiendo de la experimentación y las cepas de ratón.
2. Antes de la cirugía, anestesiar el ratón con una mezcla (4:0.5) de ketamina (50 mg/mL) y solución de xilacina (23,3 mg/mL) disuelto en solución salina a dosis de 2,5 μl/g de peso corporal (i.p.; jeringa de 1 mL aguja 26 G). Vigilar frecuencia respiratoria y el esfuerzo respiratorio del ratón a intervalos regulares (intervalo de 15 minutos máximo) y evaluar la profundidad de la anestesia por el reflejo de retirada del pedal.
3. Coloque el ratón en un marco estereotáxicas con barras de oído y una placa de mordida y Aplique ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la ceguera.
4. Para mantener las condiciones estériles durante la cirugía, afeitado quirúrgicos sitios utilizando una hoja de afeitar. Tenga cuidado para evitar la contaminación de la piel del campo quirúrgico. Después del afeitado, desinfectar la piel con solución de etanol y yodo 70%.
   Nota: La cirugía debe realizarse de manera aséptica, uso de guantes estériles y máscaras, usando equipos estériles y técnicas asépticas.
5. Después de confirmar la profundidad de la anestesia, haga una incisión de línea media de la piel para exponer el cráneo. Hacer dos agujeros de las rebabas con un taladro acoplado al aparato estereotáxicas en las coordenadas de vértice en el eje anteroposterior (AP): +0,1 mm, eje mediolateral (ML): +0,1 mm (referencia) y AP: mm −0.2, ML: +0,22 mm (corteza parietal izquierda)¹³.
   1. Limpie la piel con los enfoques sectoriales de algodón empapada en PBS, seguido por 70% etanol, solución de yodo. Haga una incisión longitudinal en el centro de la cabeza con unas tijeras para exponer la Lambda (el punto donde se unen la sagital y la sutura del lambdoid), el Bregma (punto de intersección de la sutura coronal por la sutura sagital) y la ubicación de destino.
   2. Identificar los puntos anatómicos como Bregma Lambda. Coloque la broca en el Bregma y nota la X, Y coordenadas para este punto.
   3. Un cerebro atlas libros o publicado referencias para determinar las coordenadas correspondientes de las regiones del cerebro para la grabación de EEG. A continuación, calcular las coordenadas de los tornillos (referencia y grabación) utilizando las coordenadas del vértice medido en el paso 2.5.2.
   4. Lentamente baje la broca para hacer un orificio de trépano siendo cuidadoso para evitar introducir la broca demasiado en el punto donde el cráneo se vuelve más delgado.
6. Inserte el cuerpo del único canal inalámbrico transmisor EEG detrás de la nuca del cuello por vía subcutánea y lugar flexible conduce cerca del cráneo.
7. Coloque un tornillo de acero inoxidable (2 mm de longitud) en cada orificio de trépano con pinzas y apretar con un destornillador por la rotación en sentido horario. Asegúrese de que el tornillo no se inserta demasiado muy profundo por el grado de rotación del tornillo de ajuste para evitar daños en la duramadre o de los tejidos del cerebro.
8. Tira de la capa de aislamiento 2 mm desde la punta de las puntas y estirar el alambre lo suficiente para redondear el husillo para una buena conexión entre el cable y el tornillo. Conecte el conductor de referencia al tornillo delantero y la grabación para el tornillo en la corteza parietal. Luego, aplicar cemento dental para asegurar todo el conjunto en su lugar sin exponer las piezas de metal.
9. Después de comprobar que el cemento dental haya secado por completo por la inspección visual, la sutura de la piel y aplicar ungüento de mupirocina tópica. Coloque el ratón en una incubadora de 30 ° C solo hasta que recupera de la cirugía (30 minutos). A continuación, volver el ratón a la estructura de la casa hasta que comience a monitoreo video-EEG continuo.
   Nota: Después de la cirugía, cada ratón se inyecta (i.p.; aguja de 30 G y jeringa de 1 mL) con 5 mg/kg de gentamicina (antibióticos) y 5 mg/kg de ketoprofeno (analgésicos). Los animales deben ser vigilados hasta que se vuelvan totalmente ambulantes. Transmisor implantado ratones tienen un período de recuperación de aproximadamente 1 semana.

3. video y EEG monitoreo y análisis

1. Colocar un ratón en una jaula individual y la jaula encima de las placas de receptor inalámbrico donde se instala la jaula de Faraday para evitar la interrupción de las señales eléctricas de cualquier fuente, incluyendo una computadora, las líneas de CA y receptores adyacentes.
   Nota: Consulte el manual suministrado por el fabricante. Debe tenerse cuidado para evitar puntos ciegos.
2. Registran la actividad eléctrica usando el sistema de telemetría inalámbrica de vídeo-EEG.
   1. Abra el software de grabación de vídeo-EEG. Haga clic en "Hardware" y seleccionar "Editar configuración". Coincidir con el receptor y el transmisor implantado en cada ratón. Haga clic en "Configuración del canal" y confirmar que todos los canales están activos. Haga clic en "Configuración de vídeo" para sincronizar el vídeo con los datos de EEG (resolución de 480 x 40 y velocidad de fotogramas de 30.00).
      Nota: Instalar una cámara IP con alta sensibilidad si es fundamental reunir cualidades de la buena imagen que pueden identificar cambios sutiles en el comportamiento de los ratones en la noche.
   2. Haga clic en "Configuración" y "P3" entrada individual información animal, cámara emparejada y entorno gráfico.
   3. Haga clic en "Adquisición" y "A/D velocidad de muestreo" a velocidades de muestreo de la instalación. Haga clic en "nombre de conjunto de datos" para designar a cada experimento.
      Nota: Muestreo para EEG debe ser mayor a 500 Hz. debido a la gran vídeo y tamaño de datos de EEG, se recomienda que sólo 24 horas de datos son manejadas por sesión en lugar de utilizar una continuo de 2 semana de grabación como un archivo. Datos se pueden guardar por separado a intervalos de 8 h o 12 h en caso de escasez de memoria RAM.
   4. Activar el transmisor con una barra magnética y haga clic en "Iniciar adquisición" para recoger la grabación de vídeo-EEG. Monitorear continuamente el ratón por el sistema de video-EEG durante al menos 2 semanas.
      Nota: Para los ratones C57BL/6, SRS tiende a ocurrir en racimos que pasado unos 5,2 días y la duración del período libre de convulsiones es de 6,7 días¹⁷.
3. Determinar la frecuencia de las crisis y la duración por inspección manual utilizando el software de análisis.
   1. Marque el área mostrando SRS y exportar los datos para el análisis estadístico. Tener cuidado para excluir artefactos EEG que pueden ser generados por rascarse la cabeza o masticar; Estos pueden eliminarse por la comprobación de los datos de vídeo.
      Nota: SRS se define como el inicio repentino de epileptiforme repetitiva actividad de clavar (≥ 3 Hz) que persiste por más de 10 s. comportamiento convulsivo puede ser acompañado con frecuencia con una ráfaga de actividad de clavar. No-convulsivas convulsiones también pueden demostrar actividades electrográficas clavaba sin comportamientos convulsivos. Terminación de convulsión se define como la que ocurre cuando las puntas de tiro volver a la actividad de base.
   2. Para el análisis de frecuencia de las convulsiones, divida el número total de casos SRS detectados durante las 2 semanas por el número total de días de grabación para cada animal individual.
   3. Para el análisis de duración de la convulsión, medir el tiempo desde el inicio hasta el final de la epileptiforme clavar las actividades.
4. Después de la terminación de la grabación de vídeo-EEG, fije el cerebro con paraformaldehído al 4% por perfusión de transcardial. Para anestesiar el ratón, inyecta una solución (4:0.5) de ketamina (50 mg/mL) y xilacina (23,3 mg/mL) disuelto en solución salina a dosis de 10 μL/g de peso corporal (i.p.; jeringa de 1 mL aguja 26 G). Una vez que el ratón está confirmado para ser profundamente anestesiados, realizar la perfusión transcardial.
5. Antes de aislar el cerebro de ratón, recuperar el transmisor en el ratón para su reutilización después de la limpieza.
   1. Retirar el cemento dental alrededor de los cables con unas pinzas.
   2. Moje la punta de los cables con cemento dental en acetona al 100% hasta que se disuelva el cemento dental.
   3. Eliminar contaminantes de tejido alrededor del transmisor, enjuague con agua destilada.
   4. Enjuague el transmisor con etanol al 70% para 3 h y el aire lo seque para almacenamiento. Inmediatamente antes del próximo uso, enjuague el tornillo y el transmisor con etanol al 70%, seguido de agua destilada y colocarlos en solución salina.
      Nota: Debe tenerse cuidado para evitar cortar los cables flexibles al decapitar el ratón ya que, si los cables flexibles son muy cortos, el ruido en la próxima implantación y grabación de vídeo-EEG puede aumentar.

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Resultados

Éxito SE pueden inducir la muerte celular hipocampal y SRS (figura 1 y figura 2). Había terminada conducta convulsiones agudas por diazepam inyectable a las 3 h después del inicio del SE y sacrificaron los ratones 7 días o 6 semanas más adelante.

Para la supervisión del vídeo-EEG, los ratones recibidos implantación cirugía en 4 semanas después de SE, y SRS cas...

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Discusión

Este trabajo describe los procedimientos experimentales para la inducción SE y la evaluación de convulsiones crónicas.

Varios factores afectan la inducción SE éxito. Control conductual preciso según la escala de Racine es fundamental para el desarrollo de SRS. Cabeceo, clonus del forelimb, alzarse y caer busquen el comportamiento de las convulsiones agudas en fase SE^4,16. Una vez que se detectaron la primera crisis del motor, dis...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
Scopolamine methyl nitrate	Sigma	S2250	Make 10X stock
Terbutaline hemisulfate salt	Sigma	T2528	Make 10X stock
Pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Ketamine hydrochloride	Yuhan corporation
Xylazine hydrochloride	Bayer Korea
Diazepam	SAMJIN
Castor oil (Kolliphor EL)	Sigma	C5135	Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil
Saline	Daihan pharm. Co.
5% Dextrose	Daihan pharm. Co.
Iodine solution (Povidin)	Firson
vet ointment (Terramycin)	Pfizer
Blue Nylon	AILEE	NB617
Mupirocin (Bearoban)	Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
Ketoprofen	Samchundang Pharm. Co., Ltd		5 mg/kg
Gentamicin	Huons, Ltd.		5 mg/kg
1 mL syringe	Sung shim medial Co., Ltd.
26 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")
Razor blade	Dorco
Drill	Saeshin precision Co., Ltd.		207A, 35K (speed)
Telemetry video/EEG system	Data sciences International. Inc.	Version 5.20-SP6
Implantable transmitter	Data sciences International. Inc.	ETA-F10
Screw	Sungho Steel		M1.4, 2 mm length stainless steel
Vertex dental material	Dentimex
Acetone	Duksan pure chemicals Co., Ltd.		CAS 67-64-1
Paraformaldehyde (PFA)	millipore	1.04005.1000	4 %
Sucrose	Sigma	S9378	30 % solution in 0.01 M PBS
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Ethanol	EMD Millipore Co.	UN1170
xylene	Duksan pure chemicals Co., Ltd.	UN1307
Acetic acid glacial	Junsei chemical	31010-0350
FSC33 Clear	Leica biosystems		OCT compound for tissue freezing
DPX Mounting for histology	Sigma	6522
Forceps	Fine science tools	11002-12
Scissors	Solco biomedical	02-2445
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	E51070012