Пилокарпин модель височной эпилепсии и ЭЭГ мониторинга с использованием системы манулами мышей

Резюме

Эта рукопись описывает метод вызывая эпилептический статус путем инъекций системных пилокарпин и мониторинга спонтанное периодических изъятий в живых животных, с использованием беспроводной телеметрии видео и системы электроэнцефалограммы. Этот протокол может использоваться для изучения патофизиологические механизмы хронической эпилепсии, epileptogenesis и острые приступы.

Аннотация

Височная эпилепсия (TLE) является общей неврологические расстройства в зрелом возрасте. Для трансляционного исследования хронического эпилепсии эпилептический статус, пилокарпин индуцированной (SE) часто выбирается резюмировать спонтанное периодические приступы (SRS). Здесь мы представляем протокол SE индукции внутрибрюшинного (и.п.) для инъекций пилокарпин и мониторинг хронических повторяющиеся судороги в живых животных, с использованием беспроводной телеметрии видео и системы электроэнцефалограммы (ЭЭГ). Мы продемонстрировали заметные изменения в поведении, которые требуют внимания после инъекции пилокарпин и их корреляции с гиппокампа нейрональных потери на 7 дней и 6 недель после пилокарпин. Мы также описывают экспериментальные процедуры имплантации электродов для видео и записи ЭЭГ и анализ частоты и продолжительности хронический рецидивирующий судорог. Наконец мы обсуждаем возможные причины, почему ожидаемые результаты не достигаются в каждом конкретном случае. Это обеспечивает обзор основных моделирования хронический эпилепсии у мышей и руководящие принципы для устранения неполадок. Мы считаем, что этот протокол может служить в качестве основы для подходящих моделей хронических эпилепсии и epileptogenesis.

Введение

TLE является одним из наиболее распространенных приобретенных эпилепсий¹. Люди с эпилепсией испытывают периодические приступы вследствие ненормальной деятельности нейронов в мозге^2,3. Учитывая, что TLE зачастую неразрешимыми, важно понять основные механизмы, лежащие в основе развития эпилепсии.

Животные модели, которые можно резюмировать основные характеристики человека TLE может предложить лучшее понимание TLE патофизиологии, что позволяет нам легко контролировать и управлять критическими факторами в epileptogenesis. Среди них chemoconvulsants индуцированной SE был широко используется^4,5. В отличие от других моделей эпилепсия, например электрической стимуляции, который показывает не склероз гиппокампа и надежной SRS^6,7,8системного введения chemoconvulsants может имитировать клинических патогенеза человека TLE, т.е., первоначальный черепно-мозговой травмы, латентного периода и хронического эпилептический стадии проявляется SRS^5,9,10. Таким образом этот метод может использоваться в различных исследованиях, объясняя механизмов острого повреждения головного мозга, epileptogenesis или ареста пресечение. Кроме того аналогичные тем, которые видели в человека TLE, дополнительным обоснованием использования TLE грызунов модели^10,,1112гистопатологические изменения, вызванные chemoconvulsants. Примечательно структурные повреждения, с участием гиппокампа были последовательно воспроизведены в обеих моделях кислоты - и пилокарпин индуцированной SE Каиновая. Однако по сравнению с Каиновая кислоты инъекции, пилокарпин модель может производить более надежной SRS в мышей, которые может предложить значительные преимущества для изучения хронических эпилепсии при рассмотрении широкая доступность трансгенные мыши линии^{5, 13 , 14 , 15}. Кроме того, захват прогрессии после инъекции пилокарпин обычно быстрее, чем в модели Каиновая кислоты, предоставляя дополнительные доказательства для эффективного использования пилокарпин модели эпилепсии.

Здесь мы демонстрируем способ заставить SE и.п. инъекции пилокарпин и выполняя видео и ЭЭГ-мониторинг в хронический эпилепсии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры были утверждены Комитетом по этике католический университет Кореи и были проведены в соответствии с национальными институтами здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных (низ публикации № 80-23).

1. SE индукции

1. Приобрести 8-недельных самцов мышей C57BL/6NHsd и весят каждой мыши. Затем используйте маркер ручка для обозначения хвосты всех мышей для их быстрой идентификации во время SE индукции.
2. Рассчитать количество скополамин бромистого метила (скополамин; 2 мг/кг), hemisulfate тербуталин (тербуталин; 2 мг/кг) и пилокарпин гидрохлорид (пилокарпин; 280 мг/кг), основанный на вес мыши и добавить солевой раствор (0,9% NaCl, 10 мл/кг) для принятия решений.
   Примечание: Например, если вес мыши — 25 г, применяются следующие суммы: скополамин и тербуталин: 2 мг/кг * (25 г/1000 г) = 0,05 мг, солевой раствор: 10 мл/кг * (25 г/1000 г) = 0,25 мл, пилокарпин: 280 мг/кг * (25 г/1000 г) = 7 мг , Физиологическим: 10 мл/кг * (25 г/1000 г) = 0,25 мл.
3. Загрузите скополамин и тербуталин смеси в 1 мл шприц с иглой 30 G. Внедрить решение внутрибрюшинно в каждой мыши, а затем вернуть их клетки мышей. В 30 мин после приема скополамин и тербуталин inject пилокарпин решение в каждой мыши (и.п.; 1 мл шприц иглой 30 G). Сразу же после инъекции пилокарпин место мышей в инкубатор (28-30° C) для наблюдения.
4. Тщательно контролировать поведение мышей до тех пор, пока SE индуцируется. При обнаружении лимбической моторные судороги, которые соответствуют стадии 3 или выше по шкале Расина в рекордное время и контролировать мышей, чтобы определить, является ли изъятия происходят более часто. После непрерывного моторные приступы длятся более 2 мин, поместите указатель мыши в новой клетке при комнатной температуре и держать мониторинг для 3 h для определения ли продолжить их судорожными припадками и SE индуцируется. Усыпить мышей, которые не удалось ввести SE на около 2 ч после инъекции пилокарпин.
   Примечание: Расин в масштабе; этап 1, рот и движения лица; этап 2, глава кивая головой; Этап 3, Клонус передних конечностей; Этап 4, воспитания с Клонус передних конечностей; этап 5, воспитания и падения с передних конечностей Клонус¹⁶. Если мышь не передается в клетке при комнатной температуре, сразу же после SE индукции, мышь может умереть вследствие гипертермии.
5. Прекратить поведенческих острые приступы в 3 ч после начала SE путем инъекций раствор диазепама (и.п. 10 мг/кг 1 мл шприц; иглой 30 G). Сделать раствор диазепама путем разбавления 5 мг/мл диазепама в polyoxyl 10% 35 гидрогенизированное касторовое масло, добавив физраствора (и.п. 10 мл/кг 1 мл шприц; иглой 30 G).
   Примечание: 10% polyoxyl 35 гидрогенизированное касторовое масло раствор: 1 мл раствора polyoxyl 35 гидрогенизированное касторовое масло + 9 мл физиологического раствора. Хранят раствор при комнатной температуре. Например, если мышь вес 25 г, придать 250 мкл раствора диазепама: 50 мкл диазепама 5 мг/мл + 200 мкл 10% polyoxyl 35 гидрогенизированное касторовое масло решение = 250 мкл диазепама 1 мг/мл.
6. Для мышей Шам, выполняют и.п. инъекции скополамин бромистого метила и тербуталин hemisulfate смеси (и.п.; оба 2 мг/кг, 10 мл/кг; 1 мл шприц; иглой 30 G). 30 минут позже, придать Салине внутрибрюшинно (и.п. 10 мл/кг 1 мл шприц; иглой 30 G).
   Примечание: Если вес тела мыши — 25 г, придать 250 мкл раствора вместо пилокарпин.
7. После инъекции диазепама (и.п.; 1 мл шприц иглой 30 G) управлять 1 мл 5% декстрозы в отдельных мыши (и.п.; 1 мл шприц; 26 G иглы).
   Примечание: 1 мл 5% декстрозы инъекции обеспечивает источник энергии и гидратации, что может повысить выживаемость.
8. Во время после ухода в инкубатор (28-30 ° C) протрите чрезмерной секреции таких как слюна, слезы и Кала.
9. В день 1 после SE индукции весят мышей и держать их в инкубатор (28-30 ° C) на один дополнительный день. На 2 день, после ГП индукции весят мышей и их возвращения в их дома клетке. Обеспечивают влажных Чоу для содействия их восстановлению.
   Примечание: В этом эксперименте уровень смертности для C57BL/6NHsd после окончания SE был 8,57% в среднем (3 из 35 мышей испытания).
10. Ежедневно измерять вес тела животных до 7 дней после пилокарпин и придать мышей с 5% декстрозы (и.п.; 1 мл шприц; 26 G иглы) когда масса тела не увеличилась. Остановите мониторинг вес тела, когда мышей начинают восстановить вес тела и потребляют влажные Чоу без затруднений на 2 дней после инъекции пилокарпин.
    Примечание: Если вес тела мыши не увеличивается до 7 дней поста SE, исключить мыши из эксперимента и усыпить углекислого газа. В зависимости от фона мыши иногда может наступить смерть; Однако в случае C57BL/6NHsd, менее 1% мышей умер в этих экспериментах. С выживание более чем через 7 дней после SE индукции мышей редко умирают во время латентный период.

2. Имплантация хирургии для видео ЭЭГ-мониторинг

1. Подготовка 12-week-old мышей (4 недели после SE индукции) для выполнения имплантации телеметрии для мониторинга ЭЭГ.
   Примечание: Сроки проведения имплантации может быть изменен в зависимости от экспериментальных целях и мыши штаммов.
2. До операции анестезировать мышь со смесью (4:0.5) кетамина (50 мг/мл) и ксилазина (23,3 мг/мл) раствора растворяют в физиологического раствора в дозе 2,5 мкл/г веса тела (и.п.; 1 мл шприц; 26 G иглы). Контролировать частоту дыхания и дыхания усилий мыши на регулярной основе (максимальный интервал 15 мин) и оценить глубину анестезии по педали вывода рефлекс.
3. Поместите указатель мыши в Стереотаксическая рама с уха баров и укус пластины и применять мазь ветеринар на оба глаза, чтобы избежать слепоты.
4. Чтобы поддерживать стерильные условия во время операции, брить хирургических сайтов с помощью лезвия бритвы. Будьте осторожны, чтобы предотвратить загрязнения меха хирургического поля. После бритья, дезинфекция кожи с 70% этанола и йода раствор.
   Примечание: Операции должны выполняться в асептических манере ношения стерильные перчатки и маски, используя стерилизовать оборудование и асептических методов.
5. После подтверждения глубины анестезии, сделайте срединной линии разреза кожи подвергать черепа. Сделать два Берр отверстия сверлом, прилагаемый к стереотаксического аппарата в точке с координатами Bregma в переднезаднем оси (AP): + 0,1 мм, медиолатеральной оси (мл): + 0,1 мм (Справочник) и AP: −0.2 мм, мл: +0.22 мм (левой теменной коре)¹³.
   1. Протрите кожу PBS-пропитанной хлопка ОСП, следуют 70% этанола и йода раствор. Сделайте продольный разрез в середине головы с помощью ножниц выставить лямбда (точки, где встречаются сагиттальной и lambdoid шов), Bregma (точка пересечения корональный шва, Сагиттальный шов) и в целевое расположение.
   2. Определите анатомические ориентиры например лямбда и Bregma. Поместите сверло в Bregma и Примечание X, Y координаты для этой точки.
   3. Использовать книги Атлас мозга или опубликованные ссылки чтобы определить соответствующие координаты регионов мозга для записи ЭЭГ. Затем рассчитайте координаты для винтов (ссылка и запись) с использованием координат Bregma измеряется на шаге 2.5.2.
   4. Медленно опустите сверло, чтобы сделать отверстие Берр, стараясь избежать вставив сверло слишком далеко в точке, где череп становится тоньше.
6. Вставить тело одного канала беспроводной передатчик ЭЭГ позади затылка подкожно и место гибкие приводит вблизи черепа.
7. Установите винт из нержавеющей стали (длиной 2 мм) в каждое отверстие заусенцев с помощью пинцета и затяните его с помощью отвертки, вращение по часовой стрелке. Убедитесь, что винт не вставлена слишком далеко глубоко регулируя степень вращения винта для того, чтобы предотвратить повреждение Дура или в тканях мозга.
8. Полосы изоляции слоя 2 мм от кончика приводит и растянуть провод достаточно долго чтобы округлить винт вал для хорошее соединение между проводом и винт. Подключите провод ссылка к передней винт и записи приведет к винт в теменной коре. Затем примените стоматологического цемента для обеспечения всей сборки в месте, не подвергая металлических частей.
9. После проверки, что стоматологического цемента полностью высох путем визуального осмотра, шовные кожи и применять Мупироцин актуальных мазь. Поместите курсор мыши в инкубаторе 30 ° C только до тех пор, пока он восстанавливает от хирургии (около 30 мин). Затем возвращает мыши дома Кейдж пока непрерывной видео ЭЭГ-мониторинг начинается.
   Примечание: После операции каждая мышь вводят (и.п.; 1 мл шприц иглой 30 G) с 5 мг/кг гентамицина (антибиотики) и 5 мг/кг кетопрофена (анальгетиков). Животные должны быть проверены до тех пор, пока они становятся полностью передвигающихся самостоятельно. Передатчик имплантированные мышей есть восстановительный период около 1 недели.

3. видео и ЭЭГ-мониторинг и анализ

1. Место мыши в индивидуальной клетке и место Кейдж поверх плиты беспроводной приемник где клетку Фарадея установлен чтобы избежать прерывания электрических сигналов от любых источников, включая компьютер, линии переменного тока и прилегающих приемников.
   Примечание: Обратитесь к руководству производителя. Необходимо позаботиться о том, чтобы избежать белых пятен.
2. Запись электрической активности, с использованием беспроводной видео ЭЭГ телеметрической системы.
   1. Откройте программное обеспечение для записи видео ЭЭГ. Нажмите кнопку «Оборудование» и выберите «Изменить настройки». Матч, приемник и передатчик, имплантируется в каждой мыши. Нажмите кнопку «Канал конфигурации» и подтвердите, что все каналы являются активными. Нажмите «Настройки видео» для синхронизации видео с данных ЭЭГ (резолюция 40 x 480 и частота кадров 30.00).
      Примечание: Установите IP-камеры с высокой чувствительностью, если важно собирать хорошие изображения качества, которые можно определить тонкие изменения в поведении мышей в ночное время.
   2. Нажмите кнопку «Настройка» и «P3 установка» для ввода информации отдельных животных, соответствием камеры и настройка графа.
   3. Нажмите кнопку «Приобретение» и «Дискретизации A/D» для настройки дискретизации. Нажмите кнопку «имя набора данных» для обозначения каждого эксперимента.
      Примечание: Частота дискретизации для ЭЭГ должен быть выше чем 500 Гц. Ввиду больших видео и размер данных ЭЭГ, рекомендуется что только 24 h данных обрабатываются за сессию вместо непрерывной 2-недели записи как один файл. Данные могут быть сохранены отдельно интервалами 8 h или 12 h в случае нехватки памяти RAM.
   4. Активировать передатчик с магнитной полосой и нажмите кнопку «Начать приобретение» для сбора записи видео ЭЭГ. Постоянно контролировать мышь системой видео ЭЭГ для по крайней мере 2 недель.
      Примечание: Для мышей C57BL/6 SRS, как правило, происходят в кластерах, что последний около 5,2 суток и продолжительности периода бесплатно захват около 6,7 дней¹⁷.
3. Определите захват частоты и продолжительности, ручного контроля с использованием программного обеспечения для анализа.
   1. Марк области показаны SRS и экспортировать данные для статистического анализа. Будьте осторожны, чтобы исключить ЭЭГ артефакты, которые могут быть получены путем чесать голову или жевания; они могут быть удалены путем проверки видео данных.
      Примечание: SRS определяется как внезапное повторяющихся эпилептиформный пики активности (≥ 3 Гц), сохраняется, за более чем 10 s. судорожными поведения часто могут сопровождаться всплеск пики активности. Non судорожные припадки могут также продемонстрировать электрографические пики деятельность без судорожными поведения. Прекращения захвата определяется как происходящее когда шипы стрельбы вернуться к базовой деятельности.
   2. Для анализа Частота приступов делят общее количество случаев СГД в течение 2 недель на общее количество дней запись для каждого отдельного животного.
   3. Для анализа продолжительности захвата Измерьте время от начала до конца эпилептиформный пики деятельности.
4. После завершения записи видео ЭЭГ исправить мозга с параформальдегида 4%, transcardial перфузии. Чтобы анестезировать мыши, вводить раствор (4:0.5) кетамина (50 мг/мл) и ксилазина (23,3 мг/мл) растворяют в физиологического раствора в дозе 10 мкл/г веса тела (и.п.; 1 мл шприц; 26 G иглы). После подтверждения мыши чтобы быть глубоко под наркозом выполните transcardial перфузии.
5. Прежде чем изолировать мозга мыши, получить передатчик от мыши для повторного использования после чистки.
   1. Удалите стоматологического цемента вокруг провода, используя пинцет.
   2. Замочите кончик провода с стоматологического цемента в 100% ацетона, до растворения стоматологического цемента.
   3. Удаление загрязнений ткани вокруг передатчика, промыв ее с дистиллированной водой.
   4. Промыть передатчика с 70% этанола для 3 h и воздух сушить для хранения. Непосредственно до следующего использования промойте винт и передатчик с 70% этиловом спирте, следуют дистиллированной воды и поместите их в солевой раствор.
      Примечание: Должны позаботиться о том, чтобы избежать резки гибких проводов, когда декапитационный мыши, поскольку, если гибкий приводит слишком коротким, шум в следующем имплантации и запись видео ЭЭГ может возрасти.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Успешное SE может вызвать гибель клеток гиппокампа и SRS (рис. 1 и рис. 2). Мы прекращено поведенческих острые приступы инъекции диазепама в 3 ч после начала SE и жертву мышей 7 дней и 6 недель спустя.

Для видео ЭЭ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эта работа описывает экспериментальной процедуры для SE индукции и оценки хронического судорог.

Ряд факторов может повлиять на Успешный SE индукции. Точная поведенческие наблюдения согласно шкале Расина имеет решающее значение для развития SRS. Кивал головой, Клонус перед...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
Scopolamine methyl nitrate	Sigma	S2250	Make 10X stock
Terbutaline hemisulfate salt	Sigma	T2528	Make 10X stock
Pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Ketamine hydrochloride	Yuhan corporation
Xylazine hydrochloride	Bayer Korea
Diazepam	SAMJIN
Castor oil (Kolliphor EL)	Sigma	C5135	Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil
Saline	Daihan pharm. Co.
5% Dextrose	Daihan pharm. Co.
Iodine solution (Povidin)	Firson
vet ointment (Terramycin)	Pfizer
Blue Nylon	AILEE	NB617
Mupirocin (Bearoban)	Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
Ketoprofen	Samchundang Pharm. Co., Ltd		5 mg/kg
Gentamicin	Huons, Ltd.		5 mg/kg
1 mL syringe	Sung shim medial Co., Ltd.
26 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")
Razor blade	Dorco
Drill	Saeshin precision Co., Ltd.		207A, 35K (speed)
Telemetry video/EEG system	Data sciences International. Inc.	Version 5.20-SP6
Implantable transmitter	Data sciences International. Inc.	ETA-F10
Screw	Sungho Steel		M1.4, 2 mm length stainless steel
Vertex dental material	Dentimex
Acetone	Duksan pure chemicals Co., Ltd.		CAS 67-64-1
Paraformaldehyde (PFA)	millipore	1.04005.1000	4 %
Sucrose	Sigma	S9378	30 % solution in 0.01 M PBS
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Ethanol	EMD Millipore Co.	UN1170
xylene	Duksan pure chemicals Co., Ltd.	UN1307
Acetic acid glacial	Junsei chemical	31010-0350
FSC33 Clear	Leica biosystems		OCT compound for tissue freezing
DPX Mounting for histology	Sigma	6522
Forceps	Fine science tools	11002-12
Scissors	Solco biomedical	02-2445
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	E51070012