Das Pilocarpin Modell der Temporallappen-Epilepsie und EEG Monitoring mittels Radiotelemetrie System bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode des Verursachens Status Epilepticus durch systemische Pilocarpin Injektion und spontane wiederkehrende Anfälle mit lebenden Tieren, die mit einem drahtlosen Telemetrie video und Elektroenzephalogramm System zu überwachen. Dieses Protokoll kann genutzt werden, für das Studium der pathophysiologische Mechanismen der chronischen Epilepsie, Epileptogenesis und akute Anfälle.

Zusammenfassung

Temporallappen-Epilepsie (TLE) ist eine häufige neurologische Erkrankung im Erwachsenenalter. Für Translationale Studien von chronischen Epilepsie wird Pilocarpin induzierten Status Epilepticus (SE) häufig ausgewählt, um spontane wiederkehrende Anfälle (SRS) zu rekapitulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll der SE Induktion durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von Pilocarpin und Überwachung der chronischen wiederkehrenden Anfällen mit lebenden Tieren, die mit einem drahtlosen Telemetrie video und Elektroenzephalogramm (EEG) System. Wir zeigten bemerkenswerte Verhaltensänderungen, die Aufmerksamkeit nach Pilocarpin Injektion und deren Korrelation mit hippocampal neuronalen Verlust bei 7 Tagen und 6 Wochen nach Pilocarpin. Wir beschreiben auch die experimentelle Verfahren der Implantation der Elektroden für Video und EEG-Aufzeichnung und Analyse der Häufigkeit und Dauer der chronisch wiederkehrende Anfälle. Abschließend besprechen wir die möglichen Gründe, warum die erwarteten Ergebnisse nicht in jedem Fall erreicht werden. Dies bietet einen grundlegenden Überblick über die Modellierung von chronischen Epilepsie bei Mäusen und Leitlinien für die Problembehandlung. Wir glauben, dass dieses Protokoll als Grundlage für geeignete Modelle der chronischen Epilepsie und Epileptogenesis dienen kann.

Einleitung

TLE ist eines der häufigsten erworbenen Epilepsien¹. Menschen mit Epilepsie erleben wiederkehrende Anfälle durch abnorme neuronalen Aktivitäten im Gehirn^2,3. Da die TLE oft unlösbar ist, ist es wichtig zu verstehen, die grundlegenden Mechanismen, die die Entwicklung der Epilepsie.

Tiermodellen, die die wichtigsten Merkmale des menschlichen TLE rekapitulieren können bieten bessere Anerkennung von TLE Pathophysiologie, so dass wir leicht überwachen und manipulieren wichtige Faktoren bei der Epileptogenesis. Unter anderem wurde Chemoconvulsants-induzierten SE weit verbreiteten^4,5. Im Gegensatz zu anderen Epilepsie-Modellen, wie z. B. elektrische Stimulation zeigt keine hippocampale Sklerose und robuste SRS^6,7,8, kann die systemische Injektion von Chemoconvulsants klinische Pathogenese der menschlichen TLE nachahmen, d.h., anfängliche-Hirn-Trauma, eine Latenzzeit und einer chronischen Epilepsie inszenieren manifestierenden SRS^5,9,10. Daher kann diese Technik in verschiedenen Studien erklären, die Mechanismen der akuten Schädigung des Gehirns, Epileptogenesis oder Beschlagnahme Unterdrückung genutzt werden. Darüber hinaus sind histopathologische Veränderungen induziert durch Chemoconvulsants ähnlich denen im menschlichen TLE, bietet eine zusätzliche Begründung für den Einsatz von TLE Nager-Modelle^10,11,12. Insbesondere wurden strukturelle Schäden unter Einbeziehung des Hippocampus konsequent in beiden Kainic Säure - und Pilocarpin-induzierte SE Modellen reproduziert. Allerdings kann im Vergleich zu Kainic Säure Injektion, Pilocarpin Modell robuster SRS bei Mäusen, produzieren, die beträchtliche Vorteile für chronische Epilepsie zu studieren, wenn man die breite Verfügbarkeit von transgenen Maus Linien^{5, 13 , 14 , 15}. Darüber hinaus Beschlagnahme Progression nach Pilocarpin Injektion ist in der Regel schneller als im Kainic Säure-Modell bietet ein weiteres Indiz für die effektive Nutzung von Pilocarpin Modell der Epilepsie.

Hier zeigen wir eine Methode der induzierende SE durch die i.p.-Injektion von Pilocarpin und durch Video und EEG Überwachung bei chronischer Epilepsie.

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Protokoll

Alle experimentelle Verfahren wurden von der Ethikkommission der katholischen Universität Korea angenommen und wurden im Einklang mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publikationen Nr. 80-23) durchgeführt.

(1) SE Induktion

1. Kaufen Sie 8 Wochen alten männlichen C57BL/6NHsd Mäusen und wiegen Sie jeder Maus. Verwenden Sie dann ein Filzstift markieren die Schwänzen von alle Mäuse für ihre einfache Identifizierung während SE Induktion.
2. Berechnen Sie die Menge von Scopolamin Methylbromid (Scopolamin; 2 mg/kg), Terbutalin Hemisulfate (Terbutalin; 2 mg/kg) und Pilocarpin Hydrochlorid (Pilocarpin; 280 mg/kg), bezogen auf das Gewicht der Maus, und fügen Sie Kochsalzlösung (0,9 % NaCl, 10 mL/kg) Lösungen zu machen.
   Hinweis: Zum Beispiel, wenn das Gewicht der Maus 25 g, folgende Beträge gelten: Scopolamin und Terbutalin: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0,05 mg, Kochsalzlösung: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL, Pilocarpin: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg , Saline: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL.
3. Laden Sie die Scopolamin und Terbutalin Mischung in eine 1 mL Spritze mit einer 30 G-Nadel. Spritzen Sie die Lösung intraperitoneal in jeder Maus, und dann wieder die Mäuse in ihren Käfigen. Injizieren Sie bei 30 min nach der Verabreichung von Scopolamin und Terbutalin Pilocarpin Lösung in jeder Maus (i.p., 1 mL Spritze, Nadel 30 G). Unmittelbar nach Pilocarpin Injektion setzen Sie die Mäuse in einem Inkubator (28-30° C) für die Beobachtung.
4. Beobachten Sie sorgfältig das Verhalten der Mäuse bis SE induziert wird. Wenn limbische motorische Anfälle, die Stufe 3 oder höher nach Racine Skala entsprechen, erkannt werden, notieren Sie die Zeit und überwachen Sie die Mäuse um festzustellen, ob die Anfälle häufiger auftreten. Nach kontinuierlichen motorische Anfälle mehr als 2 min dauern, platzieren Sie den Mauszeiger in einen neuen Käfig bei Raumtemperatur und halten Sie Überwachung für 3 h um festzustellen, ob ihre krampfhafte Anfälle weiter und SE induziert wird. Die Mäuse, die nicht einschläfern SE ca. 2 h nach Pilocarpin Injektion.
   Hinweis: Racine Skala; Stufe 1, Mund und Gesichtsbewegungen; Stufe 2, Kopf nicken; Stufe 3, Vorderbein Klonus; Stufe 4, Aufzucht mit Vordergliedmaße Klonus; Stufe 5, Aufzucht und mit Vordergliedmaße Klonus¹⁶fallen. Wenn die Maus nicht auf den Käfig bei Raumtemperatur sofort nach SE Induktion übertragen wird, kann die Maus durch Hyperthermie sterben.
5. Kündigen Sie Verhaltens akute Anfälle um 3 Uhr nach SE auftreten durch Injektion von Diazepam (i.p., 10 mg/kg; 1 mL Spritze, Nadel 30 G). Machen Sie die Diazepam-Lösung durch Verdünnung 5 mg/mL von Diazepam in 10 % Polyoxyl 35 hydriertes Rizinusöl durch Zugabe von Kochsalzlösung (i.p., 10 mL/kg; 1 mL Spritze, Nadel 30 G).
   Hinweis: 10 % Polyoxyl 35 hydriertes Rizinusöl Lösung: 1 mL Polyoxyl 35 hydriertes Rizinusöl Lösung + 9 mL Kochsalzlösung. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur. Zum Beispiel, wenn die Maus Körpergewicht 25 g, injizieren 250 µL Diazepam Lösung: 50 µL 5 mg/mL Diazepam + 200 µL 10 % Polyoxyl 35 hydrierten Castor Öl-Lösung = 250 µL 1 mg/mL Diazepam.
6. Für Schein Mäuse, durchführen eine i.p.-Injektion der Scopolamin Methylbromid und Terbutalin Hemisulfate Mischung (i.p.; beide 2 mg/kg, 1 mL Spritze, 10 mL/kg; 30 G-Nadel). 30 min später, injizieren die Kochsalzlösung intraperitoneal (i.p., 10 mL/kg; 1 mL Spritze, Nadel 30 G).
   Hinweis: Wenn die Maus Körpergewicht 25 g, injizieren Sie 250 µL Kochsalzlösung statt Pilocarpin.
7. Nach Diazepam verabreichen Injektion (i.p., 1 mL Spritze, Nadel 30 G), 1 mL 5 % Dextrose pro einzelnen Maus (1 mL Spritze, i.p.; 26 G-Nadel).
   Hinweis: 1 mL 5 % Traubenzucker-Injektion stellt Energiequelle und Flüssigkeitszufuhr, die die Überlebensrate steigern kann.
8. Während der Nachbetreuung in den Inkubator (28-30 ° C) übermäßige Absonderungen wie Kot, Speichel und Tränen abwischen.
9. Am 1. Tag nach SE Induktion wiegen Sie die Mäuse und für einen zusätzlichen Tag im Inkubator (28-30 ° C) aufbewahren. Am 2. Tag, nach SE Induktion wiegen Sie die Mäuse und wieder in ihre Heimat Käfig. Bieten sie feucht Chow um ihre Genesung zu erleichtern.
   Hinweis: In diesem Experiment wurde die Sterblichkeitsrate für C57BL/6NHsd nach SE Kündigung 8,57 % im Durchschnitt (3, 35 Mäuse getestet).
10. Körpergewicht der Tiere täglich bis zu 7 Tage nach Pilocarpin zu messen und Spritzen die Mäuse mit 5 % Traubenzucker (1 mL Spritze, i.p.; 26 G-Nadel) wenn das Körpergewicht nicht gestiegen. Körper Gewicht Überwachung, wenn die Mäuse starten wieder Körpergewicht und verbrauchen feucht Chow problemlos 2 Tage nach der Injektion Pilocarpin beendet.
    Hinweis: Wenn das Körpergewicht einer Maus nicht bis 7 Tage Post SE zunahm, schließen die Maus aus dem Experiment und einschläfern durch Kohlendioxid. Tod kann gelegentlich auftreten, je nach Hintergrund der Maus; bei C57BL/6NHsd starb jedoch weniger als 1 % der Mäuse in diesen Experimenten. Mit dem Überleben von mehr als 7 Tagen nach SE Induktion sterben die Mäuse selten während der Latenzzeit.

2. Implantation Chirurgie für Video-EEG Überwachung

1. Bereiten Sie 12 Wochen alten Mäusen (4 Wochen nach SE Induktion), Telemetrie-Implantation für EEG Überwachung durchzuführen.
   Hinweis: Zeitpunkt der Implantation kann abhängig von den experimentellen Zwecken und der Mausstämme geändert werden.
2. Vor der Operation zu betäuben die Maus mit einer Mischung (4:0.5) von Ketamin (50 mg/mL) und Xylazin (23,3 mg/mL) Lösung aufgelöst in Kochsalzlösung in einer Dosis von 2,5 µL/g Körpergewicht (1 mL Spritze, i.p.; 26 G-Nadel). Überwachen Sie Atemfrequenz und respiratorischen Anstrengungen der Maus in regelmäßigen Abständen (max. 15 min Intervall) und bewerten Sie die Tiefe der Narkose durch das Pedal Rückzug-Reflex.
3. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem stereotaktischen Rahmen mit Ohr-Bars und ein Aufbissplatte und wenden Sie Tierarzt Salbe auf beide Augen, Blindheit zu vermeiden.
4. Um sterilen Bedingungen während der Operation zu pflegen, Rasieren Sie chirurgische Websites mit einer Rasierklinge. Seien Sie vorsichtig, Fell Kontamination des Operationsfeldes zu verhindern. Nach dem Rasieren, desinfizieren Sie die Haut mit 70 % Ethanol und Jod-Lösung.
   Hinweis: Operation sollte in einer aseptischen Weise tragen sterile Handschuhe und Masken, mit sterilisierten Geräten und aseptische Techniken durchgeführt werden.
5. Machen Sie nach der Bestätigung der Tiefe der Narkose eine Mittellinie Inzision der Haut des Schädels aussetzen. Machen Sie zwei Burr Löcher mit einem Bohrer befestigt, der stereotaktischen Apparat an den Koordinaten aus dem Bregma in der Anteroposterior Achse (AP): +0,1 mm, Mediolateral Achse (ML): +0,1 mm (Referenz) und AP: −0.2 mm, ML: +0,22 mm (linke parietalen Kortex)¹³.
   1. Reinigen Sie die Haut mit PBS-getränkten Baumwoll-Swaps, gefolgt von 70 % Ethanol und Jod-Lösung. Machen Sie einen längs-Schnitt in der Mitte des Kopfes mit einer Schere, Aussetzen des Lambda-Ausdrucks (der Punkt, wo die sagittale und die lambdoid Naht treffen), Bregma (der Punkt der Schnittpunkt der Kranznaht durch die sagittale Naht) und den Zielort.
   2. Anatomische Landmarken wie Lambda und Bregma zu identifizieren. Positionieren Sie den Bohrer am Bregma und beachten Sie die X, Y-Koordinaten für diesen Punkt.
   3. Verwenden Sie eine Gehirn-Atlas-Bücher oder veröffentlichte Verweise auf die entsprechenden Koordinaten der Hirnregionen für EEG-Aufzeichnung zu bestimmen. Dann berechnen Sie die Koordinaten für die Schrauben (Referenz und Aufnahme) unter Verwendung der Bregma Koordinaten bei Schritt 2.5.2 gemessen.
   4. Senken Sie langsam die Bohrkrone zu einem Bohrlochs achtgeben, einführen die Bohrkrone zu weit an der Stelle, wo der Schädel dünner wird.
6. Stecken Sie der Körper des einzelnen Kanals drahtlose EEG Sender hinter dem Nacken subkutan und platzieren Sie flexible führt in der Nähe des Schädels.
7. Legen Sie eine Edelstahl-Schraube (2 mm Länge) in jeder Bohrlochs mit einer Pinzette und ziehen Sie ihn mit Hilfe eines Schraubendrehers durch Drehung im Uhrzeigersinn. Stellen Sie sicher, dass die Schraube nicht zu weit tief durch den Grad der Drehung der Schraube einstellen, um Beschädigungen der Dura oder das Hirngewebe zu vermeiden.
8. Streifen des Isolierung Mantels 2 mm von der Spitze der Leitungen und dehnen den Draht lange genug runden die Schneckenwelle für eine gute Verbindung zwischen dem Draht und die Schraube. Schließen Sie das Referenz an die vordere Schraube und die Aufnahme Messleitung an die Schraube in der parietalen Kortex. Wenden Sie dann dental Zement um die gesamte Baugruppe im Ort zu sichern, ohne dass die Metallteile.
9. Nachdem Sie überprüft haben, dass der dental Zement durch Sichtkontrolle vollständig getrocknet ist, Naht der Haut und aktuell Mupirocin Salbe. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem 30 ° C Inkubator allein bis es erholt sich von der Operation (ca. 30 min). Dann zurückkehren Sie die Maus zu Hause Käfig, bis Video-EEG Dauerüberwachung beginnt.
   Hinweis: Nach der Operation wird jede Maus (i.p., 1 mL Spritze, Nadel 30 G) mit 5 mg/kg Gentamicin (Antibiotika) und 5 mg/kg von Ketoprofen (Analgetika) injiziert. Tiere sollten überwacht werden, bis sie vollständig ambulante geworden. Sender-implantierten Mäuse haben eine Erholungszeit von ca. 1 Woche.

3. Video und EEG Monitoring und Analyse

1. Eine Maus in einen einzelnen Käfig und den Käfig auf den Funk-Empfänger-Platten, die Faraday-Käfig, zur Unterbrechung der elektrischen Signale aus beliebigen Quellen installiert ist, einschließlich eines Computers, AC Linien und angrenzenden Empfänger zu vermeiden.
   Hinweis: Finden Sie das Handbuch des Herstellers. Vorsicht ist geboten, um blinde Flecken zu vermeiden.
2. Aufzeichnung der elektrischen Aktivität mit dem Wireless-Video-EEG Telemetriesystem.
   1. Öffnen Sie die Software für Video-EEG-Aufzeichnung. Klicken Sie auf "Hardware" und wählen Sie "Konfiguration bearbeiten". Passen Sie den Empfänger und der Sender in jede Maus implantiert. Klicken Sie auf "Channel-Konfiguration" und bestätigen Sie, dass alle Kanäle aktiv sind. Klicken Sie auf "Video-Konfiguration", das Video mit der EEG-Daten (Auflösung von 40 x 480 und Frame-Rate von 30,00) zu synchronisieren.
      Hinweis: Installieren Sie eine IP-Kamera mit hoher Empfindlichkeit, wenn es ist entscheidend für gute Bildqualitäten zu sammeln, die subtile Verhaltensänderungen der Mäuse nachts identifizieren können.
   2. Klicken Sie auf "Setup" und "P3 Setup" zu einzelnen Tier Eingangsinformationen, abgestimmte Kamera und Grafik-Einstellung.
   3. Klicken Sie "Erwerb" und "A/D-Abtastrate" Setup Sampling-raten. Klicken Sie auf "Datasetname", jedes Experiment zu benennen.
      Hinweis: Sampling-Rate für EEG muss höher als 500 Hz. aufgrund der großen Video und EEG-Datengröße, es wird empfohlen, dass nur 24 h Daten pro Sitzung behandelt werden anstatt mit einer 2-Woche-Daueraufzeichnung als eine Datei. Daten können separat in 8 h oder 12 h Abständen bei Mangel an RAM Arbeitsspeicher gespeichert werden.
   4. Den Sender mit einer magnetischen Bar zu aktivieren und klicken Sie auf "Start Übernahme" die Video-EEG-Aufzeichnung zu sammeln. Kontinuierliche Überwachung der Maus durch Video-EEG-System für mindestens 2 Wochen.
      Hinweis: Bei C57BL/6 Mäusen tendenziell SRS in Clustern auftreten, dass zuletzt etwa 5,2 Tage und die Dauer der anfallsfrei ca. 6,7 Tage¹⁷ist.
3. Bestimmen Sie die Beschlagnahme Häufigkeit und Dauer durch manuelle Inspektion mit der Analysesoftware.
   1. Markieren Sie den Bereich mit SRS und exportieren Sie die Daten für die statistische Analyse. Seien Sie vorsichtig, EEG Artefakte auszuschließen, die durch den Kopf kratzen oder kauen generiert werden können; Diese können entfernt werden, indem Sie überprüfen die Videodaten.
      Hinweis: SRS ist definiert als ein plötzliches Auftreten von sich wiederholenden epileptiformen Aktivität Spick (≥ 3 Hz), die weiterhin für mehr als 10 S. krampfhafte Verhalten häufig mit einem Stoß von Spick Aktivität einhergehen können. Non-krampfhafte Anfälle können auch leitfähige spiking Aktivitäten ohne krampfhaft Verhaltensweisen zeigen. Beschlagnahme Kündigung ist definiert als auftritt, wenn die Zündung Spikes zu Grundlinie Aktivität zurückkehren.
   2. Teilen Sie für die Analyse der Beschlagnahme Frequenz die Gesamtzahl der SRS-Fälle, die während der 2 Wochen durch die Gesamtzahl der Aufnahme Tage für jedes einzelne Tier erkannt.
   3. Messen Sie für die Analyse der Dauer der Beschlagnahme die Zeit vom Beginn bis zum Ende der epileptiformen Spick Aktivitäten.
4. Befestigen Sie nach Abschluss der Video-EEG-Aufzeichnung das Gehirn mit 4 % Paraformaldehyd durch Transcardial Perfusion. Um die Maus zu betäuben, Einspritzen einer Lösung (4:0.5) von Ketamin (50 mg/mL) und Xylazin (23,3 mg/mL) aufgelöst in Kochsalzlösung in einer Dosis von 10 μl/g Körpergewicht (1 mL Spritze, i.p.; 26 G-Nadel). Sobald die Maus bestätigt wurde, dass tief betäubt werden, führen Sie Transcardial Perfusion.
5. Bevor das Gehirn der Maus zu isolieren, Abrufen des Senders von der Maus für die Wiederverwendung nach der Reinigung.
   1. Entfernen Sie die dental Zement um die Leitungen mit Pinzette.
   2. Einweichen Sie die Spitze der führt mit dental Zement in 100 % Aceton, bis die dental Zement aufgelöst ist.
   3. Entfernen Sie Gewebe Verunreinigungen vom Sender durch mit destilliertem Wasser spülen.
   4. Spülen Sie den Sender mit 70 % igem Ethanol für 3 h und Luft trocknen für die Lagerung. Unmittelbar vor dem nächsten Gebrauch spülen Sie die Schraube und die Sender mit 70 % Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser, und legen Sie sie in Kochsalzlösung.
      Hinweis: Vorsicht ist geboten, um zu vermeiden, die flexible Drähte zu schneiden, wenn die Maus seit, enthaupten, wenn die flexible Leitungen zu kurz sind, der Lärm in den nächsten Implantation und Video-EEG-Aufzeichnung erhöhen kann.

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Ergebnisse

Erfolgreiche SE kann induzieren hippocampal Zelltod und SRS (Abbildung 1 und Abbildung 2). Wir Verhaltensstörungen akute Anfälle von Diazepam Injektion um 3 Uhr nach SE Beginn gekündigt und die Mäuse 7 Tage oder 6 Wochen später geopfert.

Für Video-EEG-monitoring, die Mäuse erhalten Implantatchirurgie 4 Wochen nach SE und SRS Fälle waren für 2 Wochen ab ca. 5-7 ...

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Diskussion

Diese Arbeit beschreibt die experimentellen Verfahren für die SE Induktion und Bewertung von chronischen Anfällen.

Mehrere Faktoren können erfolgreiche SE Induktion beeinflussen. Präzise Verhaltensstörungen Überwachung gemäß der Racine-Skala ist entscheidend für die Entwicklung der GA-OP. Kopf nicken, zeichnen Vordergliedmaße Klonus, Aufzucht, und fallen Verhaltens von akuten Anfällen zu SE Phase^4,16zu entwickeln. Sobald der...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
Scopolamine methyl nitrate	Sigma	S2250	Make 10X stock
Terbutaline hemisulfate salt	Sigma	T2528	Make 10X stock
Pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Ketamine hydrochloride	Yuhan corporation
Xylazine hydrochloride	Bayer Korea
Diazepam	SAMJIN
Castor oil (Kolliphor EL)	Sigma	C5135	Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil
Saline	Daihan pharm. Co.
5% Dextrose	Daihan pharm. Co.
Iodine solution (Povidin)	Firson
vet ointment (Terramycin)	Pfizer
Blue Nylon	AILEE	NB617
Mupirocin (Bearoban)	Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
Ketoprofen	Samchundang Pharm. Co., Ltd		5 mg/kg
Gentamicin	Huons, Ltd.		5 mg/kg
1 mL syringe	Sung shim medial Co., Ltd.
26 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")
Razor blade	Dorco
Drill	Saeshin precision Co., Ltd.		207A, 35K (speed)
Telemetry video/EEG system	Data sciences International. Inc.	Version 5.20-SP6
Implantable transmitter	Data sciences International. Inc.	ETA-F10
Screw	Sungho Steel		M1.4, 2 mm length stainless steel
Vertex dental material	Dentimex
Acetone	Duksan pure chemicals Co., Ltd.		CAS 67-64-1
Paraformaldehyde (PFA)	millipore	1.04005.1000	4 %
Sucrose	Sigma	S9378	30 % solution in 0.01 M PBS
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Ethanol	EMD Millipore Co.	UN1170
xylene	Duksan pure chemicals Co., Ltd.	UN1307
Acetic acid glacial	Junsei chemical	31010-0350
FSC33 Clear	Leica biosystems		OCT compound for tissue freezing
DPX Mounting for histology	Sigma	6522
Forceps	Fine science tools	11002-12
Scissors	Solco biomedical	02-2445
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	E51070012