Temporal LOB epilepsi ve EEG farelerde Radiotelemetry sistemini kullanarak izleme Pilokarpin modeli

Özet

Bu el yazması sistemik Pilokarpin enjeksiyonu ile durum Epileptikus inducing ve canlı hayvan bir radyo telemetri video ve electroencephalogram sistemi kullanarak tekrarlayan spontan ele geçirme vakaları izleme yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı kronik epilepsi, epileptogenesis ve akut nöbetleri Etyopatogenezi mekanizmaları eğitim için yararlı olabilir.

Özet

Temporal lob epilepsi (TLE) yetişkinlikte ortak bir nörolojik bozukluk var. Kronik epilepsi translasyonel çalışmaları Pilokarpin kaynaklı durumu Epileptikus (SE) sık sık tekrarlayan spontan nöbetler (SRS) özetlemek için seçilir. Burada bir protokol SE indüksiyon Pilokarpin mayi (IP) enjeksiyon ve ele geçirme vakalarının kronik yinelenen bir radyo telemetri video ve electroencephalogram (EEG) sistemi kullanarak canlı hayvanlarda izleme mevcut. Biz Pilokarpin enjeksiyon ve Hipokampal nöronal kayıp onların korelasyon 7 gün ve 6 hafta sonrası Pilokarpin sonra dikkat edilmesi gereken önemli davranış değişiklikleri gösterdi. Ayrıca video ve EEG kaydı elektrot implantasyonu deneysel prosedürler ve frekans analizi ve Kronik Nükseden nöbet süresi açıklar. Son olarak, biz neden beklenen sonuçları her durumda elde değil olası nedenler tartışıyorlar. Bu fareler ve sorun giderme yönergeleri kronik epilepsi modelleme temel bir genel bakış sağlar. Bu iletişim kuralı kronik epilepsi ve epileptogenesis uygun modelleri için bir temel olarak hizmet verebilir inanıyoruz.

Giriş

TLE en yaygın Edinsel epilepsies¹biridir. İnsanların epilepsi ile beyin^2,3' te anormal nöron faaliyetleri sonucunda tekrarlayan nöbetleri deneyim. TLE kez zorlu verilen bu, epilepsi gelişimi temel temel mekanizmaları anlamak çok önemlidir.

İnsan TLE temel özelliklerini özetlemek hayvan modelleri TLE patofizyolojisi, bize kolayca izlemek ve epileptogenesis kritik faktörler işlemek için izin daha iyi beğenisine sunmaktadır. Bunlar arasında yaygın olarak kullanılan^4,5SE chemoconvulsants kaynaklı olmuştur. Hiçbir Hipokampal skleroz ve sağlam SRS^6,7,8, gösteren elektriksel stimülasyon gibi diğer epilepsi modellerin aksine chemoconvulsants sistemik enjeksiyon insan TLE klinik patogenezinde taklit edebilen, Yani, ilk beyin hasarı, bir gizli süresini ve kronik bir epileptik tezahür SRS^5,9,10sahne. Bu nedenle, bu teknik akut beyin hasarı, epileptogenesis veya nöbet bastırma mekanizmaları açıklayan çeşitli çalışmalarda yararlı olabilir. Ayrıca, histopatolojik değişiklikler chemoconvulsants tarafından indüklenen TLE kemirgen modelleri^10,11,12kullanımı için ek bir mantığı sağlayarak insan TLE görülen benzer. Özellikle, yapısal hasar oluşur içeren sürekli olarak her iki kainic asit ve Pilokarpin-kaynaklı SE modelleri yeniden. Ancak, kainic asit enjeksiyon için karşılaştırıldığında, Pilokarpin modeli farelerde kronik epilepsi transgenik fare hatları^5, geniş durumu göz önünde bulundurarak eğitim için oldukça büyük avantajlar sunan daha sağlam SRS üretebilir ^{13 , 14 , 15}. epilepsi Pilokarpin modelinin etkin kullanımı için ek kanıt sağlamaktadır bunların yanında nöbet ilerleme sonra Pilokarpin enjeksiyon kainic asit modeli, genellikle daha hızlıdır.

Burada, biz bir yöntemi inducing se Pilokarpin ı.p. enjeksiyonla ve video ve EEG kronik epilepsi izleme gerçekleştirerek göstermek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm deneysel yordamlar Kore Katolik Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı (NIH Yayınları No. 80-23) için Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. SE indüksiyon

1. 8-hafta-yaşlı erkek C57BL/6NHsd fare satın almak ve her fare tartın. Sonra tüm fareler SE indüksiyon sırasında onların kolay tanımlanması için kuyruk işaretlemek için bir işaretleyici kalem kullanın.
2. Skopolamin metil bromür (Skopolamin; 2 mg/kg) miktarını hesaplamak, terbutalin hemisulfate (terbutalin; 2 mg/kg) ve fare göre Pilokarpin hidroklorür (Pilokarpin; 280 mg/kg) ağırlık ve serum fizyolojik (%0.9 NaCl, 10 mL/kg) çözümleri yapmak için ekleyin.
   Not: Örneğin, fare ağırlık 25 g ise, aşağıdaki miktarlarda uygulanır: Skopolamin ve terbutalin: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0.05 mg, serum fizyolojik: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) 0.25 mL, Pilokarpin =: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg , Serum fizyolojik: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) 0.25 mL =.
3. 1 mL şırınga Skopolamin ve terbutalin karışımı 30 G iğne ile yükleyin. Çözüm intraperitoneally her fare enjekte ve fareler için onların kafes dönün. Skopolamin ve terbutalin yönetim sonra 30 dk Pilokarpin çözüm her fare (ı.p.; 1 mL şırınga; 30 G iğne) enjekte. Hemen Pilokarpin enjeksiyon sonra farelerin gözlem için bir kuluçka (28-30 ° C) yerleştirin.
4. SE indüklenen kadar dikkatle fareler davranışını izleyin. Sahne 3 veya üstü Racine'in ölçeğine göre karşılık limbik motor nöbetler algıladıysa, zaman kayıt ve nöbetler daha sık olarak ortaya çıkan olup olmadığını belirlemek için fare izlemek. Sürekli motor nöbetler daha--dan 2 dk son kez, oda sıcaklığında yeni bir kafeste fareyi getirin ve 3 h için onların Kasılan nöbetler devam ve SE bağlı olup olmadığını belirlemek izleme tutun. Girmek için başarısız fareler ötenazi SE 2 h sonra Pilokarpin enjeksiyon.
   Not: Racine'in ölçek; 1. aşama, ağız ve yüz hareketi; Aşama 2, baş başını sallayarak; Sahne 3, forelimb clonus; evre 4, forelimb clonus ile yetiştirme; Sahne 5, yetiştirme ve forelimb clonus¹⁶ile düşüyor. Eğer fare kafesi oda sıcaklığında sonra hemen SE indüksiyon aktarılmaz, fare Hipertermi nedeniyle ölebilir.
5. 3 h davranış akut nöbetleri sonra SE başlangıçlı diazepam çözüm (ı.p. 10 mg/kg 1 mL şırınga; 30 G iğne) enjekte edilerek sonlandırın. Diazepam çözüm % 10 polyoxyl 35 hidrojene Hint yağı diazepam 5 mg/mL serum fizyolojik (ı.p. 10 mL/kg 1 mL şırınga; 30 G iğne) ekleyerek sulandrarak olun.
   Not: % 10 polyoxyl 35 hidrojene Hint yağı çözüm: 1 mL polyoxyl 35 hidrojene Hint yağı çözüm + 9 mL serum fizyolojik. Çözüm, oda sıcaklığında saklayın. Fare vücut ağırlığı 25 g ise, örneğin, diazepam çözüm 250 µL enjekte: 50 µL diazepam 5 mg/mL + 200 µL % 10 polyoxyl 35 hidrojene castor oil çözüm 250 µL 1 mg/mL diazepam =.
6. Sham fareler için Skopolamin metil bromür ve terbutalin hemisulfate karışımı bir ı.p. enjeksiyon gerçekleştirmek (ı.p.; her iki 2 mg/kg, 10 mL/kg; 1 mL şırınga; 30 G iğne). 30 dk sonra intraperitoneally serum enjekte (ı.p. 10 mL/kg 1 mL şırınga; 30 G iğne).
   Not: Eğer fare vücut ağırlık 25 bin 250 µL serum Pilokarpin yerine enjekte et.
7. Diazepam enjeksiyon (ı.p.; 1 mL şırınga; 30 G iğne) sonra % 5 dekstroz bireysel fare (ı.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne) başına 1 mL yönetmek.
   Not: 1 mL %5 dekstroz enjeksiyonu enerji kaynağı ve sağkalım oranı artırabilir nemlendirme sağlar.
8. Kuluçka (28-30 ° C) sonrası bakım sırasında aşırı salgıları tükürük, gözyaşı ve dışkı gibi yok etmek.
9. 1 gün sonra SE indüksiyon, fareler tartmak ve fazladan bir gün için kuluçka (28-30 ° C) saklayın. Gün 2, sonra SE indüksiyon, fareler tartmak ve ev onların kafes getirin. Onların kurtarma kolaylaştırmak için nemli chow sağlar.
   Not: Bu deneyde, C57BL/6NHsd için ölüm oranı SE feshinden sonra %8,57 ortalama (3 test 35 farelerin) idi.
10. Günlük vücut ağırlığı hayvanların 7 gün sonrası Pilokarpin kadar ölçmek ve fare % 5 dekstroz (ı.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne) enjekte ne zaman vücut ağırlığı değil artmıştır. Fareler vücut ağırlığı yeniden elde etmek ve 2 gün sonra Pilokarpin enjeksiyon, nemli chow zorluk olmadan tüketmek başladığımızda vücut ağırlığı izlemesini durdurun.
    Not: Bir farenin vücut ağırlığını 7 gün sonrası SE kadar artmamıştır, fare deneyden dışlamak ve karbon dioksit tarafından ötenazi. Fare arka plan bağlı olarak, zaman zaman ölüm meydana gelebilir; Ancak, C57BL/6NHsd söz konusu olduğunda, bu deneylerde fare az % 1 öldü. 7 günden daha uzun bir süre sonra SE indüksiyon yaşama ile fareler nadiren gizli döneminde ölmek.

2. implantasyonu ameliyatı Video-EEG izlemek için

1. 12-hafta-yaşlı fareler (4 hafta sonra SE indüksiyon) EEG izlemek için telemetri implantasyon gerçekleştirmek için hazır olun.
   Not: İmplantasyon zamanlaması deneysel amaçlar ve fare suşları bağlı olarak değiştirilebilir.
2. Ameliyattan önce fare (4:0.5) ketamin (50 mg/mL) ve karışımı bir doz 2,5 µL/g vücut ağırlığı (ı.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne), serum içinde çözünmüş xylazine (23,3 mg/mL) çözüm ile anestezi. Düzenli aralıklarla (15dk aralığı en fazla) monitör solunum hızı ve fare solunum çaba ve anestezi derinliği pedal çekilme refleks tarafından değerlendirmek.
3. Kulak Bar ve bir ısırık plaka ile stereotaksik çerçevesindeki fareyi getirin ve veteriner merhem körlüğü önlemek için her iki gözde uygulayın.
4. Ameliyat sırasında steril koşullar korumak için cerrahi siteleri jilet kullanarak tıraş. Cerrahi alan kürk kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun. Tıraştan sonra cilt %70 etanol ve iyot çözeltisi ile dezenfekte.
   Not: Cerrahi steril eldiven ve steril ekipmanları ve aseptik teknikler kullanarak maskeleri, aseptik bir şekilde yapılmalıdır.
5. Anestezi derinliği onayladıktan sonra kafatası ortaya çıkarmak için deri bir ensizyon olun. İki burr deliği ile hastanın eksenindeki (AP) Bregma koordinatları stereotaksik aparatı için ekli bir tatbikat yapmak: +0.1 mm, medyolateral eksen (ML): +0.1 mm (başvuru) ve AP: −0.2 mm, ML: +0.22 mm (sol parietal korteks)¹³.
   1. PBS batırılmış pamuk swap, % 70 etanol ve iyot çözüm tarafından takip ile cildinizi silin. Boyuna kesik başından ortasında makasla Lambda (sagittal ve lambdoid dikiş buluştuğu nokta), Bregma (koronal sütür sagittal dikiş tarafından kesişim noktası) ve hedef konumu göstermek için yapmak.
   2. Lambda ve Bregma gibi anatomik simge yapılara tanımlayın. Konumlandırmak matkap Bregma ve Not X, Y koordinatları için bu nokta.
   3. Bir beyin atlas defterleri kullanıyorsanız veya beyin bölgeleri EEG kaydı için uygun koordinatlarını belirlemek için başvurular yayınlandı. Sonra vida (başvuru ve kayıt) koordinatlarını hesaplamak Bregma koordinatları kullanarak ölçülen 2.5.2 adımda.
   4. Matkap biraz fazla ileri nereye kafatası incelir noktada ekleme önlemek için dikkatli olmak bir burr delik açmak için matkap yavaşça indirin.
6. Tek kanal gövdesi EEG verici ense boyun arkasında subkutan kablosuz ve esnek yer ekle kafatası yol açar.
7. Paslanmaz çelik vida (2 mm Uzunluk) cımbızla her burr deliğe yerleştirin ve saat yönünde döndür tarafından bir tornavida kullanarak sıkın. Vida beyin zarı veya beyin doku hasarı önlemek için çok çok derine vida dönme derecesi ayarlayarak eklenmez emin olun.
8. Yalıtım kat neden ucundan 2 mm şerit ve tel tel ve vida arasında iyi bir bağlantı için vida mili yuvarlamak yeterince germek. Başvuru Kurşun açık vida ve parietal korteks içinde vida kayıt adayına bağlayın. Daha sonra tüm montaj yerinde metal parçalar maruz kalmadan güvenliğini sağlamak için diş çimento uygulayın.
9. Diş çimento görsel denetim tarafından tamamen kurudu doğruladıktan sonra deri dikiş ve topikal mupirocin merhem uygulamak. Cerrahi (yaklaşık 30 dk) normale dönene kadar fareyi 30 ° C kuluçka makinesine yalnız getirin. Video-EEG sürekli izlenmesi başlayana kadar sonra fare ev kafese dönelim.
   Not: 5 mg/kg gentamisin (antibiyotik) ve 5 mg/kg ketoprofen (ağrı kesici) ile ameliyat sonrası (ı.p.; 1 mL şırınga; 30 G iğne) her fare enjekte edilir. Tam olarak ayakta olana hayvanlar izlenmelidir. Verici implante fareler bir iyileşme süresi yaklaşık 1 hafta var.

3. video ve EEG izleme ve analiz

1. Bireysel bir kafes içinde bir fare yerleştirin ve Faraday kafesi kesinti, bir bilgisayar, AC çizgiler ve bitişik alıcıları herhangi bir kaynaktan alınan elektrik sinyalleri önlemek için yüklendiği kafes kablosuz alıcı plakalar üzerine yerleştirin.
   Not: Üreticinin sağladığı el kitabına bakın. Kör noktalar uzak durmaya özen göstermelidir.
2. Kablosuz video-EEG telsiz sistemi kullanarak elektrik etkinliklerini kaydetmek.
   1. Video-EEG kayıt yazılımı açın. "Donanım"'ı tıklatın ve "yapılandırma Düzenle" yi seçin. Alıcı ve verici her fare implante maç. "Yapılandırma kanal" tıklatın ve tüm kanallar etkin olduğunu doğrulayın. Tıklayın "Video yapılandırma" video EEG veri (kararlılık-in 40 x 480 ve kare hızına olan 30,00) ile eşitlemek için.
      Not: Eğer ince davranış değişiklikleri farelerin geceleri tanımlayabilirsiniz iyi görüntü kaliteleri toplamak için kritik bir IP kamera ile yüksek hassasiyet yükleyin.
   2. Tıkırtı "Tertibat" ve "P3 kurulumunu" giriş bireysel hayvan bilgi, eşleşen kamera ve grafik ayarı.
   3. "Satın alma" ve "A/D örnekleme oranı" Kur örneklendirme oranı için'ı tıklatın. Tıklayın "veri kümesi adı" her deney belirlemek için.
      Not: EEG için örnekleme hızını büyük video ve EEG veri boyutu nedeniyle 500 Hz. daha yüksek olması gerekir, sadece tavsiye edilir 24 saat veri oturum başına işlenmesini sürekli bir 2-hafta kayıt tek bir dosya kullanarak yerine. RAM bellek yetersizliği durumunda 8 h veya 12 h aralıklarla veri ayrı ayrı saklanabilir.
   4. Manyetik bir çizgiyle verici etkinleştirmek ve "satın alma Başlat" video-EEG kaydı toplamak için. Sürekli fare video-EEG sistemi tarafından en az 2 hafta için monitör.
      Not: C57BL/6 fareler için SRS kümelerde son yaklaşık 5.2 gün ve nöbet ücretsiz dönemi süresi yaklaşık 6.7 gün¹⁷yaşında meydana gelme eğilimi.
3. Nöbet sıklığı ve süresi analiz yazılımı kullanarak el ile incelemesi tarafından belirler.
   1. SRS gösterilen alanını işaretlemek ve istatistiksel analizleri için veri verme. Kafa çizilmemesi veya çiğneme tarafından oluşturulan EEG eserler dışlamak için dikkatli olun; Bunlar-ebilmek var olmak çıkarmak video verileri kontrol ederek.
      Not: SRS ani tekrarlayan epileptiform aktivite spiking tanımlanır (≥ 3 Hz) devam ederse 10'dan fazla s. Kasılan davranışlarını sık etkinlik spiking bir patlama ile eşlik edilebilir için. Sigara Kasılan nöbetler de sarsıcı davranışlar olmadan electrographic spiking faaliyetleri kanıtlamanın. Nöbet fesih ateş sivri temel etkinlik için döndüğünüzde meydana gelen olarak tanımlanır.
   2. Nöbet frekans analizi için kayıt gün bireysel her hayvan için toplam sayısı 2 hafta boyunca tespit SRS durumlarda toplam sayısına bölün.
   3. Nöbet süresi analiz için başlangıç zaman faaliyetleri spiking epileptiform sonuna ölçmek.
4. Video-EEG kaydı tamamlandıktan sonra beyin transcardial perfüzyon tarafından %4 paraformaldehyde ile düzeltmek. Fare anestezi için bir çözüm (4:0.5) ketamin (50 mg/mL) ve serum bir doz 10 μL/g vücut ağırlığı (ı.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne), çözünmüş xylazine (23,3 mg/mL) enjekte. Fare derin anestezi onaylandıktan sonra transcardial perfüzyon gerçekleştirin.
5. Fare beyin izole önce verici temizlik sonra yeniden kullanmak üzere fare al.
   1. Forseps kullanarak müşteri adaylarını etrafında diş çimento kaldırın.
   2. Diş çimento eriyene kadar diş çimento ile potansiyel müşteriler ucu % 100 aseton içinde bekletin.
   3. Verici etrafında doku kirletici distile su ile durulama tarafından kaldırın.
   4. Durulama verici 3 h ve hava için % 70 etanol ile depolama için kuru. Hemen önce sonraki kullanım, vida ve verici % 70 etanol, distile su tarafından takip ile durulayın ve salin koyun.
      Not: Ne zaman beri fare esnek yol çok kısa iseniz decapitating, sonraki implantasyon ve video-EEG kaydı gürültü artış esnek kablo kesme önlemek için özen göstermelidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Başarılı SE Hipokampal hücre ölümü ve SRS (Resim 1 ve Şekil 2) neden olabilir. Biz SE başlangıçlı sonra 3 h diazepam enjeksiyonla davranış akut nöbetleri sonlandırıldı ve fareler 7 gün veya 6 hafta sonra kurban.

Video-EEG izlenmesi, alınan fareler 4 hafta sonra SE, cerrahi implant ve SRS durumlarda 5-7 hafta sonra SE başlangıçlı 2 hafta boyunca d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu eser SE indüksiyon ve kronik nöbetler değerlendirilmesi için deneysel yordamlar açıklanır.

Çeşitli faktörler başarılı SE indüksiyon etkiler. Doğru davranış Racine ölçeğin göre izleme SRS gelişimi için önemlidir. Baş başını sallayarak, forelimb clonus, yetiştirme ve düşen davranış akut nöbetleri SE faz^4,16geliştirme özellikleridir. İlk motor nöbet algılandığında, girmeden önce daha sonra Kas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
Scopolamine methyl nitrate	Sigma	S2250	Make 10X stock
Terbutaline hemisulfate salt	Sigma	T2528	Make 10X stock
Pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Ketamine hydrochloride	Yuhan corporation
Xylazine hydrochloride	Bayer Korea
Diazepam	SAMJIN
Castor oil (Kolliphor EL)	Sigma	C5135	Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil
Saline	Daihan pharm. Co.
5% Dextrose	Daihan pharm. Co.
Iodine solution (Povidin)	Firson
vet ointment (Terramycin)	Pfizer
Blue Nylon	AILEE	NB617
Mupirocin (Bearoban)	Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
Ketoprofen	Samchundang Pharm. Co., Ltd		5 mg/kg
Gentamicin	Huons, Ltd.		5 mg/kg
1 mL syringe	Sung shim medial Co., Ltd.
26 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")
Razor blade	Dorco
Drill	Saeshin precision Co., Ltd.		207A, 35K (speed)
Telemetry video/EEG system	Data sciences International. Inc.	Version 5.20-SP6
Implantable transmitter	Data sciences International. Inc.	ETA-F10
Screw	Sungho Steel		M1.4, 2 mm length stainless steel
Vertex dental material	Dentimex
Acetone	Duksan pure chemicals Co., Ltd.		CAS 67-64-1
Paraformaldehyde (PFA)	millipore	1.04005.1000	4 %
Sucrose	Sigma	S9378	30 % solution in 0.01 M PBS
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Ethanol	EMD Millipore Co.	UN1170
xylene	Duksan pure chemicals Co., Ltd.	UN1307
Acetic acid glacial	Junsei chemical	31010-0350
FSC33 Clear	Leica biosystems		OCT compound for tissue freezing
DPX Mounting for histology	Sigma	6522
Forceps	Fine science tools	11002-12
Scissors	Solco biomedical	02-2445
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	E51070012