Il modello di pilocarpina di epilessia del lobo temporale e monitoraggio EEG utilizzando il sistema di radiotelemetria in topi

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un metodo di indurre il epilepticus di condizione di iniezione sistemica pilocarpina e di monitoraggio spontanei sequestri ricorrenti in animali vivi, utilizzando un sistema di elettroencefalogramma e telemetria wireless video. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi patofisiologici di epilessia cronica, nella epilettogenesi e grippaggi acuti.

Abstract

Epilessia del lobo temporale (TLE) è un disturbo neurologico comune nell'età adulta. Per gli studi traslazionali dell'epilessia cronica, indotti da pilocarpina epilepticus di condizione (SE) è frequentemente selezionati per ricapitolare i grippaggi ricorrenti spontanei (SRS). Qui presentiamo un protocollo di induzione SE da intraperitoneale (i.p.) l'iniezione di pilocarpina e monitoraggio dei grippaggi ricorrenti cronici negli animali vivi, utilizzando un sistema di elettroencefalogramma (EEG) e di telemetria wireless video. Abbiamo dimostrato notevoli cambiamenti comportamentali che richiedono attenzione dopo l'iniezione di pilocarpina e loro correlazione con la perdita di un neurone hippocampal a 7 giorni e post-Pilocarpina 6 settimane. Inoltre descriviamo le procedure sperimentali di impianto dell'elettrodo per video e registrazione EEG e analisi della frequenza e durata dei sequestri ricorrenti cronici. Infine, si discutono i motivi possibili perché i risultati attesi non sono raggiunti in ogni caso. Questo fornisce una panoramica di base di modellazione di epilessia cronica nei topi e linee guida per la risoluzione dei problemi. Crediamo che questo protocollo può servire come base per modelli adatti di epilessia cronica ed epilettogenesi.

Introduzione

TLE è uno dei più comuni epilessie acquisite¹. Persone con epilessia crisi epilettiche ricorrenti a seguito di attività di un neurone anormale nel cervello^2,3. Dato che spesso la TLE è insolubile, è fondamentale capire i meccanismi di base alla base dello sviluppo dell'epilessia.

Modelli animali che possono ricapitolare le caratteristiche chiave di TLE umano possono offrire migliore apprezzamento della patofisiologia TLE, permettendoci di facilmente controllare e manipolare fattori critici nella epilettogenesi. Fra loro, SE chemoconvulsants-indotto è stato ampiamente usato^4,5. A differenza di altri modelli di epilessia, come la stimolazione elettrica che non mostra nessuna sclerosi ippocampale e robusto SRS^6,7,8, l'iniezione sistemica di chemoconvulsants può imitare la patogenesi cliniche di TLE umana, cioè, la ferita di cervello iniziale, un periodo latente e un epilettico cronico tappa manifestandosi SRS^5,9,10. Pertanto, questa tecnica può essere utilizzata in vari studi che spiega i meccanismi di danno cerebrale acuto, epilettogenesi o soppressione di sequestro. Inoltre, alterazioni istopatologiche indotte da chemoconvulsants sono simili a quelli osservati in TLE umana, fornendo un ulteriore spiegazione razionale per l'uso di TLE modelli del roditore^10,11,12. In particolare, danni strutturali che coinvolgono l'ippocampo sono state costantemente riprodotte in entrambi i modelli kainic SE indotta da acido e pilocarpina. Tuttavia, rispetto all'iniezione di acido kainic, il modello di Pilocarpina può produrre più robusto SRS in topi, che possono offrire vantaggi considerevoli per studiare l'epilessia cronica quando si considera l'ampia disponibilità di topi transgenici linee^{5, 13 , 14 , 15}. Inoltre, progressione di sequestro dopo l'iniezione di Pilocarpina è generalmente più veloce del modello di acido kainic, fornendo la prova supplementare per l'uso efficace di un modello di pilocarpina di epilessia.

Qui, noi dimostrare un metodo di induzione SE tramite l'iniezione i.p. di pilocarpina e realizzando video e controllo di EEG nell'epilessia cronica.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato etico della Università Cattolica di Corea e sono state effettuate in conformità della istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH pubblicazioni n. 80-23).

1. SE induzione

1. Acquisto di topi C57BL/6NHsd maschio 8-settimana-vecchio e pesare ogni mouse. Quindi, utilizzare un pennarello per segnare le code di tutti i topi per la loro facile identificazione durante l'induzione di SE.
2. Calcolare la quantità di bromuro di metile di scopolamina (Scopolamina; 2 mg/kg), hemisulfate terbutaline (terbutaline; 2 mg/kg) ed il cloridrato di pilocarpine (Pilocarpina; 280 mg/kg) in base al peso del mouse e aggiungere soluzione fisiologica (0,9% NaCl, 10 mL/kg) per rendere le soluzioni.
   Nota: Ad esempio, se il peso del mouse è di 25 g, vengono applicati i seguenti importi: scopolamina e terbutaline: 2 mg/kg * (25g/1.000 g) = 0,05 mg, soluzione salina: 10 mL/kg * (25g/1.000 g) = 0,25 mL, pilocarpina: 280 mg/kg * (25g/1.000 g) = 7 mg , Soluzione fisiologica: 10 mL/kg * (25g/1.000 g) = 0,25 mL.
3. Caricare la scopolamina e terbutaline miscela in una siringa da 1 mL con ago 30 G. Iniettare la soluzione intraperitonealmente in ogni mouse e quindi restituire i topi nelle loro gabbie. A 30 min dopo la somministrazione di scopolamina e terbutaline, iniettare la soluzione di pilocarpina in ogni mouse (i.p.; G 30 ago e siringa da 1 mL). Immediatamente dopo l'iniezione di pilocarpina, posizionare i topi in un incubatore (28-30° C) per l'osservazione.
4. Fino a quando SE è indotta, monitorare attentamente il comportamento dei topi. Se vengono rilevati i grippaggi del motore limbici che corrispondono alla fase 3 o superiore secondo la scala di Racine, il tempo di registrare e monitorare i topi per determinare se le convulsioni si presentano più frequentemente. Una volta che i grippaggi del motore continui durano più di 2 min, posizionare il mouse in una nuova gabbia a temperatura ambiente e mantenere monitoraggio per 3 h determinare se la loro crisi convulsive continuano e SE è indotto. Eutanasia i topi che non riuscì ad entrare SE a circa 2 h dopo l'iniezione di pilocarpina.
   Nota: Scala di Racine; fase 1, bocca e movimento facciale; fase 2, testa annuendo; fase 3, clono arto anteriore; fase 4, allevamento con il clonus arto anteriore; fase 5, allevamento e cadere con la zampa anteriore clono¹⁶. Se il mouse non viene trasferito alla gabbia a temperatura ambiente subito dopo induzione SE, il mouse può morire a causa di ipertermia.
5. Terminare comportamentale acute crisi epilettiche a 3 h dopo l'inizio SE iniettando soluzione diazepam (10 mg/kg, i.p.; ago 30g; siringa da 1 mL). Rendono la soluzione di diazepam diluendo 5 mg/mL di diazepam nel 10% 35 idrogenati ricino poliossile con l'aggiunta di soluzione salina (10 mL/kg, i.p.; ago 30g; siringa da 1 mL).
   Nota: 10% polyoxyl 35 idrogenato olio di ricino soluzione: 1 mL di soluzione di olio di ricino idrogenato 35 polyoxyl + 9 mL di soluzione salina. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. Ad esempio, se il peso del corpo del mouse è di 25 g, iniettare 250 µ l di soluzione di diazepam: 50 diazepam 5mg/mL µ l + 200 µ l 10% polyoxyl 35 hydrogenated castor oil soluzione = diazepam di 1 mg/mL 250 µ l.
6. Per topi sham, eseguire un'iniezione i.p. di scopolamina bromuro di metile e terbutaline hemisulfate della miscela (i.p.; entrambi 2 mg/kg, siringa da 1 mL, 10 mL/kg; ago 30g). 30 min più tardi, iniettare la soluzione fisiologica per via intraperitoneale (i.p.; 10 mL/kg; G 30 ago e siringa da 1 mL).
   Nota: Se il peso del corpo del mouse è di 25 g, iniettare 250 µ l di soluzione fisiologica invece di pilocarpina.
7. Dopo l'iniezione di diazepam (i.p.; G 30 ago e siringa da 1 mL), somministrare 1 mL di destrosio 5% per singolo topo (i.p.; siringa da 1 mL; ago da 26 G).
   Nota: 1 mL di iniezione del destrosio 5% fornisce la fonte di energia e idratazione che possa aumentare il tasso di sopravvivenza.
8. Durante la post-cura nell'incubatrice (28-30 ° C), pulire eccessive secrezioni quali saliva, lacrime e feci.
9. Al giorno 1 dopo induzione SE, pesare i topi e tenerli in incubatrice (28-30 ° C) per un giorno extra. Giorno 2, dopo induzione SE, pesare i topi e restituirli alla loro gabbia a casa. Fornire cibo umido per facilitare il loro recupero.
   Nota: In questo esperimento, il tasso di mortalità per C57BL/6NHsd dopo la terminazione SE era 8,57% in media (3 uscite di 35 topi testati).
10. Misurare ogni giorno del peso corporeo degli animali fino al post-pilocarpine 7 giorni e iniettare i topi con 5% di destrosio (i.p.; siringa da 1 mL; ago da 26 G) quando il peso corporeo non è aumentato. Interrompere il monitoraggio di peso di corpo quando i topi cominciano a riguadagnare il peso corporeo e consumare cibo umido senza difficoltà a 2 giorni dopo l'iniezione di pilocarpina.
    Nota: Se il peso del corpo di un topo non è aumentato fino a 7 giorni post SE, escludere il mouse dall'esperimento ed eutanasia dall'anidride carbonica. A seconda dello sfondo del mouse, la morte può verificarsi occasionalmente; Tuttavia, nel caso di C57BL/6NHsd, meno dell'1% dei topi morti in questi esperimenti. Con la sopravvivenza di più di 7 giorni dopo l'induzione SE, i topi muoiono raramente durante il periodo latente.

2. l'impianto chirurgia per controllo del Video-EEG

1. Preparare 12-settimana-vecchi topi (4 settimane dopo induzione SE) per eseguire l'impianto di telemetria per il monitoraggio EEG.
   Nota: Temporizzazione dell'impianto può essere modificato a seconda delle fini sperimentali e i ceppi di topi.
2. Prima dell'intervento chirurgico, anestetizzare il mouse con una miscela (4:0.5) di chetamina (50 mg/mL) e xilazina (23,3 mg/mL) di soluzione disciolti in una soluzione salina ad una dose di 2,5 µ l/g di peso (i.p.; siringa da 1 mL; ago da 26 G). Monitorare la frequenza respiratoria e sforzo respiratorio del mouse a intervalli regolari (intervallo di 15 minuti massimo) e valutare la profondità dell'anestesia dal riflesso del pedale ritiro.
3. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica con orecchio bar e un piatto di morso e applicare unguento veterinario su entrambi gli occhi per evitare la cecità.
4. Per mantenere condizioni di sterilità durante la chirurgia, la barba siti chirurgici utilizzando una lama di rasoio. Fare attenzione a evitare la contaminazione di pelliccia del campo chirurgico. Dopo la rasatura, disinfettare la pelle con soluzione di iodio e di etanolo 70%.
   Nota: Chirurgia dovrebbe essere eseguita in modo asettico, indossare guanti sterili e maschere, utilizzando attrezzature sterilizzate e tecniche asettiche.
5. Dopo aver confermato la profondità dell'anestesia, praticare un'incisione del midline della pelle per esporre il cranio. Fare due fori con un trapano collegato all'apparato stereotassica alle coordinate dal Bregma nell'asse antero-posteriore (AP): +0,1 mm, asse mediolateral (ML): +0,1 mm (riferimento) e AP: −0.2 mm, ML: +0,22 mm (corteccia parietale di sinistra)¹³.
   1. Pulire la pelle con swap di cotone imbevuto di PBS, seguita da 70% soluzione di etanolo e iodio. Fare un'incisione longitudinale al centro della testa con le forbici per esporre la Lambda (il punto dove si incontrano sagittali e le suture del cranio), il Bregma (il punto di incrocio della sutura coronale dalla sutura sagittale) e il percorso di destinazione.
   2. Identificare punti di riferimento anatomici quali Lambda e Bregma. Posizionare la punta del trapano al Bregma e nota la X, Y coordinate per questo punto.
   3. Utilizzare un libri di Atlante del cervello o pubblicati i riferimenti per determinare le coordinate appropriate delle regioni del cervello per registrazione EEG. Quindi, calcolare le coordinate per le viti (riferimento e registrazione) utilizzando le coordinate di Bregma misurata al punto 2.5.2.
   4. Abbassare lentamente la punta del trapano per fare un foro della bava facendo attenzione a evitare di inserire la punta del trapano troppo lontano al punto in cui il cranio diventa più sottile.
6. Inserire il corpo del singolo canale wireless trasmettitore EEG dietro la nuca del collo per via sottocutanea e posto flessibile conduce vicino al cranio.
7. Inserire una vite in acciaio inox (2 mm di lunghezza) in ogni foro della bava con pinzette e stringere con un cacciavite di rotazione in senso orario. Assicurarsi che la vite non viene inserita troppo in profondità regolando il grado di rotazione della vite al fine di evitare di danneggiare il dura o tessuti cerebrali.
8. Striscia il cappotto di isolamento 2 mm dalla punta delle derivazioni e allungare il filo abbastanza a lungo per arrotondare l'albero di vite per un buon collegamento tra il filo e la vite. Collegare il cavo di riferimento per la vite anteriore e il cavo di registrazione per la vite nella corteccia parietale. Quindi, applicare il cemento dentale per fissare il gruppo intero in luogo senza esporre le parti metalliche.
9. Dopo aver verificato che il cemento dentale si è completamente asciugato mediante ispezione visiva, suturare la pelle e applicare mupirocina topica unguento. Posizionare il mouse in un'incubatrice di 30 ° C da solo fino a quando si recupera dalla chirurgia (circa 30 min). Quindi, tornare il mouse dalla gabbia fino a quando il controllo del video-EEG continuo comincia.
   Nota: Dopo la chirurgia, ogni mouse è iniettato (i.p.; G 30 ago e siringa da 1 mL) con 5 mg/kg di gentamicina (antibiotici) e 5 mg/kg di ketoprofene (analgesici). Gli animali devono essere monitorati fino a quando non diventano completamente ambulanti. Trasmettitore-impiantati i topi hanno un periodo di recupero di circa 1 settimana.

3. video e analisi e monitoraggio EEG

1. Posizionare il mouse in una gabbia individuale e posizionare la gabbia in cima le piastre di ricevitore wireless in cui è installata la gabbia di Faraday per evitare l'interruzione dei segnali elettrici da eventuali fonti tra cui un computer, linee AC e ricevitori adiacenti.
   Nota: Consultare il manuale fornito dal produttore. Cura deve essere presa per evitare punti ciechi.
2. Registrare l'attività elettrica utilizzando il sistema di telemetria wireless video-EEG.
   1. Aprire il software per la registrazione video-EEG. Fare clic su "Hardware" e seleziona "Modifica configurazione". Abbinare il ricevitore e il trasmettitore impiantato in ogni mouse. Fare clic su "Configurazione di canale" e confermare che tutti i canali sono attivi. Fare clic su "Configurazione Video" per sincronizzare il video con i dati di EEG (risoluzione di 40 x 480 e frame rate di 30.00).
      Nota: Installare una telecamera IP con alta sensibilità se è fondamentale per raccogliere la qualità di immagine buona che può identificare sottili cambiamenti comportamentali dei topi di notte.
   2. Fare clic su "Setup" e "P3 setup" per informazioni di animale singole input, fotocamera abbinata e impostazione grafico.
   3. Per frequenze di campionamento di installazione, fare clic su "Acquisizione" e "Frequenza di campionamento A/D". Fare clic su "nome del set di dati" per designare ogni esperimento.
      Nota: Frequenza di campionamento per EEG deve essere maggiore di 500 Hz. a causa del video di grandi dimensioni e la dimensione dei dati EEG, è consigliabile che solo 24 ore di dati vengono gestiti per ogni sessione piuttosto che usare una 2-settimana-registrazione continua come un unico file. I dati possono essere salvati separatamente ad intervalli di 8 ore o 12 ore in caso di carenza di memoria RAM.
   4. Attivare il trasmettitore con una barra magnetica e cliccare su "Start acquisizione" per raccogliere la registrazione video-EEG. Monitorare continuamente il mouse dal sistema di video-EEG per almeno 2 settimane.
      Nota: Per topi C57BL/6, SRS tende a verificarsi nei cluster che Ultima circa 5,2 giorni e la durata del periodo di grippaggio-libero è di circa 6,7 giorni¹⁷.
3. Determinare la frequenza delle crisi e la durata di ispezione manuale utilizzando il software di analisi.
   1. Contrassegnare l'area risultati SRS ed esportare i dati per l'analisi statistica. Essere prudenti per escludere gli artefatti di EEG che possono essere generati da grattarsi la testa o masticare; Questi possono essere rimossi controllando i dati video.
      Nota: SRS è definito come un inizio improvviso di ripetitivo epileptiform chiodare l'attività (≥ 3 Hz) che persiste per più di 10 s. comportamenti convulsivi possono essere frequentemente accompagnati con una raffica di chiodare l'attività. Non-crisi convulsive possono anche dimostrare elettrografico chiodando attività senza comportamenti convulsivi. Terminazione del grippaggio è definito come che si verificano quando le punte di cottura torna a attività di base.
   2. Per l'analisi della frequenza delle crisi, dividere il numero totale dei casi SRS rilevati durante le 2 settimane per il numero totale di giorni di registrazione per ogni singolo animale.
   3. Per l'analisi di durata del sequestro, misurare il tempo dall'inizio alla fine del epileptiform chiodare attività.
4. Dopo il completamento della registrazione video-EEG, fissare il cervello con paraformaldeide al 4% di perfusione perfusione. Per anestetizzare il mouse, iniettare una soluzione (4:0.5) di chetamina (50 mg/mL) e xilazina (23,3 mg/mL) disciolto in soluzione fisiologica ad una dose del peso corporeo di 10 μL/g (i.p.; siringa da 1 mL; ago da 26 G). Una volta che il mouse è confermato di essere anestetizzati, eseguire perfusione perfusione.
5. Prima di isolare il cervello del mouse, è possibile recuperare il trasmettitore dal mouse per il riutilizzo dopo la detersione.
   1. Rimuovere il cemento dentale intorno i cavi usando il forcipe.
   2. Immergere la punta delle derivazioni cemento dentale in 100% di acetone finché il cemento dentale è sciolto.
   3. Rimuovere i contaminanti di tessuto intorno al trasmettitore sciacquandolo con acqua distillata.
   4. Sciacquare il trasmettitore con etanolo al 70% per 3 h e aria asciugare per deposito. Immediatamente prima dell'uso successivo, sciacquare la vite e il trasmettitore con etanolo al 70%, seguita da acqua distillata e metterli in una soluzione salina.
      Nota: Cura deve essere presa per evitare di tagliare i fili flessibili quando decapitare il mouse poiché, se i cavi flessibili sono troppo brevi, il rumore nel prossimo impianto e registrazione video-EEG può aumentare.

Risultati

Successo SE può indurre la morte delle cellule ippocampali e SRS (Figura 1 e Figura 2). Abbiamo terminato grippaggi acuti del comportamento tramite l'iniezione di diazepam a 3 h dopo l'inizio SE e sacrificato i topi 7 giorni o 6 settimane più tardi.

Per controllo del video-EEG, i topi hanno ricevuti chirurgia implantare a 4 settimane dopo SE e casi SRS sono stati valu...

Discussione

Questo lavoro descrive le procedure sperimentali per l'induzione di SE e la valutazione dei grippaggi cronici.

Diversi fattori possono influire sulla riuscita induzione SE. Accurato monitoraggio del comportamento secondo la scala di Racine è fondamentale per lo sviluppo di SRS. Testa annuendo, clono arto anteriore, allevamento e cadere sono i tratti distintivi del comportamento di acuta crisi epilettiche in via di sviluppo SE fase^4,16...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
Scopolamine methyl nitrate	Sigma	S2250	Make 10X stock
Terbutaline hemisulfate salt	Sigma	T2528	Make 10X stock
Pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Intensive care unit	Daejong instrument industry Co., Ltd.		28~30℃
Ketamine hydrochloride	Yuhan corporation
Xylazine hydrochloride	Bayer Korea
Diazepam	SAMJIN
Castor oil (Kolliphor EL)	Sigma	C5135	Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil
Saline	Daihan pharm. Co.
5% Dextrose	Daihan pharm. Co.
Iodine solution (Povidin)	Firson
vet ointment (Terramycin)	Pfizer
Blue Nylon	AILEE	NB617
Mupirocin (Bearoban)	Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
Ketoprofen	Samchundang Pharm. Co., Ltd		5 mg/kg
Gentamicin	Huons, Ltd.		5 mg/kg
1 mL syringe	Sung shim medial Co., Ltd.
26 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")
Razor blade	Dorco
Drill	Saeshin precision Co., Ltd.		207A, 35K (speed)
Telemetry video/EEG system	Data sciences International. Inc.	Version 5.20-SP6
Implantable transmitter	Data sciences International. Inc.	ETA-F10
Screw	Sungho Steel		M1.4, 2 mm length stainless steel
Vertex dental material	Dentimex
Acetone	Duksan pure chemicals Co., Ltd.		CAS 67-64-1
Paraformaldehyde (PFA)	millipore	1.04005.1000	4 %
Sucrose	Sigma	S9378	30 % solution in 0.01 M PBS
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Ethanol	EMD Millipore Co.	UN1170
xylene	Duksan pure chemicals Co., Ltd.	UN1307
Acetic acid glacial	Junsei chemical	31010-0350
FSC33 Clear	Leica biosystems		OCT compound for tissue freezing
DPX Mounting for histology	Sigma	6522
Forceps	Fine science tools	11002-12
Scissors	Solco biomedical	02-2445
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	E51070012