O modelo de pilocarpina de epilepsia do lobo Temporal e EEG monitoramento usando sistema de radiotelemetria em ratos

Resumo

Este manuscrito descreve um método de induzir o estado de mal epiléptico por injeção de pilocarpina sistêmica e de monitorização espontâneas convulsões recorrentes em animais vivos, usando um sistema de eletroencefalograma e vídeo sem fio telemetria. Este protocolo pode ser utilizado para estudar os mecanismos fisiopatológicas da epilepsia crônica, epileptogenesis e convulsões agudas.

Resumo

Epilepsia do lobo temporal (TLE) é uma desordem neurológica comum na idade adulta. Para estudos translacionais de epilepsia crônica, induzidas pela pilocarpina estado epiléptico (SE) frequentemente é selecionado para recapitular espontâneas convulsões recorrentes (SRS). Aqui nós apresentamos um protocolo de indução SE por injeção intraperitoneal (i.p.) de pilocarpina e monitoramento de convulsões recorrentes crônicas em animais vivos, usando um sistema de eletroencefalograma (EEG) e vídeo sem fio telemetria. Demonstrámos notáveis mudanças comportamentais que necessitam de atenção após a injeção de pilocarpina e sua correlação com a perda neuronal hippocampal em 7 dias e pós-pilocarpina 6 semanas. Também descrevemos os procedimentos experimentais de implantação de eletrodo para vídeo e gravação de EEG e análise da frequência e duração das convulsões recorrentes crônicas. Finalmente, podemos discutir as possíveis razões por que os resultados esperados não são alcançados em cada caso. Isto fornece uma visão geral básica de epilepsia crônica em ratos e diretrizes para solução de problemas de modelagem. Acreditamos que este protocolo pode servir como uma base para modelos apropriados de epilepsia crônica e epileptogenesis.

Introdução

TLE é um do mais comum adquirida Epilepsias¹. Pessoas com epilepsia sofrer ataques recorrentes, como resultado de actividades neuronais anormais no cérebro^2,3. Dado que o TLE é muitas vezes intratável, é crucial entender os mecanismos básicos subjacentes ao desenvolvimento de epilepsia.

Modelos animais que podem recapitular as principais características da TLE humana podem oferecer melhor apreciação da fisiopatologia do TLE, permitindo-nos facilmente monitorar e manipular fatores críticos no epileptogenesis. Entre eles, SE induzida por chemoconvulsants tem sido amplamente utilizado^4,5. Ao contrário de outros modelos de epilepsia, tais como a estimulação elétrica que mostra sem esclerose hippocampal e robusto SRS^6,7,8, a injeção sistêmica de chemoconvulsants pode imitar a patogenia clínica de TLE humana, ou seja, lesão cerebral inicial, um período de latência e um epiléptico crônico estágio manifestando SRS^5,9,10. Portanto, esta técnica pode ser utilizada em vários estudos, explicando os mecanismos de uma lesão cerebral aguda, epileptogenesis ou supressão de apreensão. Além disso, alterações histopatológicas induzidas por chemoconvulsants são semelhantes aos observados em humano TLE, fornecendo uma justificativa adicional para uso de TLE modelos roedores^10,11,12. Notavelmente, danos estruturais, envolvendo o hipocampo foram reproduzidos consistentemente em ambos os modelos de ácido - e induzidas pela pilocarpina SE kainic. No entanto, em comparação com injeção de ácido kainic, o modelo da Pilocarpina pode produzir mais robusto SRS em ratos, que podem oferecer vantagens consideráveis para estudar epilepsia crônica quando considerando a ampla disponibilidade de rato transgénico linhas^{5, 13 , 14 , 15}. Além disso, progressão de convulsão após injeção de pilocarpina é geralmente mais rápida que o modelo de ácido kainic, fornecendo evidências adicionais para o uso eficaz de um modelo de pilocarpina de epilepsia.

Aqui, vamos demonstrar um método de SE induzir pela injeção i.p. de pilocarpina e através da realização de vídeo e monitoramento de EEG em epilepsia crônica.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Católica da Coreia e foram realizados em conformidade com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (NIH publicações n º 80-23).

1. SE indução

1. Compra de camundongos C57BL/6NHsd sexo masculino de 8 semanas de idade e pesar cada rato. Em seguida, use uma caneta para marcar as caudas de todos os mouses para facilitar a sua identificação durante a indução SE.
2. Calcular a quantidade de brometo de metilo de escopolamina (escopolamina; 2 mg/kg), Terbutalina hemisulfate (terbutaline; 2 mg/kg) e cloridrato de pilocarpina (Pilocarpina; 280 mg/kg) com base no peso do rato e adicione a solução salina (0,9% NaCl, 10 mL/kg) tornar-se soluções.
   Nota: Por exemplo, se o peso do rato é 25g, os seguintes montantes são aplicados: escopolamina e Terbutalina: 2 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 0,05 mg, solução salina: 10ml/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL, pilocarpina: 280 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 7 mg , Solução salina: 10ml/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL.
3. Carrega a escopolamina e terbutaline mistura em uma seringa de 1 mL com agulha 30 G. Injetar a solução intraperitonealmente em cada rato e em seguida, retornar os ratos de suas gaiolas. A 30 min após a administração de escopolamina e Terbutalina, injecte a solução de pilocarpina em cada rato (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 30G). Imediatamente após a injeção de pilocarpina, coloque os ratos em uma incubadora (28-30° C), para observação.
4. Monitore atentamente o comportamento dos ratos até SE é induzida. Se forem detectadas sistema límbicas motor convulsões que correspondem à fase 3 ou superior de acordo com a escala de Racine, registrar o tempo e monitorar os ratos para determinar se as convulsões ocorrem com maior frequência. Depois de contínuos ataques motor duram mais de 2 min, coloque o mouse em uma gaiola nova à temperatura ambiente e manter monitoramento para 3h determinar se suas crises convulsivas continuam e SE é induzida. Eutanásia nos ratos que não conseguiram entrar SE a cerca de 2 h após a injeção de pilocarpina.
   Nota: Escala do Racine; fase 1, boca e movimento facial; fase 2, cabeça balançando; fase 3, clonus do membro anterior; fase 4, criação com clonus do membro anterior; estágio 5, criação e caindo com membro anterior clonus¹⁶. Se o mouse não é transferido para a gaiola na temperatura de quarto imediatamente após a indução da SE, o mouse pode morrer devido à hipertermia.
5. Rescindir comportamentais agudas convulsões a 3 h após início SE injetando solução diazepam (i.p.; 10 mg/kg; seringa de 1 mL e agulha 30G). Fazer a solução de diazepam diluindo-se 5 mg/mL de diazepam em polioxilo 10% óleo de rícino hidrogenado 35 por adição de soro fisiológico (i.p.; 10 mL/kg; seringa de 1 mL e agulha 30G).
   Nota: solução de óleo de rícino polioxilo 10% 35 hidrogenado: 1 mL de solução de óleo de rícino hidrogenado 35 polioxilo + soro fisiológico 9 mL. Armazene a solução à temperatura ambiente. Por exemplo, se o peso do corpo do mouse é 25g, injetar 250 µ l de solução de diazepam: 50 diazepam de 5mg/mL µ l + rícino hidrogenado de 200 µ l 10% polioxilo 35 óleo solução = diazepam de 1 mg/mL 250 µ l.
6. Para os ratos de Souza, realizar uma injeção i.p. de mistura de hemisulfate de brometo de metilo e terbutaline a escopolamina (i.p.; ambos os 2 mg/kg, 10 mL/kg; seringa de 1 mL e agulha 30G). 30 min depois, injectar o soro intraperitonealmente (i.p.; 10 mL/kg; seringa de 1 mL e agulha 30G).
   Nota: Se o peso do corpo do mouse é 25g, injete 250 µ l de soro, em vez de pilocarpina.
7. Após a injeção de diazepam (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 30G), administre 1 mL de dextrose 5% por cada rato (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 26G).
   Nota: 1 mL de injeção de dextrose 5% fornece a fonte de energia e hidratação, o que pode aumentar a taxa de sobrevivência.
8. Durante a pós-cuidados na incubadora (28-30 ° C), limpe o excessivas secreções como saliva, lágrimas e fezes.
9. No 1º dia após a indução da SE, pesar os ratos e mantê-los na incubadora (28-30 ° C) por um dia extra. No dia 2, após a indução da SE, pesar os ratos e devolvê-los para sua gaiola em casa. Fornece comida úmida para facilitar sua recuperação.
   Nota: Neste experimento, a taxa de mortalidade para C57BL/6NHsd após a rescisão SE foi de 8,57% em média (3 fora de 35 ratos testados).
10. Medir o peso corporal dos animais diariamente até pós-pilocarpina 7 dias e injetar os ratos com 5% de dextrose (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 26G) quando o peso do corpo não aumentou. Pare de monitoramento de peso do corpo quando os ratos começam a recuperar o peso corporal e consumir comida úmida sem dificuldade em 2 dias após a injeção de pilocarpina.
    Nota: Se até 7 dias post SE não aumentar o peso do corpo de um rato, excluir o mouse do experimento e eutanásia pelo dióxido de carbono. Dependendo do plano de fundo do mouse, a morte pode ocorrer ocasionalmente; no entanto, no caso de C57BL/6NHsd, menos de 1% dos ratos morreu nesses experimentos. Com a sobrevivência de mais de 7 dias após a indução da SE, os ratos raramente morrem durante o período de latência.

2. a implantação cirurgia para monitoramento de vídeo-EEG

1. Prepare-se para executar a implantação de telemetria para monitorização de EEG ratos de 12 semanas (4 semanas após a indução SE).
   Nota: Tempo de implantação pode ser modificado dependendo os fins experimentais e as estirpes de rato.
2. Antes da cirurgia, anestesia o mouse com uma mistura (4:0.5) de cetamina (50mg/mL) e xilazina (23,3 mg/mL) solução dissolvida em soro fisiológico na dose de 2,5 µ l/g de massa corporal (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 26G). Monitorar a frequência respiratória e esforço respiratório do mouse em intervalos regulares (15 min de intervalo máximo) e avaliar a profundidade da anestesia através do reflexo de retirada de pedal.
3. Coloque o mouse em uma armação estereotáxica com barras de orelha e uma placa de mordida e aplique pomada de veterinário em ambos os olhos para evitar cegueira.
4. Para manter condições estéreis durante a cirurgia, barbear cirúrgicas sites usando uma lâmina de barbear. Tenha cuidado para evitar a contaminação da pele do campo cirúrgico. Após a depilação, desinfete a pele com solução de 70% de etanol e iodo.
   Nota: Cirurgia deve ser realizada de forma asséptica, usando luvas estéreis e máscaras, usando equipamento esterilizado e técnicas assépticas.
5. Depois de confirmar a profundidade da anestesia, fazer uma incisão da pele para expor a caveira. Faça dois buracos no crânio com uma broca anexada ao aparelho estereotáxica em coordenadas do Bregma no eixo ântero-posterior (AP): +0,1 mm, eixo mediolateral (ML): +0,1 mm (referência) e AP: −0.2 mm, ML: +0,22 mm (córtex parietal esquerdo)¹³.
   1. Limpe a pele com swaps de algodão embebido de PBS, seguido por solução de 70% de etanol e iodo. Faça uma incisão longitudinal no meio da cabeça com uma tesoura para expor o Lambda (o ponto onde se encontram o sagital e a sutura do lambdoid), o Bregma (o ponto de interseção da sutura coronal pela sutura sagital) e o local de destino.
   2. Identifica pontos anatômicos como Lambda e Bregma. Posicionar a broca no Bregma e anotar o X, Y coordenadas para este ponto.
   3. Usar um cérebro atlas livros ou publicado referências para determinar as coordenadas adequadas das regiões cerebrais para gravação de EEG. Em seguida, calcular as coordenadas para os parafusos (referência e gravação) usar as coordenadas de Bregma medido na etapa 2.5.2.
   4. Abaixe lentamente o bocado de broca para fazer um orifício de trépano, tendo o cuidado de evitar inserir o bocado de broca longe demais no ponto onde o crânio se torna mais fino.
6. Inserir o corpo do único canal sem fio transmissor de EEG por trás da nuca do pescoço por via subcutânea e coloque flexível leva perto do crânio.
7. Coloque um parafuso de aço inoxidável (2 mm de comprimento) em cada orifício de trépano com uma pinça e aperta-lo usando uma chave de fenda, rotação no sentido horário. Certifique-se que o parafuso é inserido não muito longe de fundo ajustando o grau de rotação do parafuso para evitar danos a dura-máter ou os tecidos do cérebro.
8. Tira o casaco de isolamento 2 mm da ponta dos fios e esticar o fio suficiente para arredondar o eixo do parafuso para uma boa conexão entre o fio e o parafuso. Ligue a ponta de referência para o parafuso frontal e a liderança de gravação para o parafuso no córtex parietal. Em seguida, aplique o cimento dental para fixar todo o conjunto no lugar sem expor as partes metálicas.
9. Depois de verificar que o cimento dental secou completamente por inspeção visual, suturar a pele e aplicar a pomada de mupirocina tópica. Coloque o mouse em uma incubadora de 30 ° C sozinho até que se recupere da cirurgia (cerca de 30 min). Em seguida, retorne o rato da gaiola em casa até o monitoramento de vídeo-EEG contínuo começa.
   Nota: Após a cirurgia, cada rato é injetado (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 30G) com 5 mg/kg de gentamicina (antibiótico) e 5 mg/kg de cetoprofeno (analgésicos). Os animais devem ser monitorizados até que eles se tornam totalmente ambulantes. Transmissor-implantado os ratos têm um período de recuperação de cerca de 1 semana.

3. vídeo e EEG monitoramento e análise

1. Coloque um rato em uma gaiola individual e a gaiola em cima das placas sem fio receptor onde a gaiola de Faraday é instalada para evitar a interrupção de sinais elétricos de quaisquer fontes, incluindo um computador, linhas de AC e receptores adjacentes.
   Nota: Consulte o manual fornecido pelo fabricante. Deve ter cuidado para evitar pontos cegos.
2. Registro da atividade elétrica usando o sistema sem fio de vídeo-EEG de telemetria.
   1. Abra o software para gravação de vídeo-EEG. Clique em "Hardware" e selecione "Editar configuração". Coincidir com o receptor e o transmissor implantado em cada rato. Clique em "Configuração de canal" e confirmar que todos os canais estão ativos. Clique em "Configuração de vídeo" para sincronizar o vídeo com os dados do EEG (resolução de 480 x 40 e taxa de quadros de 30,00).
      Nota: Instale uma câmera IP com alta sensibilidade se é fundamental para recolher as qualidades da boa imagem que podem identificar mudanças comportamentais sutis dos ratos à noite.
   2. Clique em "Setup" e "Configuração P3" para entrada informações de animais individuais, câmera correspondente e configuração do gráfico.
   3. Clique em "Aquisição" e "A/D taxa de amostragem" para taxas de amostragem de instalação. Clique em "nome do conjunto de dados" para designar cada experimento.
      Nota: Taxa de amostragem para EEG deve ser maior do que 500 Hz. devido o vídeo grande e o tamanho de dados de EEG, é recomendável que apenas 24h de dados são manipulados por sessão em vez de usar uma 2-semana-gravação contínua como um arquivo. Dados podem ser salvos separadamente em intervalos de 8 h ou 12 h em caso de falta de memória RAM.
   4. Ativar o transmissor com uma barra magnética e clique em "Iniciar aquisição" para coletar a gravação de vídeo-EEG. Monitore continuamente o rato pelo sistema de vídeo-EEG durante pelo menos 2 semanas.
      Nota: Para camundongos C57BL/6, SRS tende a ocorrer em clusters que última cerca de 5,2 dias e a duração do período livre de apreensão é cerca de 6,7 dias¹⁷.
3. Determine a frequência de apreensão e duração por inspeção manual, usando o software de análise.
   1. Marque a área mostrando SRS e exportar os dados para a análise estatística. Seja cauteloso para excluir artefatos de EEG que podem ser gerados por coçar a cabeça ou mascar; Estes podem ser removidos, verificando os dados de vídeo.
      Nota: SRS é definida como um início súbito de repetitiva epileptiforme picos de atividade (≥ 3 Hz) que persiste por mais de 10 s. convulsivos comportamentos podem ser frequentemente acompanhados com uma explosão de atividade de cravação. Convulsões não-convulsiva também podem demonstrar electrographic atividades cravação sem comportamentos convulsivos. Rescisão de apreensão é definido como ocorrendo quando os picos de fuzilamento voltar à atividade de linha de base.
   2. Para a análise da frequência de apreensão, divida o número total de casos SRS detectado durante as 2 semanas pelo número total de dias de gravação para cada animal.
   3. Para análise de duração de apreensão, medir o tempo desde o início até o fim do epileptiforme cravação atividades.
4. Após a gravação de vídeo-EEG, consertar o cérebro com paraformaldeído 4% por perfusão transcardial. Para anestesiar o mouse, injetar uma solução (4:0.5) da cetamina (50mg/mL) e xilazina (23,3 mg/mL) dissolvido em solução salina na dose de 10 µ l/g de massa corporal (i.p.; seringa de 1 mL e agulha 26G). Uma vez que o mouse é confirmado para ser profundamente anestesiada, execute a perfusão transcardial.
5. Antes de isolar o cérebro de rato, recupere o transmissor do mouse para reutilização após a limpeza.
   1. Remova o cimento dental ao redor os contatos usando fórceps.
   2. Mergulhe a ponta dos fios com cimento dental em 100% de acetona até o cimento dental é dissolvido.
   3. Remova contaminantes de tecido ao redor do transmissor, enxaguá-lo com água destilada.
   4. Enxágue o transmissor com etanol a 70% por 3 h e ar secá-la para o armazenamento. Imediatamente antes da próxima utilização, lave o parafuso e o transmissor com etanol a 70%, seguido por água destilada e colocá-los em solução salina.
      Nota: Deve ter cuidado para evitar cortar os fios flexíveis quando decapitar o mouse uma vez que, se os condutores flexíveis são muito curtos, o ruído na próxima implantação e gravação de vídeo-EEG pode aumentar.

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Resultados

SE bem sucedido pode induzir a morte celular hippocampal e SRS (Figura 1 e Figura 2). Nós denunciado comportamentais convulsões agudas por injeção de diazepam a 3 h após início SE e sacrificou os ratos 7 dias ou seis semanas mais tarde.

Para o monitoramento de vídeo-EEG, os ratos que receberam a cirurgia de implante em 4 semanas após SE, e casos SRS foram avalia...

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Discussão

Este trabalho descreve os procedimentos experimentais para a indução SE e a avaliação das convulsões crônicas.

Vários fatores podem afetar a indução SE bem sucedida. Acurada monitoramento comportamental, de acordo com a escala de Racine é fundamental para o desenvolvimento dos SRS. Cabeça balançando, clonus do membro anterior, criação e queda são as características comportamentais de convulsões agudas, desenvolvendo-se em fase SE^4,

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
Scopolamine methyl nitrate	Sigma	S2250	Make 10X stock
Terbutaline hemisulfate salt	Sigma	T2528	Make 10X stock
Pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Ketamine hydrochloride	Yuhan corporation
Xylazine hydrochloride	Bayer Korea
Diazepam	SAMJIN
Castor oil (Kolliphor EL)	Sigma	C5135	Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil
Saline	Daihan pharm. Co.
5% Dextrose	Daihan pharm. Co.
Iodine solution (Povidin)	Firson
vet ointment (Terramycin)	Pfizer
Blue Nylon	AILEE	NB617
Mupirocin (Bearoban)	Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
Ketoprofen	Samchundang Pharm. Co., Ltd		5 mg/kg
Gentamicin	Huons, Ltd.		5 mg/kg
1 mL syringe	Sung shim medial Co., Ltd.
26 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")
Razor blade	Dorco
Drill	Saeshin precision Co., Ltd.		207A, 35K (speed)
Telemetry video/EEG system	Data sciences International. Inc.	Version 5.20-SP6
Implantable transmitter	Data sciences International. Inc.	ETA-F10
Screw	Sungho Steel		M1.4, 2 mm length stainless steel
Vertex dental material	Dentimex
Acetone	Duksan pure chemicals Co., Ltd.		CAS 67-64-1
Paraformaldehyde (PFA)	millipore	1.04005.1000	4 %
Sucrose	Sigma	S9378	30 % solution in 0.01 M PBS
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Ethanol	EMD Millipore Co.	UN1170
xylene	Duksan pure chemicals Co., Ltd.	UN1307
Acetic acid glacial	Junsei chemical	31010-0350
FSC33 Clear	Leica biosystems		OCT compound for tissue freezing
DPX Mounting for histology	Sigma	6522
Forceps	Fine science tools	11002-12
Scissors	Solco biomedical	02-2445
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	E51070012