측 두 엽 간 질 및 뇌 파 마우스에 Radiotelemetry 시스템을 사용 하 여 모니터링 Pilocarpine 모델

요약

이 원고 조직의 pilocarpine 주입 상태 epilepticus를 유도 및 무선 원격 비디오 및 뇌 파 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에 자발적인 재발 성 발작을 모니터링 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 만성 간 질, epileptogenesis, 그리고 급성 발작의 pathophysiologic 메커니즘을 공부에 대 한 이용하실 수 있습니다.

초록

측 두 엽 간 질 (TLE) 성인에서 일반적인 신경학 적인 장애입니다. 만성 간 질의 변환 연구, pilocarpine 유도 상태 epilepticus (SE) 자발적인 재발 성 발작 (SRS) 정리를 자주 선택 됩니다. 여기 우리 pilocarpine의 복 (i.p.) 주입 및 무선 원격 비디오 및 뇌 파 (EEG) 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 만성 반복 발작의 모니터링에 의해 SE 유도의 프로토콜을 제시. 우리 pilocarpine 주입 후에 7 일 그리고 6 주 후 pilocarpine hippocampal 신경 손실 그들의 상관 관계 주의 필요로 하는 주목할 만한 행동 변화를 설명 했다. 우리는 또한 비디오 및 뇌 파 기록을 위한 전극 이식의 실험 절차 및 주파수의 분석 및 만성 재발 성 발작의 기간을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 가능한 이유 왜 예상된 결과 각 경우에 달성 하지 논의. 이 마우스 및 문제 해결에 대 한 지침에 만성 간 질 모델링의 기본적인 개요를 제공 합니다. 이 프로토콜은 만성 간 질 및 epileptogenesis의 적합 한 모델에 대 한 초기 계획으로 사용할 수 있습니다 생각 합니다.

서문

TLE 가장 일반적인 획득된 epilepsies¹중 하나입니다. 간 질을 가진 사람들 뇌^2,3에 비정상적인 신경 활동의 결과로 재발 성 발작을 경험합니다. TLE 자주 세공는, 간 질의 개발 기본 기본 메커니즘을 이해 하기 결정적 이다.

인간의 TLE의 주요 특징을 정리 할 수 있는 동물 모델의 TLE 이상, 우리가 쉽게 모니터링 하 고 epileptogenesis에 중요 한 요소를 조작 수 있도록 더 나은 감사를 제공할 수 있습니다. 그 중, chemoconvulsants 유도 SE 널리^4,5되었습니다. 다른 간 질 모델을 보여주는 hippocampal sclerosis 없고 강력한 SRS^6,7,의⁸, 전기 자극과 달리 chemoconvulsants의 조직의 주입 인간의 TLE의 임상 병을 모방 수 있습니다. 즉, 초기 뇌 손상, 잠재성 기간, 그리고 만성 간 질 무대 만들어 낸 SRS^5,,910. 따라서,이 기술은 급성 뇌 손상, epileptogenesis, 또는 발작 억제의 메커니즘을 설명 하는 다양 한 연구에 활용할 수 있습니다. 또한, histopathological 변경 chemoconvulsants에 의해 유도 된 인간의 TLE, TLE 설치류 모델^10,,1112의 사용에 대 한 추가 논리를 제공 본 그와 유사 하다. 특히, 해 마와 관련 된 구조적 손상 모두 kainic 산 및 pilocarpine-유도 SE 모델에 일관 되 게 재현 되어 있다. 그러나, kainic 산 주입에 비해 pilocarpine 모델 생산할 수 있는 쥐 유전자 변형 마우스 라인^5, 의 넓은 가용성을 고려할 때 만성 간 질을 공부에 대 한 상당한 이점을 제공할 수 있는 보다 강력한 SRS ^{13 , 14 , 15}. 게다가, 발작 진행 후 pilocarpine 주입은 일반적으로 보다 빠른 kainic 산 모델에서 간 질의 pilocarpine 모델의 효과적인 사용에 대 한 추가 증거를 제공 하.

여기, pilocarpine의 i.p. 주입 및 비디오 및 만성 간 질에서 뇌 파 모니터링을 수행 하 여 SE 유도 하는 방법을 설명 합니다.

프로토콜

모든 실험 절차 가톨릭 대학교의 윤리 위원회에 의해 승인 및 관리 및 실험 동물 사용 (NIH 간행물 번호 80-23)에 대 한 국가 학회 건강 가이드에 따라 실시 했다.

1. SE 유도

1. 8 주 오래 된 남성 C57BL/6NHsd 마우스를 구입 하 고 각 마우스 무게. 그런 다음 마커 펜을 사용 하 여 SE 유도 하는 동안 그들의 쉬운 id에 대 한 모든 쥐의 꼬리를 표시.
2. 마우스 무게에 따라 scopolamine 메 틸 브 로마 이드 (scopolamine; 2 mg/kg), terbutaline hemisulfate (terbutaline; 2 mg/kg), 및 pilocarpine 염 (pilocarpine; 280 mg/kg)의 양을 계산 하 고 식 염 수 (0.9 %NaCl, 10 mL/kg) 솔루션에 추가 합니다.
   참고: 예를 들어 마우스의 무게는 25 g, 다음 금액 적용 됩니다: Scopolamine와 terbutaline: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0.05 mg, 염 분: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0.25 mL, Pilocarpine: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg 염 분: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0.25 mL.
3. 30g 바늘 1 mL 주사기에 scopolamine와 terbutaline 혼합물을 로드 합니다. 각 마우스에 intraperitoneally 솔루션을 주입 하 고 그들의 감 금 소에는 마우스를 반환 합니다. Scopolamine와 terbutaline 관리 후 30 분 pilocarpine 솔루션 (i.p.; 1 mL 주사기 30 G 바늘) 각 마우스에 주사. Pilocarpine 주입 후 즉시 관찰에 대 한 인큐베이터 (28-30 ° C)에 쥐를 놓습니다.
4. SE 유도 될 때까지 조심 스럽게 쥐의 동작을 모니터링 합니다. 변 모터 발작 무대 라신의 규모에 따라 3 이상에 해당 하는 검색 되 면 시간을 기록 하 고 발작이 더 자주 발생 하는지를 확인 하려면 마우스를 모니터링 합니다. 지속적인 모터 발작 2 분 이상 지속, 일단 마우스 실내 온도에 새로운 장에 놓고 그들의 경련 발작 계속 SE 유발 여부를 결정 하는 3 h에 대 한 모니터링을 계속 합니다. 마우스 입력 하지 못한 안락사 pilocarpine 주입 후 약 2 시간에 SE.
   참고: 라신의 규모; 1 단계, 입, 얼굴 운동; 단계 2, 머리 끄 덕; 단계 3, forelimb clonus; 단계 4, forelimb clonus;와 양육 단계 5, 양육 및 forelimb clonus¹⁶. 마우스 SE 유도 후 실 온에서 감 금 소에 전송 되지 않습니다, 마우스는 고 열으로 인해 죽을 수 있다.
5. 다이아 제 팜 솔루션 (i.p., 10 mg/kg, 1 mL 주사기, 바늘 30 G)를 주입 하 여 SE 발병 후 3 h 행동 급성 발작을 종료 합니다. 염 분 (i.p., 10 mL/kg, 1 mL 주사기, 바늘 30 G)를 추가 하 여 10% polyoxyl 35 수 소화한 아주까리 기름에 다이아 제 팜 5 mg/mL를 diluting 하 여 다이아 제 팜 솔루션을 확인 합니다.
   참고: 10% polyoxyl 35 수 소화한 아주까리 기름 솔루션: 1 mL polyoxyl 35 수 소화한 아주까리 기름 솔루션 + 9 mL 염 분. 실 온에서 솔루션을 저장 합니다. 예를 들어 마우스 몸 무게 25 g 인 경우에, 주입의 다이아 제 팜 솔루션 250 µ L: 50 µ L 5 mg/mL 다이아 제 팜 + 200 µ L 10% polyoxyl 35 수 소화한 아주까리 기름 솔루션 = 250 µ L 1 mg/mL 다이아 제 팜.
6. 가짜 쥐에 대 한 수행 scopolamine 메 틸 브 로마 이드와 terbutaline hemisulfate 혼합물의 i.p. 주사 (i.p.; 두 2 mg/kg, 10 mL/kg; 1 mL 주사기 30 G 바늘). 30 분 나중에, intraperitoneally는 식 염 수를 주사 (i.p., 10 mL/kg, 1 mL 주사기, 바늘 30 G).
   참고: 경우 마우스 몸 무게는 25 g, 250 µ L pilocarpine 대신 식 염 수의 주입.
7. 다이아 제 팜 주사 (i.p.; 1 mL 주사기 30 G 바늘), 후 개별 마우스 (i.p.; 1 mL 주사기 26 G 바늘) 당 5% 포도 당 1 mL를 관리 합니다.
   참고: 5% 포도 당 주사의 1 mL 에너지 소스 및 생존 율을 증가 시킬 수 있는 수 분을 제공 합니다.
8. 인큐베이터 (28-30 ° C)에서 사후 관리 하는 동안 타 액, 눈물, 배설물 등 과도 한 분 비 물을 닦아.
9. SE 유도 후 1 일에서 쥐 무게 하 고 여분의 하루 동안 인큐베이터 (28-30 ° C)에서 그들을 유지. 하루 2, SE 유도 후, 무게를 쥐 고 케이지 그들의 가정 그들이 돌아갑니다. 그들의 회복을 촉진 하기 위하여 습 한 차를 제공 합니다.
   참고: 이 실험에서 SE 종단 후 C57BL/6NHsd에 대 한 사망 율 평균 (35 마우스 테스트의 개 3) 8.57% 이었다.
10. 7 일 후 pilocarpine까지 동물의 체중을 매일 측정 하 고 5% 포도 당 (i.p.; 1 mL 주사기 26 G 바늘)와 쥐를 주사 때 몸 무게 증가 하지. 몸 무게 모니터링 쥐 몸 무게를 회복 하 고 pilocarpine 주사 후 2 일에서 어려움 없이 촉촉한 차 소비를 시작할 때 중지 합니다.
    참고: 마우스의 몸 무게는 7 일 게시물 SE까지 증가 하지 않았다, 실험에서 마우스를 제외 하 고 이산화탄소로 안락사. 마우스의 배경에 따라 죽음 때때로 발생할 수 있습니다; 그러나, C57BL/6NHsd의 경우 쥐의 1% 미만이 실험에서 사망 했다. SE 유도 후 7 일 이상 생존, 생쥐는 거의 잠 기간 동안 죽을.

2. 이식 수술 비디오-뇌 파 모니터링

1. 뇌 파 모니터링을 위한 원격 주입을 수행 하기 위해 12 주 된 쥐 SE 유도 후 (4 주)을 준비 합니다.
   참고: 이식의 타이밍은 실험적인 목적 및 마우스 긴장에 따라 수정할 수 있습니다.
2. 수술 전에 마 취 제 (50 mg/mL) 및 xylazine (23.3 mg/mL) 솔루션 (i.p.; 1 mL 주사기 26 G 바늘) 2.5 µ L/g 몸 무게의 복용량에 식 염 수에 용 해의 혼합물 (4:0.5)로 마우스를 anesthetize. 정기적으로 (최대 15 분 간격) 호흡 속도 마우스의 호흡 노력을 모니터링 하 고 페달 철수 반사에 의해 마 취의 깊이 평가.
3. 귀 바와 물린 접시 stereotaxic 프레임에 마우스를 놓고 두 눈을 실명을 피하기 위해 수 의사 연 고를 적용 합니다.
4. 수술 하는 동안 멸 균 상태를 유지, 면도날을 사용 하 여 외과 사이트를 면도. 외과 분야의 모피 오염을 방지 하기 위해 주의 해야 합니다. 면도 후, 70% 에탄올과 요오드 솔루션으로 피부 소독.
   참고: 수술은 무 균 방식으로 입고 멸 균 장갑, 마스크, 소독된 장비 및 무 균 기술을 사용 하 여 수행 되어야 한다.
5. 마 취의 깊이 확인 한 후 두개골을 노출에 피부 절 개를 중간 확인 합니다. Anteroposterior 축 (AP)에 Bregma에서 좌표 stereotaxic 장치에 연결 된와 함께 두 개의 버 구멍 만들기: 0.1 m m, 입장 축 (ML): 0.1 m m (참조), 그리고 AP: −0.2 m m, ML: +0.22 mm (왼쪽된 정수 리 피 질)¹³.
   1. PBS-젖은 면 스왑, 70% 에탄올과 요오드 솔루션 다음으로 피부를 닦아냅니다. 람다 (은 화살 및 lambdoid 봉합이 만나는 지점), Bregma (화살 봉합 하 여 코로나 봉합의 교차 시점) 및 대상 위치를 폭로 위로 머리 중간 종 절 개를 확인 합니다.
   2. 람다 및 Bregma 같은 해부학 적 랜드마크를 식별 합니다. 드릴 비트 위치 Bregma와 메모는 X, Y 좌표이 포인트.
   3. 뇌 아틀라스도 서를 사용 하 여 또는 뇌 파 기록에 대 한 뇌 영역의 적절 한 좌표 결정에 대 한 참조를 출판. 그런 다음, 나사 (참조 및 기록)에 대 한 좌표 계산 단계 2.5.2에서 측정 Bregma 좌표를 사용 하 여.
   4. 천천히 낮은 두개골 얇은 되는 지점에서 너무 멀리 드릴 비트를 삽입 되지 않도록 주의 하면서 버 구멍을 드릴 비트.
6. 단일 채널의 몸을 피하는 목의 목 덜 미 뒤에 뇌 파 송신기 무선 및 유연한 배치 삽입 두개골 근처 리드.
7. 스테인리스 스틸 스크류 (길이 2mm) 각 버 구멍에 핀셋으로 놓고 시계 방향으로 회전 하 여 나사 드라이버를 사용 하 여 그것을 강화 합니다. 나사 경질 또는 뇌 조직에 손상을 방지 하기 위해 나사 회전의 정도 조정 하 여 멀리 너무 깊이 삽입 되지 않도록 다는 것을 확인 하십시오.
8. 단 열 코트 리드의 끝에서 2mm를 벗기십시오 고 철사와 나사 사이 좋은 연결을 위한 스크류 샤프트를 철사를 충분히 스트레칭. 전면 나사와 정수 리 피 질에 나사를 녹음 리드를 참조 리드를 연결 합니다. 그런 다음, 치과 시멘트 금속 부분을 노출 하지 않고 장소에 전체 어셈블리를 보안에 적용 됩니다.
9. 치과 시멘트는 완전히 육안 검사에 의해 건조를 확인 한 후 피부를 봉합 하 고 시사 mupirocin 연 고를 적용 합니다. 장소는 마우스는 30 ° C 배양 기에서 혼자 수술 (약 30 분)에서 복구 될 때까지. 그런 다음, 지속적인 비디오-뇌 파 모니터링 시작 될 때까지 마우스 홈 케이지에 반환 합니다.
   참고: 수술 후, 각 마우스 gentamicin (항생제)의 5 밀리 그램/kg과 ketoprofen (진통제)의 5 mg/kg (i.p.; 1 mL 주사기 30 G 바늘) 주입 됩니다. Ambulant 완전히 될 때까지 동물을 모니터링 해야 합니다. 송신기-이식 마우스 1 주 약의 복구 기간을가지고.

3. 비디오 및 뇌 파 모니터링 및 분석

1. 개별 장에 마우스를 놓고 패러데이 케이지 전기 신호는 컴퓨터, AC 라인, 및 인접 한 수신기를 포함 하 여 모든 소스에서 중단 되지 않도록 하려면 설치 되어 무선 수신기 접시 위에 케이지를 놓습니다.
   참고: 제조업체에서 제공한 설명서를 참조 하십시오. 맹점을 피하기 위해 주의 해야 합니다.
2. 무선 비디오-뇌 파 원격 측정 시스템을 사용 하 여 전기 활동을 기록 합니다.
   1. 비디오-뇌 파 기록 위한 소프트웨어를 엽니다. "하드웨어"를 클릭 하 고 "구성 편집"을 선택 합니다. 수신기와 송신기 각 마우스에 이식 일치. "채널 구성" 클릭 하 고 모든 채널은 활성 확인. 클릭 "비디오 구성" 뇌 파 데이터 (30.00의 40 x 480 및 프레임 속도의 해상도)와 비디오를 동기화 할.
      참고: 밤에는 쥐의 미묘한 행동 변화를 식별할 수 있는 좋은 이미지 품질을 수집 하는 것이 중요 하는 경우에 높은 감도와 IP 카메라를 설치 합니다.
   2. "설치"를 클릭 하 여 "P3 설치" 입력된 개별 동물 정보, 일치 카메라, 그리고 그래프 설정.
   3. 설치 샘플링 속도를 "수집", "A/D 샘플링 속도"를 클릭 하십시오. "데이터 집합 이름"을 클릭 하 여 각 실험을 지정.
      참고: 뇌 파에 대 한 샘플링 속도 높은 500 Hz. 보다 큰 비디오 및 뇌 파 데이터 크기를 해야 것이 좋습니다만 세션 당 처리 되는 데이터의 24 시간 연속 2 주 녹화를 사용 하 여 하나의 파일로 보다. RAM 메모리 부족의 경우 h 8 또는 12 h 간격 데이터를 별도로 저장할 수 있습니다.
   4. "수집 시작"을 클릭 하 여 자석 바 송신기 비디오-뇌 파 기록 수집 하. 적어도 2 주 동안 마우스 비디오-뇌 파 시스템에 의해 지속적으로 모니터링 합니다.
      참고: C57BL/6 마우스 SRS 마지막 약 5.2 일 및 발작-무료 기간의 기간 그건 약 6.7 일¹⁷클러스터에서 발생 하는 경향이 있다.
3. 수동 검사 분석 소프트웨어를 사용 하 여 발작 빈도 기간을 결정 합니다.
   1. SRS를 보여주는 영역을 표시 하 고 통계 분석을 위해 데이터를 내보냅니다. 머리를 긁 적 또는 씹는;에 의해 생성 될 수 있는 뇌 파 유물 제외 주의 이들은 비디오 데이터를 확인 하 여 제거할 수 있습니다.
      참고: SRS는 반복적인 epileptiform 급상승 하는 활동의 갑작스런 발병으로 정의 (≥ 3 Hz)는 이상 10 미 경련 동작 활동 급상승의 버스트 자주 동반 될 수에 대 한 지속. 비 경련 발작 또한 경련 동작 없이 electrographic 스파이크 활동을 설명할 수 있다. 압류 해지는 때 발사 스파이크 초기 활동에 돌려보낼 때 발생로 정의 됩니다.
   2. 발작 빈도의 분석에 대 한 각 개별 동물에 대 한 일의 총 수로 2 주 동안 탐지 SRS 경우의 총 수를 나눕니다.
   3. 발작 기간의 분석을 위해 활동 급상승 하는 epileptiform의 끝에 발병에서 시간을 측정 합니다.
4. 비디오-뇌 파 기록의 완성 후 transcardial 관류 하 여 두뇌 4 %paraformaldehyde 해결. 마우스를 anesthetize, 솔루션 (4:0.5) 케 타 민 (50 mg/mL) 및 xylazine (23.3 mg/mL)의 주입에 10 μ/g 몸 무게 (i.p.; 1 mL 주사기 26 G 바늘)의 복용량에 식 염 수에 녹. 마우스 깊은 취를 확인 transcardial 관류를 수행 합니다.
5. 쥐의 뇌를 분리 하기 전에 세 안 후 다시 마우스에서 송신기를 검색 합니다.
   1. 집게를 사용 하 여 리드 주위 치과 시멘트를 제거 합니다.
   2. 치과 시멘트 해산 될 때까지 100% 아세톤에 치과 시멘트와 리드의 끝에 담근 다.
   3. 증류수로 헹 궈 서 송신기 주위 조직 오염 물질을 제거 합니다.
   4. 린스 3 h 및 어 70% 에탄올과 송신기 스토리지에 대 한 그것을 건조. 다음 사용 직전 나사와 70% 에탄올, 증류수, 다음 송신기 린스 하 고 식 염 수에 넣어.
      참고: 유연한 리드 너무 짧은 경우, 마우스를 목이, 다음 주입 고 비디오-뇌 파 기록에서 노이즈를 증가 시킬 수 있습니다 때 유연한 와이어를 절단 하지 않도록 주의 해야 합니다.

결과

성공적인 SE hippocampal 세포 죽음과 SRS (그림 1 및 그림 2)을 유도할 수 있다. 우리는 SE 발병 후 3 h에 다이아 제 팜 주사에 의해 행동 급성 발작을 종료 하 고 7 일 또는 6 주 후 쥐를 희생.

비디오-뇌 파 모니터링, 받은 쥐 SE, 후 4 주에 수술 임 플 란 트 및 SRS의 경우 SE 발병 후 5-7 주에서 2 ...

토론

이 작품에서는 SE 유도 및 만성 발작의 평가 대 한 실험 절차를 설명합니다.

여러 가지 요인 성공적인 SE 유도 영향을 수 있습니다. 라신 규모에 따라 정확한 행동 모니터링 하는 것이 SRS의 개발에 대 한 중요 합니다. 머리를 끄 덕, forelimb clonus, 양육, 그리고 떨어지는 하는 행동의 SE 단계^4,16으로 급성 발작. 일단 첫 번째 모터 발작 감?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
Scopolamine methyl nitrate	Sigma	S2250	Make 10X stock
Terbutaline hemisulfate salt	Sigma	T2528	Make 10X stock
Pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Intensive care unit	Daejong instrument industry Co., Ltd.		28~30℃
Ketamine hydrochloride	Yuhan corporation
Xylazine hydrochloride	Bayer Korea
Diazepam	SAMJIN
Castor oil (Kolliphor EL)	Sigma	C5135	Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil
Saline	Daihan pharm. Co.
5% Dextrose	Daihan pharm. Co.
Iodine solution (Povidin)	Firson
vet ointment (Terramycin)	Pfizer
Blue Nylon	AILEE	NB617
Mupirocin (Bearoban)	Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
Ketoprofen	Samchundang Pharm. Co., Ltd		5 mg/kg
Gentamicin	Huons, Ltd.		5 mg/kg
1 mL syringe	Sung shim medial Co., Ltd.
26 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")
Razor blade	Dorco
Drill	Saeshin precision Co., Ltd.		207A, 35K (speed)
Telemetry video/EEG system	Data sciences International. Inc.	Version 5.20-SP6
Implantable transmitter	Data sciences International. Inc.	ETA-F10
Screw	Sungho Steel		M1.4, 2 mm length stainless steel
Vertex dental material	Dentimex
Acetone	Duksan pure chemicals Co., Ltd.		CAS 67-64-1
Paraformaldehyde (PFA)	millipore	1.04005.1000	4 %
Sucrose	Sigma	S9378	30 % solution in 0.01 M PBS
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Ethanol	EMD Millipore Co.	UN1170
xylene	Duksan pure chemicals Co., Ltd.	UN1307
Acetic acid glacial	Junsei chemical	31010-0350
FSC33 Clear	Leica biosystems		OCT compound for tissue freezing
DPX Mounting for histology	Sigma	6522
Forceps	Fine science tools	11002-12
Scissors	Solco biomedical	02-2445
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	E51070012