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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El protocolo aquí describe las interacciones de la proteína de canal de iones hEAG1 purificada con la pequeña molécula lipídica ligando fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2). La medición demuestra que BLI podría ser un método potencial para la detección de iones de molécula pequeña novela canal ligando.

Resumen

La bio-capa interferometría (BLI) es una herramienta valiosa para medir proteínas y las interacciones proteína-pequeña molécula. Aquí, describimos en primer lugar a la aplicación de esta técnica novedosa etiqueta-libre para el estudio de la interacción de humanos EAG1 proteínas de canal (hEAG1) con la molécula pequeña PIP2. canal de hEAG1 ha sido reconocido como potencial diana terapéutica debido a su sobreexpresión aberrante en cánceres y algunas mutaciones de ganancia de función implicados en algunos tipos de enfermedades neurológicas. Proteínas de canal hEAG1 de un sistema de expresión estable mamíferos purificadas y mide la interacción con PIP2 de BLI. La medida acertada de la cinética de unión entre la proteína hEAG1 y PIP2 demuestra que el ensayo BLI es un enfoque de alto rendimiento potencial utilizado para la detección del ligando molécula pequeña novela en farmacología de canales de iones.

Introducción

Dirigidos a las proteínas de canal de superficie accesible ion célula con moléculas pequeñas ofrece un enorme potencial para la detección del ligando y drogas biológicas descubrimiento1,2,3. Por lo tanto, se necesita una herramienta adecuada para el estudio de la interacción entre el canal de iones y moléculas pequeñas y su función correspondiente. La grabación de patch-clamp se ha demostrado ser una técnica única e insustituible en el análisis funcional del canal de iones. Sin embargo, determinar si las moléculas pequeñas de destino directamente canales iónicos requieren otras tecnologías. Tradicionalmente, el ensayo de unión de ligando radiactivo fue utilizado para observar la cinética de unión entre la molécula pequeña y de su proteína de canal iónico Diana. Sin embargo, el uso de esta técnica es limitado debido a su requisito de etiquetado radiactivo y detección. Por otra parte, el paso necesario para etiquetar el ligando pequeño en el estudio impide su uso en muchos tipos de canales iónicos sin ligando específico conocido. Algunas técnicas de etiqueta-libre como NMR espectroscopia, microescala thermophoresis (MST)4 y difracción de rayos x, resonancia de plasmón superficial (SPR) se han utilizado para medir las interacciones de la molécula de proteína pequeña. Pero este tipo de análisis generalmente no puede proporcionar suficiente información debido a la dificultad para obtener la proteína de larga duración, baja resolución de dinámicas, bajo rendimiento y alto costo5. En contraste con estas técnicas, interferometría de la bio-capa (BLI) está emergiendo como una nueva metodología de etiqueta-libre para superar estos inconvenientes para la detección de interacciones proteína-pequeña molécula por inmovilización de una pequeña cantidad de muestra de proteínas en las superficies de biosensor y medir el cambio óptico señales6,7. Como una prometedora plataforma de biosensores, técnica BLI ya se realiza para observar la interacción de moléculas pequeñas con agua natural proteínas solubles como un anticuerpo monoclonal humano CR80208 y el procedimiento de análisis detallado ha sido reportado en un anterior artículo9. Aunque se ha reconocido la importancia de la proteína de canal iónico para el nuevo descubrimiento de dianas terapéuticas, no se ha descrito ion canal proteína pequeña molécula interacción ensayo basado en BLI.

El ser humano canales Ether à go-go (hEAG1) se expresan en varios tipos de células de cáncer y el sistema nervioso central que se convierte en el canal un blanco terapéutico potencial de muchos cánceres y trastornos neuronales10,11, 12,13,14. El estudio electrofisiológico en nuestro laboratorio ha confirmado el efecto inhibitorio del fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) en hEAG1 canal15. En base a nuestros resultados, prueba PIP2 directa interacción con la hEAG1 mediante la técnica BLI puede ser como un modelo para otros tipos de interacción compuestos de proteína pequeña molécula de canal de iones especialmente para esos canales falta ligandos específicos. Según las instrucciones del ensayo BLI, preparamos biotinilado hEAG1 proteínas y les inmovilizada en la superficie de estreptavidina (SA) consejos de biosensor siguieron por interacción a las soluciones de2 PIP para observar su unión directa entre el proteínas y los lípidos. Después de que el accesorio de PIP2 a la superficie revestida de hEAG1 proteína, el espesor de la capa en la superficie aumenta, que correlaciona la cambio espectral directamente y se pueden medir en tiempo real de16. La cinética de Unión puede ser determinada debido a un cambio positivo en el paso de la asociación y un cambio negativo en el paso de la disociación. Según este principio, purificado de la proteína de canal de ion hEAG1 funcional del sistema de expresión estable HEK-239T utilizando el método de purificación de la afinidad para mantener el estado funcional en vitro , luego medir la cinética de unión de concentración diferentes PIP2y rindió unas semblable datos cinéticos como se observa en las mediciones electrofisiológicas15. La estrecha correspondencia entre los resultados de la BLI y mediciones electrofisiológicas demuestran por primera vez la conveniencia de BLI como una herramienta analítica adecuada para la interacción de la proteína pequeña molécula ion canal membrana.

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Protocolo

Nota: La línea de células HEK-293T continuamente expresan la proteína de canal hEAG1 tagged bandera es construida por la transferencia de un plásmido lentivirales pCDH que contiene la secuencia de ADN de hEAG1 con una bandera en el C-terminal distal en células HEK-293T seguido por el resistente a la puromicina selección como describió anteriormente15.

1. afinidad purificación de la proteína de canal hEAG1 tagged bandera de células HEK-293T

  1. Descongelar las células estable expresan canales de hEAG1 de nitrógeno líquido en el agua tibia (37 ° C) rápidamente. Las células (5 x 106 congelado células) de la semilla en un plato de 10 cm. Crecer la célula durante la noche modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) medio suplementado con 8 mL 10% suero fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina, 100 estreptomicina μg/mL, 4 mM L-glutamina y cambiar el medio al día siguiente.
  2. Comprobar la fluorescencia de GFP de estas células HEK-293T mediante un microscopio de fluorescencia para asegurarse de que el alto porcentaje de células estable express hEAG1 canales en el sistema de cultivo. Trypsinize exponencialmente el crecimiento células con 1 mL de tripsina 0.25% durante 1 min a temperatura ambiente y thenadd 2 mL de líquido que contiene suero para terminar la digestión. Transferir 400 μL de la suspensión celular a un plato de 15 cm que contiene 15 mL de medio DMEM completo. Preparar cuatro platos de 15 cm en total.
  3. Cosecha estas células después de 2 – 3 días de la cultura cuando las células alcanzan alrededor del 90% confluencia.
    1. Retire el medio de crecimiento de las células y lavar dos veces con 4 mL de tampón fosfato salino (1 x PBS, pH = 7,4).
    2. Descartar el PBS después de lavarse.
    3. Raspar las células en 2 mL 1 x PBS para cada plato utilizando células raspar y transferencia de las células raspadas con 1 mL pipetear en un tubo de 15 mL.
    4. Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 420 x g a 4 ° C.
    5. Decante y descarte el sobrenadante.
    6. Resuspender el precipitado de células en total 4 mL de tampón de lisis (10 mM HEPES, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, inhibidor de la proteasa completa contenido) por 30 min en hielo y vórtice completamente lisado cada 10 minutos.
    7. Centrifugar las células lisado por 10 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    8. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 5 mL y mantenerlo en hielo para su uso inmediato.
  4. Preparar la resina de afinidad M2 de anti-FLAG.
    1. Suspender completamente la resina (suministrada como una suspensión del 50% en buffer de tienda) por inversión suave para asegurarse de que la botella de gel de afinidad de M2 de anti-FLAG es una suspensión uniforme de perlas de gel.
    2. Inmediatamente transferir 400 μL de la suspensión a un tubo de 1,5 mL refrigerado.
    3. Centrifugue la suspensión de 30 s a 8, 000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante con cuidado para vaciar el búfer de la tienda.
    4. Añadir 500 μL 1 x PBS a la resina y suspender el sedimento con pipeta de 1 mL. Luego Centrifugue la suspensión de 30 s a 8, 000 x g a 4 º C y descartar el PBS sobrenadante cuidadosamente. Repita estos paso de lavado para borrar el búfer almacenado.
  5. Añadir 500 sobrenadante de extracto de proteína μL en paso 1.3.8 para la pelotilla de resina a suspender el sedimento y transferir la suspensión a un tubo de 5 mL refrigerado nuevo. Repita este paso otra vez para asegurarse de que no hay perlas de gel de izquierda. Añadir el extracto de proteína de izquierda a la mezcla.
  6. Incubar la mezcla durante la noche en un agitador a 8 rpm a 4 ° C para capturar a la proteína de la fusión de la bandera.
  7. Centrifugar la mezcla después de 12 h de incubación de 10 min a 1, 000 x g a 4 ° C.
  8. Deseche el sobrenadante y lavar el precipitado tres veces con 500 μL de PBS 1 x. Manténgalo en hielo para su uso inmediato.
  9. Proteína de elución la bandera hEAG1 con 3 x péptido de bandera.
    1. Preparar la solución de elución de bandera X 3. Disolver 3 péptido X bandera en solución 500 μL (0.5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 7.5) a una concentración de 8 μg/μL.
    2. Añada 10 μL 3 x solución de elución de bandera a 390 μL de PBS a una solución de concentración final de 200 ng/μL.
    3. Añadir 400 μL de solución de elución de bandera de 3 x a las perlas de gel preparadas a paso 1.8.
    4. Incubar la muestra a la coctelera por 8 rpm por 2 h a 4 ° C.
    5. Centrifugue la resina durante 30 s a 8, 000 x g.
    6. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo 1,5 mL y almacenar a 4 ° C para uso inmediato.

2. concentración análisis y confirmación de bandera purificada fusión hEAG1 por Kit de ensayo de proteína BCA y Western Blotting

  1. Determinar la concentración de la proteína purificada mediante el kit de ensayo de proteína BCA según instrucciones del fabricante.
  2. Utilice 30 μL muestra occidental para confirmar que la proteína de interés había sido purificada mediante un anticuerpo de anti-FLAG como descrito previamente15.

3. etiquetado de la proteína purificada de la canal con biotina para el ensayo BLI

  1. Prepare 5 mg/mL solución biotina en PBS. Para cada prueba (dos biosensores), añadir un exceso molar 3-fold de biotina a 20 μg purificado proteína para lograr un preferible Biotinilación de N-terminal de la proteína purificada en PBS.
  2. Incubar la muestra en la oscuridad en hielo durante al menos 30 minutos.
  3. Preparar el tampón de dilución (SD): PBS con 0,02% polisorbato 20 y 0.1% albúmina de suero bovino (BSA, pH 7,4).
  4. Realizar ultrafiltración para cambiar el búfer de la proteína purificada de la canal al buffer de SD. Quitar a la biotina usando dispositivo de ultrafiltración con corte de peso molecular de 30 kDa, agregando el almacenador intermediario de la SD y centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
  5. El ultrafiltrado Retire el tubo de centrífuga de dispositivo de ultrafiltración, añadir tampón de SD de 200 μL en el dispositivo de filtración y centrifugación de la muestra a 12.000 x g, durante 10 min a 4° C. Repetir esta operación al menos tres veces.
  6. Para recoger el búfer de intercambio muestra, invierte introducir la filtro en un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 2.000 x g, 5 min a 4 ° C. Mantener la muestra en hielo para su uso inmediato.

4. elaboración de PIP2 solución para análisis de

  1. Preparar la solución madre de PIP2 (1 mM) en desionizada H2O por sonicando durante 30 min sobre hielo como se describió anteriormente17. Almacenar la solución en frascos de cristal a-20 ° C y diluir a concentraciones finales inmediatamente antes de los experimentos con un vórtex vigoroso.

5. BLI ensayo

  1. Encienda el equipo y Compruebe la ventana de "estado de instrumento" para confirmar que la máquina está en estado "listo" Precaliente el equipo por lo menos 30 minutos antes del estudio BLI.
  2. Asegúrese de que se cierre la puerta del instrumento antes de abrir el software de adquisición de datos y elija el "experimento de cinética de nuevo" en el Asistente de experimento.
  3. Definir los pozos para ser utilizado en la placa de 96 pocillos por clic derecho elegir tampón, carga y muestra. Para los pozos de la muestra, la unidad de concentración de proteína de hEAG1 de la fusión de bandera biotinilado se debe poner como molar (10 μg, 0.09 μM).
  4. Definir los pasos de análisis incluyendo la línea de base, carga, asociación y disociación. Elija un paso de análisis y haga doble clic en la columna respectiva. Un duplicado de la definición de análisis preparado para sensores de control. Ajuste las rpm como 1.000. Elegir 1 min para el paso de la línea de base y 5 – 10 min por carga, la asociación y la disociación, respectivamente. Realice la prueba a temperatura ambiente (alrededor de 24 ° C).
    Nota: Existen dos procedimientos principales: la proteína de canal biotinilado a los sensores de carga y análisis de la interacción con los compuestos de pequeñas moléculas. Puede ser procedidos de forma continua (línea de base, carga, línea de base, asociación y disociación). Alternativamente, puede ser procedidos por separado para evitar la pérdida de los compuestos de prueba cuando la carga primera parte fracasada.
  5. Haga clic en las columnas que contienen los sensores y haga clic en el "relleno" para indicar las ubicaciones de los sensores en la bandeja del sensor.
  6. Revisar pasos todo planeados para comprobar errores y volver a corregirlo.
  7. Establecer la ubicación de los archivos de datos y haga clic en "Go" para empezar el ensayo.
    Nota: Los sensores necesitan prewetted durante al menos 10 minutos en buffer de SD, si este paso se ha hecho, entonces debe omitirse el ajuste "Retrasa inicio de experimento". Si no, establecer una demora s 600 antes de prewetting los sensores.
  8. Poner una placa de 96 pocillos negra en la parte inferior de la bandeja e inserte la esquina A1 de la placa en la muesca en la bandeja de la placa de asiento. Para que los pozos a los sensores de carga, 200 μL de tampón de ensayo por pozo añadir en 2 pozos en columna A y 2 pozos en fila B de la placa de 96 pocillos.
  9. Preparar otra placa de 96 pozos negra como la placa de la muestra y llenar los pozos con tampón de SD de 200 μL en fila B como control o biotinilado hEAG1 solución de proteína (10 μg) en columna A asignado durante la programación en el paso 5.3.
    Nota: Evitar la introducción de burbujas.
  10. Abra la puerta del instrumento e Inserte la bandeja de sensor y la placa de la muestra en el soporte de la placa izquierda y derecha, respectivamente. Compruebe que el sensor de la bandeja y muestra la placa estén colocados correctamente basado en la forma del sostenedor de la placa izquierda y el marcador de "A1" en la esquina superior derecha del sostenedor de la placa derecha. Cierre la puerta y empezar el ensayo.

6. Análisis de datos

  1. Abra el software de análisis de datos y la carpeta que contiene los datos del ensayo de carga. Haga clic en "Procesar" para entrar en el interfaz de menú de proceso y podemos ver las curvas cinéticas crudas coloridas.
  2. Bajo paso 1: "Selección de datos", haga clic en "Seleccionar Sensor". En el "Sensor bandeja #1", haga clic en los pozos de sensor sólo humedecido con tampón de SD y haga clic derecho a "Cambiar el tipo de Sensor" a "Sensor de referencia". En el ' mapa de la placa de muestra ", designar a los todos los pozos de la Unión no específica y haga clic a"Cambiar bien el tipo"a" referencia".
  3. Marque en el cuadro antes de "Sustracción" del paso 2 y punto de "Doble referencia".
  4. En el paso 3: "alinear Y eje, seleccione"Instantánea"como el paso de la alineación. Para "Rango de tiempo", entre los 10 ultimos s de esa línea base (es decir, de: 0.1 a: 59.8).
  5. En el paso 4: "Paso la corrección", seleccione "alinea a línea de base" para minimizar los cambios de la señal entre las medidas de asociación y disociación.
  6. En el paso 5: "Proceso", seleccionar la función filtra Savitzky-Golay en la mayoría de los casos y proceder a "Datos del proceso".
  7. Guardar datos en bruto para su posterior análisis de datos con otro software en el paso 7: "Guardar resultados".
  8. Haga clic en "Análisis | Ajuste de curvas".
    1. "Paso a analizar", elija "Asociación | Disociación". «Modelo», seleccione 1:1.
      Nota: elegimos el modelo 1:1 porque montar bien en los datos originales y evitar la posibilidad de sobre montaje bajo 1 / 2 o 2:1 modelo debido a su alto libertad. Pero otras opciones están disponibles aquí y pueden ser convenientemente elegidas para otros análisis de montaje para los modelos de enlace diferentes de analito.
    2. "Conexión", seleccione Global (completo). "Group By", seleccione "Color". Seleccione "Rmax disociados por Sensor" que permite el ajuste independiente de la respuesta de la señal máximo (Rmáx).
    3. Haga clic en "Forma curvas!" para iniciar el análisis de regresión no lineal. Ecuación de Hill y función exponencial solo fueron utilizados en nuestro estudio.
    4. Haga clic en "exportar datos | Guardar el informe"para guardar el ajuste de resultados. O haga clic en "exportar datos | Exportar los resultados de ajuste"para guardar los datos en bruto para más gráficas y análisis de datos con otro software.

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Resultados

Purifica la proteína de canal hEAG1 de bandera la fusión de hEAG1 sobreexpresado estable de células HEK-293T. La función de esta proteína de fusión se ha demostrado mediante el método de patch-clamp y la calidad y la especificidad de la proteína purificada se confirman por Western blot (figura 1). La proteína purificada de la canal es biotinilado para llevar a cabo un análisis de la interacción con los lípidos (PIP2) mediante el ensayo ...

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Discusión

Canales iónicos de membrana han sido verificados como las principales dianas terapéuticas de más del 13% de conocidos medicamentos para el tratamiento de una variedad de enfermedades humanas, incluyendo desórdenes cardiovasculares y neurológicos18. Abrazadera del remiendo de grabación, el estándar de oro para la medición funcional de canales de iones con moléculas pequeñas, ha sido ampliamente utilizado para ligandos de canales de iones de detección. Sin embargo, estos enfoques electrof...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el centro de Bio-identificación y la SJTU fondo transversales de investigación en medicina, ingeniería (YG2016QN66), Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31271217) y nacionales básicas de investigación programa de China (2014CB910304).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/High Glucose MediumHyCloneSH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x)HyCloneSH30256.01
Fetal Bovine SerumGibco10270
Penicillin/StreptomycinGibco1697550
Cell Culture DishCorning430599150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 SubstituteAmrescoE109
Sodium chlorideBBI Life SciencesA610476
Potassium chlorideBBI Life SciencesA610440
Bovine Serum AlbuminBBI Life SciencesA600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan MonolaurateBBI Life SciencesA600560
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
3x FLAG peptideSigmaF4799
Octet-RED96Pall/FortéBio30-5048
Data Acquisition softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Data Analysis softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Biosensor/StreptavidinPall/FortéBio18-5019
Microtiter plateGreiner Bio-one655209
Sulfo-NHS-LC-LC-BiotinThermoFisher21338
Centrifugal MachineThermoFisher75004250
PageRuler Prestained Protein LadderThermoScientific318120
Ultrafiltration deviceMILLIPOREUFC503008NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)SigmaP9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibodySigmaF18041:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20051:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotimeP0010
Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04693159001
Amersham Imager 600 Imaging SystemGE Healthcare Bio-Sciences
Western blot systemBIO-RAD

Referencias

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