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Resumo

O protocolo aqui descreve as interações da proteína de canal de íon hEAG1 purificado com a pequena molécula lipídica ligante fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2). A medida demonstra que BLI poderia ser um método potencial para rastreio de ligante de canal novela pequena molécula íon.

Resumo

O ensaio de interferometria (BLI) bio-camada é uma ferramenta valiosa para a medição da proteína-proteína e interações da proteína-pequena molécula. Aqui, descrevemos primeiro a aplicação desta técnica romance livre de rótulo para estudar a interação de EAG1 humano proteínas de canal (hEAG1) com a pequena molécula PIP2. hEAG1 canal tem sido reconhecida como potencial alvo terapêutico por causa de sua superexpressão aberrante em cânceres e algumas mutações de ganho-de-função envolvida em alguns tipos de doenças neurológicas. Nós purificada proteínas de canal hEAG1 de um sistema de expressão estável mamíferos e medido a interação com PIP2 por BLI. A medida bem sucedida da cinética de ligação entre a proteína hEAG1 e PIP2 demonstra que o ensaio BLI é uma abordagem de alto rendimento potencial usada para a seleção de romance pequeno-molécula ligante em farmacologia do canal de íon.

Introdução

Como alvo as proteínas de canal de íon superfície acessível de célula com pequenas moléculas oferece um enorme potencial para a triagem de ligante e descoberta de drogas biológicas a1,2,3. Assim, um instrumento adequado é necessário para estudar a interação entre o canal iônico e pequenas moléculas e sua função correspondente. A gravação da remendo-braçadeira tem demonstrada para ser uma técnica única e insubstituível em ensaio funcional de canal de íon. No entanto, determinar se as pequenas moléculas alvo diretamente canais iônicos exigir outras tecnologias. Tradicionalmente, o ensaio de ligação do ligante radioativo foi usado para observar a cinética de ligação entre pequenas moléculas e sua proteína de canal de íon do alvo. No entanto, o uso desta técnica é limitado por causa de sua exigência em etiquetar radioativo e deteção. Além disso, a etapa pré-requisito para rotular o ligante pequeno no estudo impede seu uso em muitos tipos de canais iônicos sem ligante específico conhecido. Algumas técnicas de etiqueta livre tais como espectroscopia NMR, difração de raios x, microescala thermophoresis (MST)4 e ressonância de plasmon de superfície (SPR) tem sido usadas para medir as interações da proteína-pequena molécula. Mas esses tipos de ensaios geralmente não podem fornecer informações suficientes por causa da dificuldade para obter a proteína completo, baixa resolução de dinâmica, baixa taxa de transferência e de alto custo5. Em contraste com estas técnicas, bio-camada interferometria (BLI) está emergindo como uma metodologia romance livre de rótulo para superar estas desvantagens para detecção de interações proteína-pequena molécula por imobilizando um pequenas quantidades de amostra de proteína nas superfícies das Biosensor e medir a mudança da ótica sinais6,7. Como uma plataforma de biosensor promissor, técnica BLI já é realizada para observar a interação de moléculas pequenas com água natural proteínas solúveis como um anticorpo monoclonal humano CR80208 e o procedimento de ensaio detalhado tem sido relatado em uma anterior artigo9. Embora o papel fundamental da proteína de canal de íon para descoberta de novos alvos terapêuticos tem sido reconhecido, o ensaio de interação molécula de proteína-pequeno de canal íon baseado em BLI não foi descrito.

O ser humano canais éter à go-go (hEAG1) são expressos em vários tipos de células cancerosas e sistema nervoso central, que faz com que o canal um potencial alvo terapêutico de muitos cancros e distúrbios neuronal10,11, 12,13,14. O estudo eletrofisiológico em nosso laboratório confirmou o efeito inibitório de fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2) do hEAG1 canal15. Com base em nossos resultados, teste PIP2 diretamente a interação com o hEAG1, usando a técnica BLI pode ser como um modelo para outros tipos de interação composto de íon canal molécula de proteína-pequeno especialmente para esses canais sem ligantes específicos. De acordo com as instruções de ensaio BLI, estamos preparados biotinilado hEAG1 proteínas e imobilizado-los na superfície do streptavidin (SA) dicas biosensor seguiram de interação-os para soluções de2 PIP para observar sua vinculação direta entre o proteínas e os lipídios. Após a fixação do PIP2 para hEAG1 a superfície revestida de proteína, a espessura da camada na superfície aumenta, que diretamente correlaciona o deslocamento espectral e pode ser medido em tempo real16. A cinética de ligação pode ser determinada devido a uma mudança positiva na etapa de associação e uma mudança negativa na etapa da dissociação. De acordo com este princípio, nós purificado da proteína de canal de íon hEAG1 funcional de HEK-239T expressão estável sistema usando o método de purificação de afinidade para manter o estado funcional in vitro , em seguida, medido a cinética de ligação de concentração diferente PIP2e rendeu um semblable dados cinéticos, como observado em medidas eletrofisiológicas15. A estreita correspondência entre os resultados do BLI e medições eletrofisiológicas demonstram pela primeira vez a adequação do BLI como uma ferramenta analítica adequada para interação de molécula de proteína-pequeno membrana do canal de íon.

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Protocolo

Nota: A linha de celular HEK-293T continuamente expressando a proteína de canal com a tag bandeira hEAG1 é construída por transfecting um plasmídeo Lentivirus pCDH contendo a sequência de DNA de hEAG1 com uma bandeira no C-terminal distal em células HEK-293T seguido o resistente a puromicina seleção conforme descrito anteriormente15.

1. afinidade purificação da proteína de canal hEAG1 bandeira-tag de células HEK-293T

  1. Descongele as células expressando estàvel hEAG1 canais de nitrogênio líquido na água quente (37 ° C) rapidamente. As células (cerca de 5 x 106 células de congelados) as sementes em um prato de 10 cm. Crescer a célula pernoite no modificado da águia de Dulbecco (DMEM) meio suplementado com 8 mL, 10% de soro bovino fetal (FBS) 100 penicilina unidades/mL, 100 estreptomicina μg/mL, 4 mM L-glutamina e mudou o meio, no dia seguinte.
  2. Verificar a fluorescência de GFP dessas células HEK-293T usando um microscópio fluorescente para certificar-se que a elevada percentagem de células estàvel express hEAG1 canais no sistema de cultivo. Trypsinize exponencialmente crescentes células com 1 mL de tripsina 0,25% por 1 min em temperatura ambiente e thenadd 2 mL de soro contendo líquido de cultura para finalizar a digestão. Transferência de 400 μL de suspensão de células para um prato de 15 cm, contendo 15 mL de meio DMEM completo. Prepare quatro pratos de 15 cm no total.
  3. Após 2 – 3 dias cultura quando as células chegam a cerca de 90% da colheita dessas células confluência.
    1. Remover o meio de crescimento das células e lavá-los duas vezes com 4 mL de tampão fosfato salino (1X PBS, pH = 7,4).
    2. Descarte o PBS após a lavagem.
    3. Raspe as células em 2 mL 1X PBS para cada prato usando raspagem de célula e transferência das células raspadas com 1ml Pipetar para um tubo de 15 mL.
    4. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 5 min à 420 x g a 4 ° C.
    5. Decantar e descartar o sobrenadante.
    6. Resuspenda o pellet de células no total 4 mL de tampão de lise (10 mM HEPES, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, inibidor de protease completa contidos) por 30 min no gelo e o vórtice completamente o lisado cada 10 min.
    7. Centrifugue a célula lisada por 10 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    8. Transferir o sobrenadante para um tubo de 5 mL e mantê-lo em gelo para uso imediato.
  4. Prepare a resina de afinidade do anti-FLAG M2.
    1. Suspenda cuidadosamente a resina (fornecida como uma suspensão de 50% na reserva de loja) gentilmente por inversão para certificar-se de que o frasco do gel de afinidade M2 anti-FLAG é uma suspensão uniforme dos grânulos do gel.
    2. Imediatamente transfira 400 μL de suspensão para um tubo de refrigerados 1,5 mL.
    3. Centrifugar a suspensão por 30 s em 8, 000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante cuidadosamente para limpar o buffer de armazenamento.
    4. Adicionar 500 μL 1X PBS para a resina e suspender a pelota com pipeta de 1 mL. Centrifugar a suspensão por 30 s em 8, 000 x g a 4 ° C e descartar a sobrenadante PBS cuidadosamente. Repita estas etapa de lavagem para limpar o buffer armazenado.
  5. Adicione 500 μL proteína extrato líquido sobrenadante preparado no passo 1.3.8 para a pelota de resina para suspender o sedimento e a suspensão de transferência para um novo tubo de 5ml refrigerada. Repita este passo novamente para certificar-se sem grânulos do gel de esquerda. Adicione o extrato de proteína esquerdo à mistura.
  6. Incube a mistura durante a noite em um shaker a 8 rpm a 4 ° C, para capturar a proteína de fusão de bandeira.
  7. Centrifugue a mistura após incubação de 12 h de 10 min a 1, 000 x g a 4 ° C.
  8. Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento três vezes com 500 μL de 1X PBS. Mantê-lo em gelo para uso imediato.
  9. Proteína de eluição hEAG1 a bandeira com 3x do peptídeo sinalizador.
    1. Prepare a solução de eluição de bandeira X 3. Dissolver 3 peptídeo sinalizador X na solução estoque de 500 μL (0,5 M Tris-HCl, NaCl de 1 M, pH = 7,5) em uma concentração de 8 μg/μL.
    2. Adicione 10 μL 3 x solução de eluição de bandeira para 390 μL de PBS para ser uma solução de concentração final de 200 ng/μL.
    3. Adicione 400 μL de solução de eluição de bandeira x 3 para os gel de grânulos preparados no passo 1.8.
    4. Incubar a amostra no shaker a 8 rpm por 2 h a 4 ° C.
    5. Centrifugue a resina por 30 s em 8, 000 x g.
    6. Transferir o sobrenadante para um tubo 1,5 mL e armazená-lo em 4 ° C, para uso imediato.

2. a concentração do ensaio e confirmação de bandeira purificado Fusion hEAG1 pelo BCA proteína Kit de ensaio e mancha ocidental

  1. Determine a concentração de proteína purificada usando o kit de ensaio de proteína BCA de acordo com instruções do fabricante.
  2. Use 30 amostra μL para análise ocidental para confirmar que a proteína de interesse tinha sido purificada usando um anticorpo anti-FLAG como descrito anteriormente,15.

3. rotulagem a proteína purificada-Channel com biotina para o ensaio BLI

  1. Prepare 5 mg/mL solução stock de biotina em PBS. Para cada teste (dois biosensores), adicione um 3 vezes excesso molar de biotina a 20 μg purificado proteína, para alcançar um preferível biotinylation N-terminal da proteína purificada em PBS.
  2. Incube a amostra no escuro no gelo pelo menos 30 min.
  3. Preparar o tampão de diluição (SD) de amostra: PBS com albumina de soro bovino de 0.02% polissorbato 20 e 0.1% (BSA, pH 7,4).
  4. Execute a ultrafiltração para alterar o buffer da proteína purificada de canal para o buffer de SD. Remover a biotina não acoplada usando o dispositivo de ultrafiltração com peso molecular de corte de 30 kDa, adicionando o buffer de SD e centrifugação da amostra a 12.000 x g, durante 10 minutos a 4 ° C.
  5. Remover o ultrafiltrate do tubo de centrífuga de dispositivo de ultrafiltração, juntar 200 μL de tampão de SD para o dispositivo de filtro e centrifugação da amostra a 12.000 x g, durante 10 minutos a 4° C. Repita esta operação pelo menos três vezes.
  6. Para coletar o buffer trocado amostra, inverteu Introduza o dispositivo de filtro em um tubo de 1,5 mL e centrifugação-los a 2.000 x g, durante 5 min a 4 ° C. Manter a amostra em gelo para uso imediato.

4. preparação da solução de2 PIP para ensaio

  1. Prepare a solução-mãe de PIP2 (1 mM) em desionizada H2O, sonicating por 30 min no gelo como descrito anteriormente,17. Conservar a solução em frascos de vidro a-20 ° C e diluí-la para as concentrações finais imediatamente antes de experimentos por vigorosa num Vortex.

5. BLI ensaio

  1. Ligue o equipamento e verifique a janela "status de instrumento" para confirmar que a máquina está em estado "pronto" para escaldar o equipamento pelo menos durante 30 min antes do estudo da BLI.
  2. Certifique-se de que fechar a porta do aparelho antes de abrir o software de aquisição de dados e escolher a "nova experiência cinética" no assistente do experimento.
  3. Defina os poços para ser usado na placa de 96 poços pelo botão direito escolher tampão, carga e amostra. Para poços de amostra, a unidade de concentração de proteína de hEAG1 biotinilado bandeira fusão deve ser entrada como molar (10 μg, 0.09 μM).
  4. Defina as etapas de ensaio, incluindo a linha de base, carregamento, associação e dissociação. Escolha uma etapa de ensaio e clique duas vezes na coluna respectiva. Uma cópia da definição de ensaio é definida para sensores de controle. Defina o rpm como 1.000. Escolha 1 min para etapa da linha de base e 5-10 min para carregamento, associação e dissociação, respectivamente. Realize o teste à temperatura ambiente (cerca de 24 ° C).
    Nota: Existem dois processos principais: a proteína de canal biotinilado aos sensores de carga e análise da interação com pequenas moléculas de compostos. Eles podem ser continuamente procedeu (linha de base, carregamento, linha de base, associação e dissociação). Alternativamente, eles podem ser procedeu separadamente para não desperdiçar os compostos do teste quando o primeiro carregamento parte vencida.
  5. Clique em colunas que contêm os sensores e clique em "Preenchimento" para indicar as localizações dos sensores na bandeja do sensor.
  6. Reveja tudo planejados passos para verificar erros e voltar para corrigi-los.
  7. Defina a localização dos arquivos de dados e clique em "Go" para iniciar o ensaio.
    Nota: Os sensores precisam prewetted pelo menos 10 min no buffer de SD, se tiver sido feito este passo, em seguida, a configuração de "Experimento início posterior" deve ser ignorada. Se não, definir um atraso de s 600 antes de prewetting os sensores.
  8. Coloquei uma placa de 96 poços a preta na parte inferior da bandeja e insira o encaixe a bandeja com a placa do assento A1 canto da placa. Para os poços carregar os sensores, 200 μL de tampão de ensaio por bem adicionar 2 poços na linha A e 2 poços na linha B da placa de 96 poços.
  9. Prepare outra placa de 96 poços preta como a placa da amostra e encher os poços com buffer de SD 200 μL na linha B como controle ou biotinilado solução de proteína do hEAG1 (10 μg) na linha A, conforme atribuído durante a programação na etapa 5.3.
    Nota: Evite a introdução de bolhas.
  10. Abra a porta do aparelho e insira a bandeja de sensor e placa da amostra no suporte do prato esquerdo e direito, respectivamente. Verifica que a placa de sensor da bandeja e a amostra estão posicionados corretamente, com base na forma do suporte da placa à esquerda e o marcador de "A1" no canto superior direito do suporte da placa direita. Feche a porta e começar o ensaio.

6. análise de dados

  1. Abra o software de análise de dados e carregar a pasta que contém os dados do ensaio. Clique em "Transformação" para entrar na interface de menu processamento e podemos ver as curvas de cinéticas crus coloridas.
  2. Sob Step1: "Seleção de dados", clique em "Seleção de Sensor". No "Sensor bandeja #1", clique em poços do sensor somente humedecido com buffer de SD e clique com o botão direito para "Alterar Sensor tipo" a "Sensor de referência". Sobre o ' mapa de placa de amostra ", designar os todos os poços de ligação não-específica e clique com o botão direito para"Mudança bem tipo"a"Referência bem".
  3. Assinale a caixa antes de "Subtração" da etapa 2 e ponto de "referência duplo".
  4. Na etapa 3: "Alinhar eixo Y", selecione "Baseline" como a etapa de alinhamento. Para "Intervalo de tempo", digite os últimos 10 s essa linha de base de (ou seja, de: 0,1 a: 59.8).
  5. Na etapa 4: "Etapa inter correção", selecione "alinhar a linha de base" para minimizar deslocamentos de sinal entre as etapas de associação e dissociação.
  6. Na etapa 5: "Processo", selecione a função de filtragem Savitzky-Golay na maioria dos casos e prossiga "Processar dados".
  7. Salvar dados brutos para posterior análise de dados usando outro software no passo 7: "Salvar resultados".
  8. Clique em "análise | Encaixe de curva".
    1. Para "Passo a analisar", escolha "Associação | Dissociação". Para o "Modelo", selecione 1:1.
      Nota: nós escolhemos 1:1 modelo porque equipar bem os nossos dados originais e evitar a possibilidade de sobre encaixe sob 1:2 ou 2:1 modelo devido a sua alta liberdade. Mas outras opções estão disponíveis aqui e podem ser devidamente escolhidas para outras análises de montagem para os modelos de ligação diferente do analito.
    2. Para o "Encaixe", escolha Global (completo). Para "Group By", selecione "Cor". Selecione "Rmax desvinculados por Sensor" para permitir o encaixe independente de resposta máxima do sinal (Rmax).
    3. Clique em "Ajustar curvas!" para iniciar a análise de regressão não linear. Em nosso estudo, utilizaram-se equação de Hill e única função exponencial.
    4. Clique em "exportação de dados | Relatório de salvar"para salvar resultados de encaixe. Ou clique em "exportação de dados | Exportar os resultados do encaixe"para salvar os dados brutos para mais gráficos e análise de dados com outros softwares.

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Resultados

Nós purificado a bandeira hEAG1 canal proteína da fusão da HEK-293T células estàvel Blumental hEAG1. A função desta proteína de fusão foi demonstrada usando o método da remendo-braçadeira e a qualidade e a especificidade da proteína purificada são confirmadas por Western blot (Figura 1). A proteína purificada canal é biotinilado para realizar um ensaio de interação com os lipídios (PIP2) usando o ensaio BLI em tempo real. A config...

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Discussão

Verificados como os alvos terapêuticos primários de mais de 13% de drogas atualmente conhecidas para o tratamento de uma variedade de doenças humanas, incluindo distúrbios cardiovasculares e neurológicos18canais iônicos de membrana. Remendo-braçadeira de gravação, o padrão ouro para medir o funcional de canais iônicos com pequenas moléculas, tem sido amplamente utilizada para ligantes de canal de íon de triagem. No entanto, tais abordagens eletrofisiológicas não podem demonstrar se ...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pelo centro de Bio-ID e SJTU fundo de investigação interdisciplinar em medicina e engenharia (YG2016QN66), Fundação Nacional de ciências naturais da China (31271217) e nacional pesquisa básica programa da China (2014CB910304).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/High Glucose MediumHyCloneSH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x)HyCloneSH30256.01
Fetal Bovine SerumGibco10270
Penicillin/StreptomycinGibco1697550
Cell Culture DishCorning430599150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 SubstituteAmrescoE109
Sodium chlorideBBI Life SciencesA610476
Potassium chlorideBBI Life SciencesA610440
Bovine Serum AlbuminBBI Life SciencesA600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan MonolaurateBBI Life SciencesA600560
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
3x FLAG peptideSigmaF4799
Octet-RED96Pall/FortéBio30-5048
Data Acquisition softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Data Analysis softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Biosensor/StreptavidinPall/FortéBio18-5019
Microtiter plateGreiner Bio-one655209
Sulfo-NHS-LC-LC-BiotinThermoFisher21338
Centrifugal MachineThermoFisher75004250
PageRuler Prestained Protein LadderThermoScientific318120
Ultrafiltration deviceMILLIPOREUFC503008NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)SigmaP9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibodySigmaF18041:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20051:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotimeP0010
Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04693159001
Amersham Imager 600 Imaging SystemGE Healthcare Bio-Sciences
Western blot systemBIO-RAD

Referências

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