JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол описывает взаимодействие очищенный hEAG1 ионный канал белка с маленькой молекулы липидов лигандом фосфатидилинозитол 4, 5-Бисфосфат (пункт2). Измерения демонстрирует, что BLI может быть потенциальным методом для Роман мелкомолекулярных ионного канала лигандом скрининга.

Аннотация

Био слоя пробирного интерферометрии (BLI) является ценным инструментом для измерения протеин протеина и молекулы белка маленький взаимодействий. Здесь, мы сначала описать применение этот роман метки бесплатно технику для изучения взаимодействия человеческого EAG1 (hEAG1) белки канал с маленькой молекулы PIP2. hEAG1 канал был признан потенциальных терапевтических цели из-за его аномальным гиперэкспрессия в несколько мутаций усиления функции участвуют в некоторых видах неврологических заболеваний и рака. Мы очищенной hEAG1 канал белки от системы млекопитающих стабильной выражение и измерить взаимодействие с2 PIP, BLI. Успешного измерения кинетики привязки между hEAG1 белка и ПУМ2 показывает, что BLI assay потенциал высок объём подход, используемый для Роман малые молекулы лиганда скрининга в фармакологии ионного канала.

Введение

Ориентация клеток поверхности доступные ионного канала белков с малых молекул предлагает огромный потенциал для скрининга лиганда и биологических наркотиков открытие1,2,3. Таким образом соответствующий инструмент необходим для изучения взаимодействия между ионного канала и малых молекул и их соответствующие функции. Патч зажим запись была продемонстрирована быть уникальной и незаменимой техники в ионных каналов функциональных assay. Однако, определение ли малые молекулы предназначены непосредственно для ионных каналов требуют других технологий. Традиционно радиоактивных лигандом привязки был использован соблюдать кинетика привязки между малые молекулы и его целевого белка ионного канала. Однако использование этой техники является ограниченным из-за его требование радиоактивных маркировки и обнаружения. Кроме того предварительные шаг для обозначения мелких лиганд в исследовании предотвращает его использование во многих типах ионных каналов без известных конкретных лиганда. Некоторые метки бесплатные методы, такие как ЯМР спектроскопии, рентгеновской дифракции, микромасштабной thermophoresis (MST)4 и поверхностного плазмон резонанса (СРП) были использованы для оценки взаимодействия молекулы белка маленький. Но эти виды анализов обычно не может предоставить достаточно информации из-за трудности, чтобы получить полноценный белок, низкое разрешение, динамики, низкой пропускной способности и высокой стоимостью5. В отличие от этих методов био слоя интерферометрии (BLI) формируется как Роман метки бесплатно методология для преодоления этих недостатков для обнаружения взаимодействия молекулы белка маленький иммобилизирующие небольшое количество белка образца на поверхностях Биосенсор и измерительные оптические изменения сигналов6,7. Как перспективной платформой биосенсор, BLI техника уже выполняется наблюдать взаимодействие малых молекул с природной водой растворимые белки такие человеческие моноклональные антитела CR80208 и подробного анализа процедуры уже сообщалось в предыдущие статьи9. Хотя была признана ключевая роль ионного канала белка для обнаружения новых терапевтических целей, ионного канала молекулы белка маленький взаимодействия assay основанный на BLI не были описаны.

Человека эфира меню go-go каналов (hEAG1), выраженные в различных типов раковых клеток и центральной нервной системы, что делает канал a потенциальных терапевтических цели многих раковых заболеваний и нейрональных расстройств10,11, 12,,1314. Электрофизиологическое исследование в нашей лаборатории подтвердил тормозящий эффект фосфатидилинозитол 4, 5-Бисфосфат (пункт2) на hEAG1 канал15. На основе наших результатов, тестирование PIP2 непосредственное взаимодействие с hEAG1 с помощью BLI техника может быть как модель для других типов ионного канала молекулы белка маленький составные взаимодействия специально для этих каналов не хватает конкретных лигандами. Согласно указаниям BLI пробирного, мы подготовили биотинилированным hEAG1 белков и иммобилизованные их на поверхности стрептавидина (SA) биосенсор советы следуют взаимодействия их пункта2 решения соблюдать их прямую привязку между белков и липидов. После вложения PIP2 hEAG1 белка с покрытием поверхности, толщина слоя на поверхности увеличивается, который напрямую коррелирует сдвиг спектральных и может быть измерена в режиме реального времени16. Кинетика привязки может быть определен из-за позитивный сдвиг в ассоциации шаг и отрицательный сдвиг в диссоциации шаг. Согласно этому принципу мы очищенный белок канала Ион функциональные hEAG1 ГЭС 239T выражение стабильной системы, используя метод очищения сродства для поддержания в vitro функционального состояния, а затем Измеренная кинетика привязки различные концентрации пункта2и принесли semblable кинетических данных, как отмечено в электрофизиологические измерения15. Тесная связь между результатами от BLI и электрофизиологические измерения в первый раз продемонстрировать пригодность BLI как соответствующий аналитический инструмент для ионного канала мембраны молекулы белка маленький взаимодействия.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Линия клетки ГЭС 293T, непрерывно выражая с тегами Флаг hEAG1 белок канала строится путем transfecting pCDH лентивирусные плазмида, содержащий последовательность ДНК hEAG1 с флагом в дистальной части C-terminus в клетки ГЭС 293T, за которым следует puromycin устойчивостью выбор как описано15.

1. близость Очистка флага тегами белка hEAG1 канал от ГЭС 293T клеток

  1. Оттепель клетки, стабильно выражая hEAG1 каналы из жидкого азота в теплую воду (37 ° C) быстро. Заполнить клетки (около 5 х 106 замороженные клетки) в 10 см блюдо. Расти ячейки на ночь в Дульбекко изменение орла (DMEM) средних дополнена 8 мл 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 единиц/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина, 4 мм L-глютамина и изменил средней следующий день.
  2. Проверьте GFP флуоресценции этих ГЭС 293T клеток с помощью флуоресцентный Микроскоп, чтобы убедиться, что высокий процент клеток стабильно Экспресс hEAG1 каналов в системе культивирования. Trypsinize экспоненциально растущей клетки с 1 мл раствора трипсин 0.25% за 1 мин при комнатной температуре и thenadd 2 мл сыворотки содержащие жидкости культуры прекратить пищеварение. Передать 15 см блюдо, содержащих 15 мл полного среднего DMEM 400 мкл суспензии клеток. Подготовьте четыре блюда 15 см в общей сложности.
  3. Урожай этих клеток после 2-3 дней культуры когда клетки достигает около 90% confluency.
    1. Удалите средство роста из клеток и мыть их дважды с 4 мл фосфата буфер солевой (ПБС, pH = 7,4).
    2. Выбросите PBS после стирки.
    3. Скрип клетки в PBS 1 x 2 мл для каждого блюдо с использованием клеток лом и передачи царапины клетки с 1 мл Пипетка в 15 мл трубку.
    4. Центрифуга суспензию клеток для 5 мин при 420 x g при 4 ° C.
    5. Декантируют и удалить супернатант.
    6. Ресуспензируйте Пелле клетки в целом 4 мл буфера lysis (10 мм HEPES, 1,5 мм2MgCl 10 NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, ингибитор протеазы содержится полный) для 30 минут на льду и вихрь тщательно lysate каждые 10 мин.
    7. Центрифуга для ячейки lysate 10 мин на 12000 x g при 4 ° C.
    8. Передача супернатант в 5 мл трубку и держать его на льду для немедленного использования.
  4. Подготовьте анти флаг м2 сродство смолы.
    1. Тщательно приостановите смолы (поставляется как подвеска 50% в магазине буфера), нежный инверсии, чтобы убедиться, что бутылка анти флаг м2 близость геля является единой подвеска гель бусинки.
    2. Немедленно перевести 400 мкл суспензии в охлажденной 1,5 мл.
    3. Центрифуга подвеска для 30 s 8, 000 x g при 4 ° C и удалить супернатант тщательно, чтобы промыть в магазине буфер.
    4. Добавьте 500 мкл ПБС смолы и приостановить лепешка с Пипетка 1 мл. Затем центрифуга подвеска для 30 s 8, 000 x g при 4 ° C и тщательно удалить супернатант PBS. Повторите эти мыть шаг, чтобы очистить сохраненные буфер.
  5. Добавьте 500 мкл белков экстракта супернатант подготовлен на шаге 1.3.8 смолы Пелле приостановить гранулы и передать новой охлажденной 5 мл трубки подвеска. Повторите этот шаг еще раз, чтобы убедиться, что не гель бусинки слева. Добавьте экстракт левой белка в смеси.
  6. Инкубируйте смесь на ночь на шейкер на 8 об/мин при 4 ° C для захвата флага синтез белка.
  7. Центрифуга смесь после инкубации 12 ч 10 мин на 1, 000 x g при 4 ° C.
  8. Отменить супернатант и помыть лепешка три раза с 500 мкл ПБС. Держите его на льду для немедленного использования.
  9. Элюирующий флаг hEAG1 белок с 3 x флаг пептид.
    1. Подготовка 3 X флаг Элюирующий раствор. Растворите 3 X флаг пептида в 500 мкл Стоковый раствор (0,5 М трис-HCl, 1 M NaCl, рН = 7,5) в концентрации 8 мкг/мкл.
    2. Добавьте 10 мкл 3 x флаг Элюирующий раствор 390 мкл PBS решением конечной концентрации 200 нг/мкл.
    3. Добавьте 400 мкл 3 x флаг Элюирующий раствор гель бусинки, подготовленный на этапе 1.8.
    4. Проинкубируйте образцы в шейкер на 8 об/мин на 2 ч при 4 ° C.
    5. Центрифуга смолы для 30 s на 8 000 x g.
    6. Супернатант передать свежие 1,5 мл и хранить его на 4 ° C для немедленного использования.

2. концентрация пробы и подтверждения очищается флаг Fusion hEAG1 комплект Assay протеина BCA и западный Blotting

  1. Определите концентрацию очищенный протеин с помощью комплекта пробирного белка BCA, согласно инструкции изготовителя.
  2. Для подтверждения, что протеин интереса были очищены используя антитело против флага как описано15используйте 30 мкл пример для западного анализа.

3. Маркировка очищенный канала белка с биотина для BLI Assay

  1. Подготовьте 5 мг/мл Стоковый раствор биотина в PBS. Для каждого теста (два биосенсоры) добавьте вывозимому Молярная избыток биотина 20 мкг очищенный белок для достижения предпочтительнее biotinylation N-терминальный очищенный белка в PBS.
  2. Проинкубируйте образцы в темноте на льду, по крайней мере 30 минут.
  3. Подготовить буфером для разбавления проб (SD) пример: PBS с 0,02% Полисорбат 20 и 0.1% бычьим сывороточным альбумином (БСА, рН 7,4).
  4. Выполните ультрафильтрации для изменения буфера белка очищенного канала SD буфер. Удаление несвязанных биотина, используя ультрафильтрации устройство с молекулярной массой отсечки 30 кДа, добавив SD буфера и центрифугирование образца в 12000 x g, 10 мин при 4 ° C.
  5. Удаление ультрафильтрацией из пластиковых пробирок ультрафильтрации устройство, добавить 200 мкл буфера SD в устройство фильтра и центрифугирование образца на 12000 x g, 10 мин при 4° C. Повторите эту операцию по крайней мере три раза.
  6. Для сбора в буфер обмена образца, вспять вставьте устройство фильтра в 1,5 мл трубки и центрифугирование их на 2000 x g, за 5 мин при 4 ° C. Держите образец на льду для немедленного использования.

4. Подготовка пункта2 решения для Assay

  1. Подготовьте Стоковый раствор пункта2 (1 мм) в дейонизированной H2O, sonicating за 30 минут на льду, как описано выше17. Сохранить решение в стеклянные флаконы по при-20 ° C и разбавить его окончательный концентрации непосредственно перед эксперименты с энергичной vortexing.

5. BLI Assay

  1. Включите оборудование и проверьте окна «статус документа» для подтверждения, что машина находится в состоянии «готово» для prewarm оборудование по крайней мере, за 30 мин до BLI исследования.
  2. Убедитесь, что дверь инструмента закрыт перед открытием программного обеспечения сбора данных и выберите «Новый эксперимент кинетика» в мастере эксперимент.
  3. Определите скважин для использования на пластину 96-луночных щелкните правой кнопкой мыши выбрать буфер, нагрузки и образца. Для образца скважин, единица концентрации биотинилированным флаг синтез белка hEAG1 следует ввод как моляра (10 мкг, 0.09 мкм).
  4. Определите шаги анализа, включая базовые, загрузки, ассоциации и диссоциации. Выберите шаг пробирного и дважды щелкните на соответствующем столбце. Копию определения пробирного устанавливается для датчиков контроля. Задайте скорость вращения 1000. Выбор 1 мин для базовых шага и 5 – 10 мин для загрузки, ассоциации и диссоциации, соответственно. Выполните тест при комнатной температуре (около 24 ° C).
    Примечание: Существует две основные процедуры: Загрузка биотинилированным канал белка для датчиков и assaying взаимодействия с маленькой молекулы соединений. Они могут быть продолженным непрерывно (базовый, загрузки, базовый, ассоциации и диссоциации). Кроме того они могут быть продолженным отдельно чтобы избежать напрасной траты испытаний соединений при первой загрузке часть неудачного.
  5. Выберите столбцы, которые содержат датчики и нажмите кнопку «Заливка», чтобы указать расположение датчиков на панели датчиков.
  6. Обзор всех запланированных шаги для проверки ошибок и вернуться к их исправить.
  7. Задание расположения файлов данных и нажмите кнопку «Go», чтобы начать анализ.
    Примечание: Датчики нужно prewetted по крайней мере 10 минут в буфере SD, если был сделан этот шаг, а затем параметр «Отложено начало эксперимента» должна быть пропущена. Если нет, то установить 600 s задержку перед prewetting датчиков.
  8. Положить черный 96-луночных пластину в нижней части лотка и вставьте А1 угол пластины в паз на лоток на место пластину. Для скважин для загрузки датчики 200 мкл аналитического буфера за хорошо добавить в 2 скважины в строке A и 2 скважины в строке B 96-луночных пластины.
  9. Подготовить еще один черный 96-луночных пластины как образец пластины и заполнить скважин с 200 мкл буфера SD в строке B как управления или биотинилированным hEAG1 белка раствора (10 мкг) в строке как назначена во время программирования на шаге 5.3.
    Примечание: Избегайте, представляя пузыри.
  10. Открыть дверь документа и вставьте датчик лоток и образца пластины в левой и правой плиты держатель, соответственно. Проверьте что пластину датчика лоток и образец расположены правильно основанные на форму слева пластины держателя и маркер «А1» в верхнем правом углу правой пластина держателя. Закройте дверь и начать пробу.

6. анализ данных

  1. Откройте программное обеспечение для анализа данных и загрузить в папку, содержащую данные анализа. Нажмите кнопку «Обработка», чтобы попасть в меню интерфейс обработки, и мы можем увидеть красочные сырой кинетических кривых.
  2. Согласно Step1: «Выбор данных», нажмите кнопку «Выбор датчика». На «датчик лоток #1», щелкните датчик скважин только увлажненный с SD буфера и щелкните правой кнопкой мыши «Изменить датчик тип» для «Ведения датчик». На ' карта пластины образца», назначить все скважины без конкретной привязки и щелкните правой кнопкой мыши «Хорошо тип изменения» до «Хорошо ссылки».
  3. Поставьте галочку в поле перед «Вычитание» шаг 2 и пункт «Двойная ссылка».
  4. Шаг3: «Выровнять оси Y», выберите «Базовый» в качестве шага выравнивания. Для «Интервал», введите последние 10 s этой базовой (т.е. от: 0.1 до: 59,8).
  5. Шаг4: «Интер шаг коррекции», выберите «Выровнять по базовой линии» для сведения к минимуму изменения сигнала между Ассоциацией и диссоциации шаги.
  6. Шаг5: «Процесс», выберите функции фильтрации Савицкий Голея в большинстве случаев и продолжить «Данные процесса».
  7. Сохраните исходные данные для дальнейшего анализа данных с помощью другого программного обеспечения в действии 7: «Сохранить результаты».
  8. Нажмите кнопку «анализ | Кривой».
    1. «Шаг для анализа», выберите «Ассоциация | Диссоциация». «Модель» выберите 1:1.
      Примечание: мы выбираем модель 1:1, потому что он хорошо на наших исходных данных и избежать возможности за установку под 1:2 или 2:1 модель из-за их высокой свободы. Но другие варианты доступны здесь и может быть надлежащим образом выбран для анализа других установку для различных привязки модели исследуемое вещество.
    2. Для «Установки», выберите Глобальная (полный). Для «Group By» выберите «Цвет». Выберите «Rmax несвязанный, датчик» для независимой установки максимальный сигнал ответа (Rmax).
    3. Нажмите кнопку «Fit Curves!» чтобы начать анализ нелинейной регрессии. В нашем исследовании использовались уравнения Хилл и одной экспоненциальной функции.
    4. Нажмите кнопку «Экспорт данных | Сохранить отчет» сохранить установку результаты. Или нажмите кнопку «Экспорт данных | Экспортировать результаты установки» для сохранения необработанные данные для дальнейшего анализа данных и с другим программным обеспечением.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы очищены флаг синтез белка hEAG1 канал от ГЭС 293T клетки стабильно гиперэкспрессия hEAG1. Функция этой синтез белка была продемонстрирована с помощью метода патча зажим и качество и специфику очищенный протеин подтверждаются Вестерн-блот (рис. 1). Очищенны?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Как основной терапевтических целей более чем на 13% в настоящее время известные препараты для лечения различных заболеваний человека, в том числе сердечно-сосудистой системы и неврологических расстройств18были проверены мембранных ионных каналов. Патч зажим записи, золото...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана центр био-ID и SJTU кросс-дисциплинарной Фонд исследований в области медицины и техники (YG2016QN66), Национальный фонд естественных наук Китая (31271217) и национальных базовых исследований программа Китая (2014CB910304).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/High Glucose MediumHyCloneSH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x)HyCloneSH30256.01
Fetal Bovine SerumGibco10270
Penicillin/StreptomycinGibco1697550
Cell Culture DishCorning430599150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 SubstituteAmrescoE109
Sodium chlorideBBI Life SciencesA610476
Potassium chlorideBBI Life SciencesA610440
Bovine Serum AlbuminBBI Life SciencesA600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan MonolaurateBBI Life SciencesA600560
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
3x FLAG peptideSigmaF4799
Octet-RED96Pall/FortéBio30-5048
Data Acquisition softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Data Analysis softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Biosensor/StreptavidinPall/FortéBio18-5019
Microtiter plateGreiner Bio-one655209
Sulfo-NHS-LC-LC-BiotinThermoFisher21338
Centrifugal MachineThermoFisher75004250
PageRuler Prestained Protein LadderThermoScientific318120
Ultrafiltration deviceMILLIPOREUFC503008NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)SigmaP9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibodySigmaF18041:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20051:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotimeP0010
Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04693159001
Amersham Imager 600 Imaging SystemGE Healthcare Bio-Sciences
Western blot systemBIO-RAD

Ссылки

  1. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  2. van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
  3. Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
  4. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
  5. Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
  6. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
  7. Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
  8. Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383(2014).
  10. Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
  11. Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
  12. Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
  13. Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
  14. Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
  15. Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
  16. Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
  17. Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
  18. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
  19. Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
  20. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133BLIEAG1 hEAG1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены