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要約

ここのプロトコルでは、小分子脂質リガンド ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) と精製 hEAG1 イオン チャネル蛋白質の相互作用について説明します。測定は、バリでした小分子イオン チャネル リガンドのスクリーニングのための潜在的な方法であることを示します。

要約

バイオ層干渉 (結合) アッセイは、タンパク質とタンパク質・小分子相互作用を測定するための貴重なツールです。ここでは、まず人間の EAG1 の相互作用を研究する新ラベル無料技術のアプリケーションを示す低分子 PIP2(hEAG1) チャネル蛋白質。hEAG1 チャネルは、がんや神経疾患のいくつかの種類に関与するいくつかの機能獲得変異でその異常発現のための潜在的な治療上のターゲットとして認識されています。我々 は哺乳類の安定発現系から hEAG1 チャネル蛋白質を精製し、PIP2バリとの相互作用を測定します。HEAG1 タンパク質と PIP2間のバインドの動態の測定に成功は、バリ アッセイであるイオン チャネルの薬理学の新規低分子リガンドのスクリーニングに使用可能性のある高スループット アプローチについて説明します。

概要

ターゲット小分子と細胞表面でアクセス可能なイオン チャネル蛋白質リガンドのスクリーニングと生物学的製剤の発見1,2,3の途方もない可能性を提供しています。したがって、適切なツールは、イオン チャネルおよび小さい分子および彼らの対応する関数との相互作用に必要です。パッチ ・ クランプ記録は、イオン チャネル機能アッセイにユニークでかけがえのない技術実証されています。ただし、他の技術を必要とする小さな分子がイオン チャネルを直接対象かどうかを決定します。伝統的に、放射性リガンド結合アッセイ法はイオン チャネル タンパク質・小分子間結合の動態を観察していました。ただし、この技法の使用法は、限られたその要件を満たすのため放射性分類および検出。また、研究で小さなリガンドのラベルに必須のステップは知られている特定のリガンドなしイオン チャネルの多くの種類で使用できなくなります。NMR 分光法、x 線回折、マイクロ スケール働く (MST)4表面プラズモン共鳴 (SPR) などいくつかの無料のラベルのテクニックは、小さなタンパク質分子間相互作用を測定するために使用されています。しかし、通常の試金のこれらのタイプは、実物大の蛋白質、ダイナミクス、低いスループット、および高コスト5の低解像度を得ることが困難なのため十分な情報を提供できません。これらの手法とは対照的バイオ層干渉 (結合) の表面の小さな蛋白質のサンプル量を固定化した小さなタンパク質分子間相互作用を検出するためのこれらの欠点を克服するための新しいラベル無料方法論として浮上しています。バイオ センサーと光の変化を測定、6、7を通知します。有望なバイオ センサー プラットフォームとしてのバリの方法を既に実行してひと抗体 CR80208などの可溶性タンパク質の天然水で小さな分子の相互作用を観察して、詳細な試金プロシージャで報告されている、前9条。新しい治療上のターゲット発見のためイオン チャネル蛋白質の重要な役割が認識されているがバリに基づくイオン チャネル蛋白質小分子の相互作用アッセイは記載されていません。

人間ゴーゴー エーテル アラカルトチャンネル (hEAG1) は癌細胞および多くのがんや神経疾患10、11、チャネルの潜在的な治療ターゲットとなる中枢神経系の様々 な種類で表されます。 12,13,14。私たちの研究室で電気生理学的調査は、ホスファチジルイノシトール 4, 5 ビスリン酸 (PIP2) hEAG1 チャネル15の抑制効果を確認しました。テスト PIP2バリ手法による hEAG1 との相互作用は特に特定のリガンドを欠けているこれらのチャネルのイオン チャネル蛋白質小分子化合物相互作用の他のタイプのためのモデルとしてすることができます直接私たちの結果に基づいています。バリ アッセイの指示に従って我々 は hEAG1 蛋白質ビオチン化を準備し、それらを固定化したストレプトアビジン (SA) の表面にバイオ センサーのヒント続く相互作用それら PIP2ソリューションとの間の直接結合を観察するために、蛋白質および脂質。HEAG1 タンパク質表面、表面の層の厚さに PIP2の添付ファイルが増加した後直接相関スペクトルのシフトとリアルタイム16で測定することができます。拘束運動は、協会ステップで正のシフトと解離の手順で負のシフトにより決定できます。この原則によると我々 は体外機能的状態を維持するために親和性の浄化法を用いた HEK 239T 安定発現システムから機能的な hEAG1 イオン チャネル蛋白質を精製し、結合の動態を測定濃度の異なる2、ピップし、電気生理学的測定15に見られる semblable 速度論的データが得られました。バリからの結果と電気生理学的測定との間に対応は初めてイオン チャンネル膜蛋白質小分子相互作用の適切な分析ツールとしてのバリの適性を示します。

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プロトコル

注: 遠位 C 末端のフラグと hEAG1 続いて HEK 293 t 細胞への DNA 配列を含む pCDH レンチ ウイルス プラスミドを株で継続的にタグ付きのフラグ hEAG1 チャネル蛋白質を表現する HEK 293 t 細胞ラインを構築、ピューロマイシン耐性選択前述15を。

1. 親和性の浄化 HEK 293 t 細胞からの hEAG1 チャネル蛋白質のタグ付きのフラグ

  1. 暖かい水 (37 ° C) にすぐに液体窒素から hEAG1 チャネルを発現する安定細胞を解凍します。10 cm 皿 (約 5 × 106凍結細胞) の細胞を播きます。セルの成長ダルベッコ変更されたワシの (DMEM) で一晩中 8 mL の 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、4 mM L グルタミンを添加した、次の日に媒体を変更します。
  2. 細胞の割合が高い安定した養殖システムで hEAG1 チャンネルを表現を確認する蛍光顕微鏡を用いた HEK 293 t 細胞の GFP 蛍光を確認してください。指数関数的に 1 ml 室温と thenadd 消化で終了する血清を含む培養液 2 mL で 1 分の 0.25% トリプシンの成長細胞を trypsinize します。細胞懸濁液の 400 μ L を完全 DMEM 培地 15 mL を含んでいる 15 cm 皿に転送します。合計で 4 つの 15 cm 料理を準備します。
  3. 2-3 日培養細胞の約 90% に到達した後、これらの細胞を収穫の confluency。
    1. 細胞から成長培地を外し、生理食塩水リン酸緩衝の 4 mL で 2 回洗浄し (1 x PBS、pH 7.4 を =)。
    2. 洗浄後に、PBS を破棄します。
    3. 15 mL チューブにピペットの 1 mL と廃電池セルこすりと転送を使用して各料理の 2 mL の 1x PBS に細胞をこすり取る。
    4. 4 ° C で 420 x g で 5 分間細胞懸濁液を遠心分離します。
    5. デカントし、上澄みを廃棄します。
    6. 氷と渦徹底的にライセート 10 分ごとに 30 分の換散バッファー (10 mM HEPES、1.5 mM MgCl2、10 mM の NaCl、1 NP 40%, pH 7.0 では、含まれている完全なプロテアーゼ阻害剤) の合計 4 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
    7. 細胞ライセートの 4 ° C で 12,000 × g で 10 分間遠心します。
    8. 5 mL チューブに上清を転送する即時の使用のため氷の上保管してください。
  4. 反フラグ M2 の親和性の樹脂を準備します。
    1. 徹底的に反フラグ M2 の親和性のゲルのボトルはゲル粒子の均一懸濁を確認する穏やかな逆転によって (ストア バッファー 50% 懸濁液として供給) 樹脂を中断します。
    2. すぐに冷えた 1.5 mL チューブに懸濁液の 400 μ L を転送します。
    3. 30 の 8 s、4 ° C で 000 x g の懸濁液を遠心し、ストア バッファーを洗浄するために慎重に上澄みを廃棄します。
    4. 樹脂を 500 μ L 1 × PBS を追加し、1 mL ピペットでペレットを中断します。30 の 8 s、4 ° C で 000 x g の懸濁液を遠心分離し、慎重に培養上清中の PBS を破棄します。これらを繰り返し洗浄ステップ格納されたバッファーをクリアします。
  5. 500 μ L タンパク質抽出上清樹脂ペレット、ペレットを中断し、新しい冷蔵 5 mL チューブに懸濁液を転送するステップ 1.3.8 で準備を追加します。もう一度確認の左ゲルビーズにこの手順を繰り返します。左のタンパク質抽出物を混合物に追加します。
  6. フラグの融合蛋白質をキャプチャする 4 ° C で 8 回転でシェーカーで一晩の混合物を孵化させなさい。
  7. 1 で 10 分間、4 ° C で 000 x g 12 時間培養後の混合物を遠心分離します。
  8. 上澄みを廃棄し、1 × PBS の 500 μ L の 3 回餌を洗浄します。即座の使用のための氷の上におきます。
  9. 3x フラグ ペプチド溶出フラグ hEAG1 蛋白質。
    1. 3 X フラグ溶出ソリューションを準備します。500 μ L の原液で 3 X フラグ ペプチドを溶解 (0.5 M トリス-HCl、1 M 塩化ナトリウム、pH = 7.5) 8 μ g/μ L の濃度で。
    2. 200 ng/μ L の最終的な集中の解決策になるに PBS の 390 μ L に 10 μ L 3 x フラグ溶出液を追加します。
    3. 1.8 のステップで準備ゲルビーズに 3 x フラグ溶出液の 400 μ L を追加します。
    4. 4 ° C で 2 h の 8 回転でシェーカーでサンプルをインキュベートします。
    5. 遠心分離機の 30 用樹脂、8 時 s 000 x g。
    6. 上清を新しい 1.5 mL チューブに転送、即座の使用のための 4 ° C で保存できます。

2. 集中の試金と浄化確認フラグの融合 hEAG1 BCA タンパク質アッセイ キットと西部にしみが付くことによって

  1. 製造者の指示によると BCA タンパク質アッセイ キットを使用して浄化された蛋白質の集中を定めます。
  2. 西部の分析の 30 μ L のサンプルを使用して、確認前述15反フラグ抗体を使用して興味の蛋白質を精製されていた。

3. バリの試金のためビオチンと精製チャネル蛋白質のラベル付け

  1. PBS で原液をビオチン 5 mg/mL を準備します。各テスト (2 バイオ センサー)、PBS で浄化された蛋白質の望ましい N ターミナル ビオチン化を達成するために 20 μ g 精製蛋白質にビオチンの 3 倍モル超過分を追加します。
  2. 暗闇の中、少なくとも 30 分間氷の上でサンプルをインキュベートします。
  3. サンプル希釈 (SD) バッファーを準備: PBS の 0.02% ポリソルベート 20、0.1% ウシ血清アルブミン (BSA、pH 7.4)。
  4. 限外ろ過 SD バッファーに精製されたチャネル蛋白質のバッファーを変更するを実行します。30 kDa の分子量カットオフと限外濾過装置を使用して、SD バッファーの追加、および 12,000 のサンプルを遠心分離によって非連結のビオチンを削除 4 ° C で 10 分間の g x
  5. フィルター デバイスに 200 μ L SD バッファーを追加限外ろ過装置、遠心分離機管から、見出されたを削除し、4 ° C で 10 分間、12,000 × g でサンプルを遠心分離少なくとも 3 回、この操作を繰り返します。
  6. 交換バッファーを収集するには、サンプルでは、逆に 1.5 mL チューブに 4 ° C で 5 分間、2,000 × g で遠心分離それらフィルター デバイスに挿入します。即座の使用のための氷のサンプルを保ちます。

4 PIP2ソリューションの試金のための準備

  1. 前述の17として氷の上で 30 分間 sonicating 脱イオン H2O の PIP2 (1 mM) の原液を準備します。-20 ° C でガラス瓶でソリューションを格納し、積極的なボルテックス実験の直前に最終濃度に希釈します。

5. バリ アッセイ

  1. 機器の電源をマシンは、少なくともバリ調査の前に 30 分間、機器を prewarm に「準備完了」の状態を確認する「計測器ステータス」ウィンドウを確認してください。
  2. 実験ウィザードで「新しい動力学実験」を選択してデータ集録ソフトウェアを開く前に楽器のドアが閉じているかどうかを確認します。
  3. バッファー、負荷、およびサンプルを選択する右クリックで 96 ウェル プレートで使用する井戸を定義します。サンプル井戸、ビオチン化フラグ融合 hEAG1 タンパク質の濃度の単位として入力する必要があります (10 μ g、0.09 μ M) の臼歯。
  4. ベースライン、読み込み、離合集散を含む試金のステップを定義します。試金のステップを選択し、それぞれの列をダブルクリックします。アッセイ定義の複製制御センサーを設定されています。1,000 rpm に設定します。基準ステップ 1 分と読み込み、協会、および解離、5-10 分をそれぞれ選択します。室温 (約 24 ° C) でテストを実行します。
    注: 2 つの主な手順があります: ロード センサーにビオチン化チャネル蛋白質と低分子化合物との相互作用の試金。彼らが継続的に進むことができる (ベースライン、読み込み、ベースライン、協会および解離)。また、最初の読み込みが失敗したそのとき、試験化合物を無駄にしないように個別に進むことが。
  5. センサーが含まれておりセンサー トレイにセンサーの位置を示す「塗りつぶし」をクリックして列をクリックします。
  6. 間違いをチェックし、それらを修正する戻るすべての計画手順を確認します。
  7. データ ファイルの場所を設定し、アッセイを開始するために"Go"をクリックします。
    注: センサー必要 prewetted SD バッファーで少なくとも 10 分のためこの手順が行われている場合、「実験開始遅延」設定をスキップする必要があります。いない場合は、センサーを prewetting 前に 600 秒遅延を設定します。
  8. トレイの底に黒 96 ウェル プレートを入れて、プレートの A1 コーナーをプレートを座席にトレイの切り込みに挿入します。センサーをロードする井戸、200 μ L/ウェル アッセイバッファーの 2 行 A 井と 2 行 B 96 ウェル プレートの井戸に追加します。
  9. サンプル プレートとして別の黒 96 ウェル プレートを準備し、B 列に 200 μ L SD を行内のステップ 5.3 でのプログラミング中に割り当てられたコントロールまたはビオチン標識の hEAG1 タンパク質溶液 (10 μ g) として井戸を埋めます。
    注: は、気泡を導入することを避けるため。
  10. 装置のドアを開けるとセンサー トレイを挿入し、それぞれ左と右のプレート ホルダーにプレートのサンプルします。左プレート ホルダーと右のプレート ホルダーの右上隅に"A1"マーカーの形状に基づいて正しくセンサー トレイとサンプル プレートの位置を確認してください。扉を閉じて、分析を開始します。

6. データの分析

  1. データ分析ソフトウェアを開き、分析データが含まれているフォルダーをロードします。処理メニュー インターフェイスに入るための「処理」をクリックしてと、カラフルな生運動曲線を見ることができます。
  2. ステップ 1の下で:「データ選択」、「センサーの選択」をクリックします。「センサー トレイ #1」、は、SD バッファーで湿っただけセンサー井戸をクリックしてし、""の参照センサー"へ"センサー タイプを変更するを右クリックします。' サンプル プレート マップ"、すべての非特異的結合井戸を指定し、「よくタイプ変更を""よくを参照"を右しますクリック。
  3. ステップ 2 の「減算」の前ボックスにチェックして、「二重基準」を指します。
  4. ステップ3:「Y 軸合わせ」配置のステップとして「ベースライン」を選択します。「時間範囲」、最後の 10 を入力その基準の s (すなわちから: 0.1: 59.8)。
  5. ステップ4:「間ステップ補正」選択「に揃える基準」協会と解離のステップ間の信号変化を最小限に抑える。
  6. ステップ5:「プロセス」、ほとんどの場合サビツキー ・ ゴーレイ フィルター処理関数を選択し、「プロセス データ」を進みます。
  7. 詳細なデータ分析手順 7 でその他のソフトウェアを使用して生データを保存:「保存結果」。
  8. クリックして"分析 |カーブ フィット」。
    1. 選択ステップを「分析」、「協会 |解離」。「モデル」、1:1 を選択します。
      注: 我々 は我々 の元のデータにも装着過適合の下での可能性を避けるため 1:1 モデルを選択 1:2 または 2:1 の自由度の高いモデル。その他のオプションです、適当に他のフィッティング解析試料の異なるバインディング モデルを選択できます。
    2. 「フィット」グローバル (フル) を選択します。「グループ化」、「色」を選択します。「Rmax リンクされていないセンサー」最大信号応答 (Rmax) の独立したフィッティングを許可するを選択します。
    3. 「フィット カーブ!」をクリックして、非線形回帰分析を開始します。ヒルの式と 1 つの指数関数は、我々 の研究で使用されました。
    4. クリックして"データのエクスポート |レポートを保存するには"フィッティング結果を保存します。クリックして、または「データ エクスポート |フィッティング結果をエクスポート"他のソフトウェアとさらにグラフ作成とデータ解析の生データを保存します。

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結果

HEK 293 t 細胞安定発現 hEAG1 からフラグの融合 hEAG1 チャネル蛋白質を精製しました。この融合タンパク質の機能は、パッチ ・ クランプ法による実証されています、品質と浄化された蛋白質の特異性は西部のしみ (図 1) で確認しました。精製チャネル蛋白質は、リアルタイムのバリ アッセイを用いたビオチン化 (PIP2) 脂質相互作用分析を実...

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ディスカッション

膜イオン チャネルは、さまざまな心血管および神経学的疾患18を含む人間の病気の治療のため現在知られている医薬品の 13% 以上の主要な治療上のターゲットとして検証されています。パッチ ・ クランプ記録、小分子とイオン チャネルの機能を測定するため黄金の標準は、広くイオン チャネル リガンドのスクリーニングに使用されています。ただし、小さな分子は他の蛋...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、バイオ ID センターと医学と工学 (YG2016QN66)、国家自然科学基金、中国の (31271217)、および基本的な研究プログラムの中国国家 (2014CB910304) では上海交通大学横断的研究費によって支持されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/High Glucose MediumHyCloneSH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x)HyCloneSH30256.01
Fetal Bovine SerumGibco10270
Penicillin/StreptomycinGibco1697550
Cell Culture DishCorning430599150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 SubstituteAmrescoE109
Sodium chlorideBBI Life SciencesA610476
Potassium chlorideBBI Life SciencesA610440
Bovine Serum AlbuminBBI Life SciencesA600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan MonolaurateBBI Life SciencesA600560
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
3x FLAG peptideSigmaF4799
Octet-RED96Pall/FortéBio30-5048
Data Acquisition softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Data Analysis softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Biosensor/StreptavidinPall/FortéBio18-5019
Microtiter plateGreiner Bio-one655209
Sulfo-NHS-LC-LC-BiotinThermoFisher21338
Centrifugal MachineThermoFisher75004250
PageRuler Prestained Protein LadderThermoScientific318120
Ultrafiltration deviceMILLIPOREUFC503008NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)SigmaP9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibodySigmaF18041:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20051:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotimeP0010
Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04693159001
Amersham Imager 600 Imaging SystemGE Healthcare Bio-Sciences
Western blot systemBIO-RAD

参考文献

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