Capturer la cinétique de l’Interaction d’une protéine canal ionique avec petites molécules par le dosage de l’interférométrie Bio-couche

Résumé

Le protocole ici décrit les interactions de protéine purifiée hEAG1 de canal ionique avec la petite molécule lipidique ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP₂). La mesure démontre que BLI pourrait être une méthode potentielle pour le dépistage de nouvelles petites molécules ion canal ligand.

Résumé

L’essai de l’interférométrie (BLI) bio-couche est un outil précieux pour la mesure des protéines et des interactions entre protéines à petites molécules. Nous décrivons ici tout d’abord l’application de cette nouvelle technique exempte d’étiquette pour étudier l’interaction des humains EAG1 protéines de canal (hEAG1) avec la petite molécule PIP₂. canal de hEAG1 a été reconnu comme cible thérapeutique potentielle en raison de son aberrante surexpression dans les cancers et des mutations de gain de fonction un peu impliqués dans certains types de maladies neurologiques. Nous avons purifié hEAG1 protéines de canal d’un système d’expression stable chez les mammifères et mesuré l’interaction avec PIP₂ par BLI. La mesure efficace de la cinétique de la liaison entre la protéine hEAG1 et PIP₂ montre que le dosage BLI est une approche de haut débit potentielle utilisée pour le dépistage de nouvelles petites molécules ligand en pharmacologie des canaux ioniques.

Introduction

Ciblant les protéines de canal cellulaire ion surface accessible avec petites molécules offre un énorme potentiel pour le dépistage de ligand et découverte de médicaments biologiques^1,2,3. Ainsi, un outil approprié est nécessaire pour l’étude de l’interaction entre les canaux ioniques et de petites molécules et de leur fonction correspondante. L’enregistrement de patch-clamp a été démontrée pour être une technique unique et irremplaçable dans test fonctionnel de canal ionique. Toutefois, déterminer si les petites molécules ciblent directement les canaux ioniques nécessitent des autres technologies. Traditionnellement, l’essai de liaison du ligand radioactif a été utilisé pour observer les cinétiques de liaison entre les petites molécules et de sa protéine cible de canal ionique. Cependant, l’utilisation de cette technique est limitée en raison de son exigence de marquage radioactif et la détection. Par ailleurs, l’étape préalable d’étiqueter le petit ligand dans l’étude empêche son utilisation dans de nombreux types de canaux ioniques sans ligand spécifique connu. Certaines techniques d’étiquette comme NMR spectroscopy, diffraction des rayons x, a petite Echelle thermophorèse (MST)⁴ et résonance plasmonique de surface (SPR) ont été utilisés pour mesurer les interactions de protéine-petite molécule. Mais ces types d’analyses habituellement ne peut pas fournir l’information requise en raison de la difficulté à obtenir la protéine pleine longueur, la faible résolution des dynamique, faible débit et le coût élevé de⁵. Contrairement à ces techniques, bio-couche interférométrie (BLI) s’impose comme une roman méthodologie exempte d’étiquette pour surmonter ces inconvénients pour la détection des interactions de protéine-petite molécule par un échantillon de protéines en petites quantités sur les surfaces de l’immobilisation Biocapteur et mesurer le changement d’optique des signaux^6,7. Comme une plateforme de biocapteurs prometteur, technique de BLI est déjà effectuée pour observer l’interaction de petites molécules avec de l’eau naturelle des protéines solubles comme un anticorps monoclonal humain CR8020⁸ et la procédure de test détaillée a été rapportée chez un précédent article⁹. Bien que le rôle clé de protéine canal ionique pour une nouvelle découverte de cibles thérapeutiques a été reconnu, le dosage d’interaction de protéine-petite molécule canal d’ion basée sur BLI n’a pas été décrite.

L’homme l’éther à Go-Go canaux (hEAG1) est exprimés dans divers types de cellules cancéreuses et du système nerveux central qui en fait la canal cible thérapeutique potentielle a de nombreux cancers et troubles neuronaux^{10,11, 12,13,14}. L’étude électrophysiologique dans notre laboratoire a confirmé l’effet inhibiteur du phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP₂) le hEAG1 canal¹⁵. Selon nos résultats, essais PIP₂ directement l’interaction avec le hEAG1 en utilisant BLI technique peut être un modèle pour d’autres types d’interaction composé de molécule de protéine de petit canal ionique spécialement pour ces chaînes manquent des ligands spécifiques. Conformément aux instructions de dosage BLI, nous avons préparé biotinylé protéines hEAG1 et eux immobilisé sur la surface de streptavidine (SA) conseils de biocapteurs ont suivis par interaction aux solutions₂ PIP pour observer leur liaison directe entre le les protéines et les lipides. Après que la fixation de PIP₂ sur la surface recouverte de hEAG1 protéine, l’épaisseur de la couche sur la surface augmente, qui met en corrélation le décalage spectral directement et peut être mesurée en temps réel¹⁶. La cinétique de liaison peut être déterminée en raison d’un changement positif dans l’étape de l’association et un déplacement négatif à l’étape de dissociation. Selon ce principe, nous purifiée de la protéine de canal ionique hEAG1 fonctionnelle du système d’expression stable HEK-239T en utilisant la méthode de purification d’affinité pour maintenir l’État fonctionnelle in vitro , puis mesuré les cinétiques de liaison de différente concentration PIP₂et donné une semblable données cinétiques tel qu’observé dans des mesures électrophysiologiques,¹⁵. L’étroite correspondance entre les résultats de la BLI et mesures électrophysiologiques démontrent pour la première fois la pertinence du BLI comme un outil d’analyse approprié pour l’interaction protéine-petite molécule ion canal membranaire.

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Protocole

Remarque : La lignée de cellules HEK-293 t exprimant continuellement FLAG-le tag hEAG1 protéine du canal est construite par transfectants un plasmide LENTIVIRAUX pCDH contenant la séquence d’ADN de hEAG1 avec un drapeau à l’extrémité C-terminale distale dans les cellules HEK-293 t suivie par la résistant à la puromycine sélection décrite précédemment¹⁵.

1. affinity Purification de drapeau-le tag hEAG1 canal protéique des cellules HEK-293 t

1. Décongelez les cellules exprimant de manière stable des chaînes de hEAG1 de l’azote liquide dans l’eau chaude (37 ° C) rapidement. Les cellules (environ 5 x 10⁶ congelés des cellules) des graines dans un plat de 10 cm. Croissance de la cellule pendant la nuit dans modifiée de l’aigle de Dulbecco (DMEM) additionné de sérum bovin fœtal de 8 mL 10 % (FBS), 100 unités/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 4 mM de L-glutamine et changé le milieu le lendemain.
2. Vérifier la fluorescence GFP de ces cellules HEK-293 t en utilisant un microscope à fluorescence pour s’assurer que le pourcentage élevé de cellules stablement express hEAG1 canaux dans le système de culture. Exponentiellement trypsinize les cellules en croissance avec 1 mL de 0,25 % de trypsine pendant 1 min à température ambiante et thenadd 2 mL de milieu de culture contenant du sérum de mettre fin à la digestion. Transférer 400 ml de suspension cellulaire dans un plat de 15 cm contenant 15 mL de milieu DMEM complet. Préparer quatre plats de 15 cm au total.
3. La récolte de ces cellules après 2 – 3 jours culture lorsque les cellules atteignent environ 90 % confluence.
   1. Enlever le milieu de croissance des cellules et laver deux fois avec 4 mL de tampon phosphate salin (1 x PBS, pH = 7,4).
   2. Éliminez le PBS après lavage.
   3. Racler les cellules dans PBS 1 x 2 mL pour chaque plat à l’aide de gratter de la cellule et le transfert des cellules grattées avec 1 mL pipette dans un tube de 15 mL.
   4. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 420 x g à 4 ° C.
   5. Décanter et éliminer le surnageant.
   6. Resuspendre le culot cellulaire au total 4 mL de tampon de lyse (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM NaCl, 1 % NP-40, pH 7.0, inhibiteur de la protéase complet confinée) pendant 30 minutes sur la glace et vortex soigneusement le lysat toutes les 10 min.
   7. Centrifuger la cellule lysate pendant 10 min à 12 000 x g à 4 ° C.
   8. Transférer le surnageant dans un tube de 5 mL et gardez-le sur la glace pour une utilisation immédiate.
4. Préparer la résine Anti-Flag M2.
   1. Bien suspendre la résine (fournie sous forme de suspension dans un tampon magasin 50 %) par inversion douce pour s’assurer que la bouteille de gel d’Anti-Flag M2 affinité est une suspension uniforme de billes de gel.
   2. Transférer immédiatement 400 μl de suspension dans un tube réfrigéré 1,5 mL.
   3. Centrifuger la suspension pendant 30 s à 8, 000 x g à 4 ° C et éliminer le liquide surnageant avec soin de laver le tampon du magasin.
   4. Ajouter 500 μL 1 x PBS à la résine et suspendre le culot avec pipette 1 mL. Centrifuger la suspension pendant 30 s à 8, 000 x g à 4 ° C et jeter le surnageant PBS avec soin. Répétez ces pas de lavage pour effacer la mémoire tampon stockée.
5. Ajouter 500 μl protéine extrait de surnageant préparé à l’étape 1.3.8 à la pastille de résine pour suspendre le culot et transférer la suspension dans un nouveau tube réfrigéré 5 mL. Répétez cette étape pour s’assurer ne billes de gel à gauche. Ajouter l’extrait de protéine gauche au mélange.
6. Incuber le mélange toute la nuit sur un agitateur à 8 tr/min à 4 ° C pour capturer la protéine de fusion de drapeau.
7. Centrifuger le mélange après 12 h d’incubation à 10 min à 1, 000 x g à 4 ° C.
8. Jeter le surnageant et laver le culot trois fois avec 500 μl de PBS 1 x. Gardez-le sur la glace pour une utilisation immédiate.
9. Protéine d’élution le drapeau hEAG1 avec 3 x peptide de drapeau.
   1. Préparer la solution d’élution 3 X FLAG. Dissoudre 3 peptide X FLAG dans la solution mère de 500 μL (0,5 M 1 M NaCl, Tris-HCl pH = 7,5) à une concentration de 8 μg/μL.
   2. Ajouter 10 μL de 3 x solution d’élution drapeau à 390 μL de PBS comme une solution de concentration finale de 200 ng/μl.
   3. Ajouter 400 ml de solution d’élution du pavillon de 3 x pour les billes de gel préparés à l’étape 1.8.
   4. Incuber l’échantillon à l’agitateur à 8 tr/min pendant 2 h à 4 ° C.
   5. Centrifuger la résine pendant 30 s à 8, 000 x g.
   6. Transférer le surnageant dans un tube de frais 1,5 mL et conserver à 4 ° C pour une utilisation immédiate.

2. concentration dosage et Confirmation du drapeau purifiée Fusion hEAG1 par BCA Protein Assay Kit et Western Blotting

1. Déterminer la concentration de protéine purifiée à l’aide de la trousse de dosage de protéine BCA selon les instructions du fabricant.
2. Utiliser 30 μL échantillon pour analyse occidentale pour confirmer que la protéine d’intérêt avait été purifiée en utilisant un anticorps anti-drapeau comme décrit précédemment¹⁵.

3. étiquetage la protéine purifiée de canal avec de la biotine pour le dosage BLI

1. Préparer 5 mg/mL solution biotine dans du PBS. Pour chaque test (deux biocapteurs), ajouter un excès molaire 3 fois de biotine à 20 μg purifiée de protéines pour atteindre une préférable biotinylation N-terminale de la protéine purifiée dans du PBS.
2. Incuber l’échantillon dans l’obscurité sur la glace pendant au moins 30 min.
3. Préparer le tampon de dilution (SD) : PBS avec 0,02 % polysorbate 20 et 0,1 % albumine sérique bovine (BSA, pH 7,4).
4. Effectuer l’ultrafiltration pour modifier la mémoire tampon de la protéine purifiée canal au tampon de SD. Retirez la biotine indépendante en utilisant le dispositif de l’ultrafiltration avec seuil de poids moléculaire de 30 kDa, ajoutant de la mémoire tampon de SD et centrifugation de l’échantillon à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
5. Retirez l’ultrafiltrate le tube à centrifuger de dispositif d’ultrafiltration, ajouter 200 μL de tampon de SD dans le dispositif de filtration et de centrifugation de l’échantillon à 12 000 x g pendant 10 min à 4° C. Répétez cette opération au moins trois fois.
6. Pour collecter la mémoire tampon échangée, échantillon, inversé Insérez le périphérique de filtre dans un tube de 1,5 mL et eux centrifugation à 2 000 g, pendant 5 min à 4 ° C. Conserver l’échantillon sur la glace pour une utilisation immédiate.

4. préparation de la Solution₂ PIP pour dosage

1. Préparer la solution de PIP₂ (1 mM) dans désionisée H₂O par sonification pendant 30 min sur glace comme décrit précédemment¹⁷. Conserver la solution dans des flacons en verre à-20 ° C et le diluer pour les concentrations finales immédiatement avant les expériences par agitation vigoureuse.

5. BLI Assay

1. Allumez l’appareil et vérifier la fenêtre « statut d’instrument » pour confirmer que la machine est à l’état « prêt » à préchauffer l’appareil au moins pendant 30 min avant l’étude BLI.
2. Assurez-vous que la porte de l’instrument est fermée avant d’ouvrir le logiciel d’Acquisition de données et sur la « nouvelle expérience cinétique » dans l’Assistant de l’expérience.
3. Définir les puits à utiliser sur la plaque à 96 puits par clic droit choisir tampon, charge et échantillon. Pour les puits d’échantillon, l’unité de concentration de protéine de hEAG1 biotinylé drapeau fusion devrait être entrée comme molaire (10 μg, 0,09 μM).
4. Définir les étapes de test, y compris chargement, association et dissociation de base. Choisissez une étape de test et cliquez deux fois sur la colonne respective. Un double de la définition de dosage est défini pour les capteurs de contrôle. Définir le nombre de tours que 1000. Choisissez 1 min pour l’étape de base à 5 – 10 min pour le chargement, association et dissociation, respectivement. Effectuer l’essai à température ambiante (environ 24 ° C).
   Remarque : Il existe deux méthodes principales : la protéine du canal biotinylé aux capteurs de chargement et analyse de l’interaction avec les petites molécules. Ils peuvent être procédés en continu (base, chargement, baseline, association et dissociation). Alternativement, ils peuvent être traitées séparément pour ne pas gaspiller les composés d’essai lorsque le premier chargement partie infructueuse.
5. Cliquez sur les colonnes qui contiennent les capteurs, puis cliquez sur le « remplissage » pour indiquer l’emplacement des capteurs dans le plateau de la sonde.
6. Examiner des mesures tout planifiés pour vérifier pour les erreurs et de revenir en arrière pour y remédier.
7. Définir l’emplacement des fichiers de données et cliquez sur « Go » pour démarrer le test.
   Remarque : Les capteurs doivent prewetted pendant au moins 10 min dans un tampon de la SD, si cette étape n’a été faite, alors le paramètre « Retardé le début de l’expérience » doit être ignoré. Si ce n’est pas le cas, définissez un délai s 600 avant humidifié les capteurs.
8. Mettre une plaque à 96 puits noire dans le fond du bac et insérer le coin A1 de la plaque dans l’encoche située sur le plateau de la plaque de siège. Pour les puits charger les capteurs, 200 μL de tampon / puits ajouter dans 2 puits à la ligne A et 2 puits à la ligne B de la plaque à 96 puits.
9. Préparer une autre plaque à 96 puits noire comme la plaque d’échantillon et remplir les puits avec 200 μL SD de tampon à la ligne B sous contrôle ou biotinylé hEAG1 solution de protéine (10 μg) à la ligne A attribué lors de la programmation à l’étape 5.3.
   NOTE : Éviter l’introduction de bulles.
10. Ouvrir la porte de l’instrument et insérez le plateau sonde et plaque l’échantillon dans le porte-plaque droite et gauche, respectivement. Vérifier que la plaque de plateau et échantillon de capteur sont positionnés correctement en fonction de la forme du support de plaque gauche et le marqueur « A1 » dans le coin supérieur droit du titulaire de la plaque de droite. Fermer la porte et commencez le test.

6. analyse de données

1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données et le dossier contenant les données de test de charge. Cliquez sur « Processing » pour entrer dans l’interface du menu traitement et nous pouvons voir les courbes de cinétiques bruts colorés.
2. Sous étape 1: « La sélection de données », cliquez sur « Sélection de capteur ». Sur le « capteur plateau #1 », cliquez sur les puits de capteur seulement humidifiée avec du tampon de SD et faites un clic droit de « Modifier le Type de capteur » à « Capteur de référence ». Sur la ' carte de plaque échantillon », désigner tous les puits de non-spécifiques et faites un clic droit de « Changement bien Type » pour « Référence bien ».
3. Cocher dans la boîte avant de « Soustraction » de l’étape 2 et le point « Double référence ».
4. À l’étape 3: « Aligner Y Axis », sélectionnez « De base » comme l’étape de l’alignement. Pour « Plage horaire », entrer dans les 10 derniers s de cette ligne de base (c'est-à-dire de : 0,1 à : 59,8).
5. À l’étape 4: « inter-Étape Correction », sélectionnez « Aligner à ligne de base » pour minimiser les déplacements de signal entre les étapes de l’association et de dissociation.
6. À l’étape 5: « Processus », sélectionnez la fonction de filtrage Savitzky-Golay dans la plupart des cas et procéder « Traiter les données ».
7. Enregistrer les données brutes pour une analyse ultérieure données à l’aide d’autres logiciels à l’étape 7 : « Enregistrer les résultats ».
8. Cliquez sur « analyse | Ajustement de courbe ».
   1. « Étape à analyser », choisissez « Association | Dissociation ». Pour le « Modèle », sélectionnez 1:1.
      Remarque : nous choisissons 1:1 modèle car il monté bien sur nos données d’origine et d’éviter la possibilité de sur raccord sous 1 / 2 ou 2:1 modèle en raison de leur plus grande liberté. Mais les autres options sont disponibles ici et peuvent être convenablement choisies pour toute autre analyse de montage pour les modèles de liaison différente de l’analyte.
   2. « Raccord », choisissez Global (complet). Pour « Group By », sélectionnez « Couleur ». Sélectionnez « Rmax non-liés par capteur » pour permettre un montage indépendant de la réponse de signal maximal (Rmax).
   3. Cliquez sur « Fit courbes ! » pour commencer l’analyse de régression non linéaire. Équation de Hill et de la fonction exponentielle simple ont été utilisés dans notre étude.
   4. Cliquez sur « exporter des données | Enregistrer le rapport » pour sauver la mise en place des résultats. Ou cliquez sur « exporter des données | Exporter les résultats de l’ajustage de précision » pour enregistrer les données brutes pour l’analyse de données et de graphiques supplémentaires avec d’autres logiciels.

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Résultats

Nous avons purifié la protéine de canal de hEAG1 de fusion drapeau de hEAG1 stablement surexprimée de cellules HEK-293 t. La fonction de cette protéine de fusion a été démontrée en utilisant la méthode de patch clamp et la qualité et la spécificité de la protéine purifiée sont confirmées par Western blot (Figure 1). La protéine purifiée de canal est biotinylé pour effectuer une analyse de l’interaction avec les lipides (PIP₂) à...

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Discussion

Canaux ioniques membranaires ont été vérifiées comme les principales cibles thérapeutiques de plus de 13 % des médicaments connus pour le traitement d’une variété de maladies humaines, y compris les troubles cardiovasculaires et neurologiques,¹⁸. Patch-clamp de l’enregistrement, la méthode de référence pour mesurer le fonctionnement des canaux ioniques à petites molécules, a été utilisée pour les ligands de canal d’ion de dépistage. Cependant, ces approches électrophysiolog...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/High Glucose Medium	HyClone	SH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x)	HyClone	SH30256.01
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270
Penicillin/Streptomycin	Gibco	1697550
Cell Culture Dish	Corning	430599	150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 Substitute	Amresco	E109
Sodium chloride	BBI Life Sciences	A610476
Potassium chloride	BBI Life Sciences	A610440
Bovine Serum Albumin	BBI Life Sciences	A600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate	BBI Life Sciences	A600560
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
3x FLAG peptide	Sigma	F4799
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 7.1
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 7.1
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin	ThermoFisher	21338
Centrifugal Machine	ThermoFisher	75004250
PageRuler Prestained Protein Ladder	ThermoScientific	318120
Ultrafiltration device	MILLIPORE	UFC503008	NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)	Sigma	P9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody	Sigma	F1804	1:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	1:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0010
Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04693159001
Amersham Imager 600 Imaging System	GE Healthcare Bio-Sciences
Western blot system	BIO-RAD