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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo qui descrive le interazioni della proteina canale dello ione di hEAG1 purificato con la piccola molecola lipidica ligando fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato (PIP2). La misurazione dimostra che BLI potrebbe essere un metodo potenziale per lo screening di romanzo della piccolo-molecola ioni canale ligando.

Abstract

Il dosaggio di interferometria (BLI) bio-strato è un prezioso strumento per la misurazione della proteina-proteina e proteina-piccola molecola interazioni. Qui, descriviamo in primo luogo l'applicazione di questa tecnica novella privo di etichetta per studiare l'interazione del umano EAG1 proteine canale (hEAG1) con la piccola molecola PIP2. canale di hEAG1 è stato riconosciuto come potenziale bersaglio terapeutico a causa della sua sovraespressione aberrante nei cancri e poche mutazioni con guadagno di funzione coinvolti in alcuni tipi di malattie neurologiche. Abbiamo purificato proteine canale hEAG1 da un sistema di espressione stabile dei mammiferi ed abbiamo misurato l'interazione con PIP2 da BLI. La misurazione eseguita con successo della cinetica di legame tra proteina hEAG1 e PIP2 dimostra che il dosaggio BLI è un potenziale approccio di alto-rendimento utilizzato per lo screening di romanzo della piccolo-molecola ligando in farmacologia canale ionico.

Introduzione

Le proteine di canale cella agli ioni superficie-accessibile con piccole molecole di targeting offre un enorme potenziale per lo screening di ligando e biologici droga scoperta1,2,3. Quindi, è necessario uno strumento adeguato per lo studio dell'interazione tra canale ionico e piccole molecole e loro funzione corrispondente. La registrazione di patch-clamp ha dimostrata di essere una tecnica unica e insostituibile nell'analisi funzionale di canale ionico. Tuttavia, determinare se le piccole molecole bersaglio direttamente i canali ionici richiedono altre tecnologie. Tradizionalmente, il test di associazione di ligand radioattivo fu utilizzato per osservare la cinetica del legame tra piccola molecola e la sua proteina di canale ionico di destinazione. Tuttavia, l'utilizzo di questa tecnica è limitata a causa del relativo requisito in etichettatura radioattivo e rilevamento. Inoltre, il passaggio dei prerequisiti per etichettare il ligando piccolo nello studio impedisce al utilizzando in molti tipi di canali ionici senza ligando specifico noto. Alcune tecniche privo di etichetta come spettroscopia NMR, diffrazione di raggi x, Microscala submicronica (MST)4 e risonanza plasmonica di superficie (SPR) sono stati utilizzati per misurare le interazioni della proteina-piccola molecola. Ma questi tipi di analisi di solito non possono fornire informazioni sufficienti a causa della difficoltà di ottenere le proteine full-length, bassa risoluzione di dinamiche, bassa velocità effettiva e costo elevato5. In contrasto con queste tecniche, bio-strato interferometria (BLI) sta emergendo come una nuova metodologia privo di etichetta per ovviare a questi inconvenienti per la rilevazione di interazioni proteina-piccola molecola di immobilizzare una piccole quantità di campione della proteina sulle superfici del biosensori e misura il cambiamento ottico segnali6,7. Come una promettente piattaforma biosensore, tecnica di BLI è già effettuato per osservare l'interazione di piccole molecole con acqua naturale proteine solubili come un anticorpo monoclonale umano CR80208 e la procedura dettagliata è stata segnalata in un precedente articolo9. Anche se è stato riconosciuto il ruolo chiave della proteina canale dello ione per l'individuazione di nuovi bersagli terapeutici, il dosaggio di interazione ione canale proteina-piccola molecola basato su BLI non è stata descritta.

L'essere umano canali etere à go-go (hEAG1) sono espressi in vari tipi di cellule tumorali e sistema nervoso centrale che rende il canale un potenziale bersaglio terapeutico di molti tipi di cancro e disordini di un neurone10,11, 12,13,14. Lo studio elettrofisiologico nel nostro laboratorio ha confermato l'effetto inibitorio di fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato (PIP2) su hEAG1 canale15. Basato sui nostri risultati, test PIP2 direttamente l'interazione con il hEAG1 usando BLI tecnica può essere come un modello per altri tipi di ioni canale proteina-piccola molecola interazione composto specialmente per quei canali che mancano ligandi specifici. Secondo le istruzioni di dosaggio BLI, abbiamo preparato biotinilati hEAG1 proteine e loro immobilizzato sulla superficie della streptavidina (SA) consigli di biosensore di interazione li seguirono alla soluzioni di2 PIP per osservare il loro legame diretto tra il proteina e del lipido. Dopo l'allegato di PIP2 la superficie rivestita della proteina hEAG1, lo spessore dello strato sulla superficie aumenta, che direttamente correla lo spostamento spettrale e può essere misurato in tempo reale16. La cinetica di legame può essere determinata a causa di un cambiamento positivo nel passaggio di associazione e uno spostamento negativo nel passaggio di dissociazione. Secondo questo principio, abbiamo purificato la proteina di canale di ioni hEAG1 funzionale da HEK-239T espressione stabile sistema utilizzando il metodo di purificazione di affinità per mantenere lo stato funzionale in vitro , poi misurata la cinetica di legame di differenti concentrazioni PIP2e ha reso un come dati cinetici, come osservato in misurazioni elettrofisiologiche15. La stretta corrispondenza tra i risultati dalla BLI e misurazioni elettrofisiologiche dimostrano per la prima volta l'idoneità di BLI come strumento analitico appropriato per l'interazione proteina-piccola molecola di ioni canale membrana.

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Protocollo

Nota: La linea cellulare HEK 293T continuamente esprimendo la bandierina-etichettate hEAG1 proteina canale viene creata dalla trasfezione un plasmide lentivirali pCDH contenente la sequenza di DNA di hEAG1 con una bandiera al C-terminale distale in cellule HEK 293T seguita dal selezione con puromicina-resistente come precedentemente descritto15.

1. affinità purificazione della proteina di hEAG1 canale Bandierina-etichettate da cellule HEK 293T

  1. Scongelare le cellule che esprimono hEAG1 canali da azoto liquido in acqua tiepida (37 ° C) rapidamente. Le cellule (circa 5 x 106 congelati cellule) del seme in un piatto di 10 cm. Crescere la cella durante la notte in per volta Eagle di Dulbecco (DMEM) medium completato con 10% 8 mL di siero fetale bovino (FBS), 100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 4 mM L-Glutammina e cambiato il mezzo il giorno successivo.
  2. Controllare la fluorescenza di GFP di queste cellule HEK 293T utilizzando un microscopio a fluorescenza per assicurarsi che l'alta percentuale delle cellule stabilmente express hEAG1 canali nel sistema di coltura. Tripsinizzano in modo esponenziale le cellule in crescita con 1 mL di tripsina 0,25% per 1 min a temperatura ambiente e thenadd 2 mL di liquido della coltura contenenti siero per terminare la digestione. Trasferimento 400 µ l di sospensione cellulare in un piatto di 15cm contenente 15 mL di terreno DMEM completo. Preparare quattro piatti di 15 cm in totale.
  3. Raccogliere queste cellule dopo 2 – 3 giorni quando le cellule raggiungono circa il 90% della coltura confluency.
    1. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule e lavare due volte con 4 mL di tampone fosfato salino (1x PBS, pH = 7.4).
    2. Scartare PBS dopo il lavaggio.
    3. Raschiare le cellule in 2 mL di PBS 1X per ogni piatto tramite raschiatura di cella e trasferimento delle cellule raschiate con 1 mL pipettare in una provetta da 15 mL.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 420 x g a 4 ° C.
    5. Decantare e scartare il surnatante.
    6. Risospendere il pellet cellulare in totale 4 mL di tampone di lisi (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 millimetri di NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, inibitore della proteasi completa contenuta) per 30 min in ghiaccio e vortice accuratamente il lisato ogni 10 min.
    7. Centrifugare la cella lysata per 10 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    8. Trasferire il surnatante in una provetta da 5 mL e tenerlo sul ghiaccio per un uso immediato.
  4. Preparare la resina di affinità M2 anti-FLAG.
    1. Sospendere completamente la resina (fornita come sospensione 50% nel buffer del negozio) capovolgendo delicatamente per assicurarsi che la bottiglia di gel di affinità di anti-bandiera M2 è una sospensione uniforme di gel di perline.
    2. Trasferire immediatamente 400 μL di sospensione in una provetta refrigerati 1,5 mL.
    3. Centrifugare la sospensione per 30 s a 8, 000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante con attenzione per lavare fuori il buffer del negozio.
    4. Aggiungere 500 μL 1X PBS alla resina e sospendere la pallina con pipetta da 1 mL. Poi Centrifugare la sospensione per 30 s a 8, 000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante PBS con attenzione. Ripetere questi passaggio di lavaggio per cancellare il buffer memorizzato.
  5. Aggiungere 500 surnatante di estratto proteico μL preparato al punto 1.3.8 per il pellet di resina per sospendere il pellet e trasferire la sospensione ad un nuovo tubo 5ml refrigerati. Ripetere questo passaggio per non assicurarsi che nessun gel perline sinistra. Aggiungere l'Estratto di proteine sinistra alla miscela.
  6. Incubare la miscela durante la notte su un agitatore a 8 giri/min a 4 ° C per catturare la proteina di fusione di bandiera.
  7. Centrifugare la miscela dopo 12 h di incubazione per 10 min a 1, 000 x g a 4 ° C.
  8. Scartare il surnatante e lavare la pallina tre volte con 500 μL di PBS 1X. Tenere sul ghiaccio per un uso immediato.
  9. Proteina di eluizione hEAG1 la bandiera con 3x peptide FLAG.
    1. Preparare soluzione per eluizione FLAG X 3. Sciogliere 3 peptide X FLAG in 500 μL di soluzione stock (0,5 M Tris-HCl, NaCl di 1m, pH = 7.5) ad una concentrazione di 8 μg/μL.
    2. Aggiungere 10 μL di 3 x soluzione per eluizione da bandiera a 390 μL di PBS per essere una soluzione di concentrazione finale di 200 ng/μL.
    3. Aggiungere 400 μL di soluzione per eluizione bandiera x 3 per le perline di gel preparate al punto 1.8.
    4. Incubare il campione a shaker a 8 giri per 2 ore a 4 ° C.
    5. Centrifugare la resina per 30 s a 8, 000 x g.
    6. Trasferire il surnatante in una provetta di fresco 1,5 mL e conservarla a 4 ° C per un uso immediato.

2. concentrazione analisi e conferma della bandiera purificato Fusion hEAG1 di BCA Protein Assay Kit e Western Blotting

  1. Determinare la concentrazione della proteina purificata utilizzando il kit di dosaggio di proteina BCA secondo istruzioni di fabbricazione.
  2. Utilizzare 30 μL di campione per analisi occidentale per confermare che la proteina di interesse era stata purificata utilizzando un anticorpo anti-FLAG come descritto in precedenza15.

3. etichettatura la proteina purificata canale con biotina per il dosaggio BLI

  1. Preparare 5 mg/mL soluzione stock di biotina in PBS. Per ogni prova (due biosensori), è possibile aggiungere un 3 volte eccesso molare di biotina a 20 μg purificato proteina per raggiungere un preferibile biotinylation N-terminale della proteina purificata in PBS.
  2. Incubare il campione al buio sul ghiaccio per almeno 30 min.
  3. Preparare il tampone di diluizione (SD) campione: PBS con 0,02% polisorbato 20 e 0.1% sieroalbumina bovina (BSA, pH 7.4).
  4. Eseguire ultrafiltrazione per modificare il buffer della proteina purificata canale al buffer di SD. Rimuovere la biotin non utilizzando il dispositivo di ultrafiltrazione con peso molecolare di taglio di 30 kDa, aggiungendo il buffer di SD e centrifugazione del campione a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C.
  5. Togliere la provetta da centrifuga del dispositivo di ultrafiltrazione, l'ultrafiltrato aggiungere 200 μL SD buffer nel dispositivo di filtro e centrifugazione del campione a 12.000 x g per 10 min a 4° C. Ripetere questa operazione almeno tre volte.
  6. Per raccogliere il buffer scambiato campione, invertito inserire il dispositivo di filtro in una provetta da 1,5 mL e li centrifugazione a 2.000 x g, per 5 min a 4 ° C. Mantenere il campione sul ghiaccio per un uso immediato.

4. preparazione della soluzione di2 PIP per dosaggio

  1. Preparare la soluzione di riserva di PIP2 (1 mM) in deionizzata H2O di sonicating per 30 min in ghiaccio come descritto in precedenza17. Conservare la soluzione in fiale di vetro a-20 ° C e diluirlo per le concentrazioni finali immediatamente prima di esperimenti vigoroso nel Vortex.

5. BLI Assay

  1. Accendere l'apparecchio e controllare la finestra "stato dello strumento" per confermare che la macchina è in stato "pronto" per preriscaldare l'attrezzatura almeno per 30 min prima dello studio BLI.
  2. Assicurarsi che la porta dello strumento sia chiuso prima di aprire il software di acquisizione dati e scegliere il "esperimento di cinetica di nuovo" della procedura guidata di esperimento.
  3. Definire i pozzetti per essere utilizzato sulla piastra 96 pozzetti da tasto destro del mouse scegliere buffer, carico e campione. Per pozzetti, l'unità di concentrazione biotinilati bandiera hEAG1 della proteina di fusione dovrebbe essere input come molare (10 μg, 0.09 μM).
  4. Definire la procedura di analisi tra cui la linea di base, caricamento, associazione e dissociazione. Scegliere un passo di test e fare doppio clic sulla rispettiva colonna. Un duplicato di definizione di dosaggio è impostato per sensori di controllo. Impostare il numero di giri come 1.000. Scegliere 1 min per il passaggio della linea di base e 5 – 10 min per caricamento, associazione e dissociazione, rispettivamente. Eseguire il test a temperatura ambiente (circa 24 ° C).
    Nota: Ci sono due procedure principali: la proteina canale biotinilati ai sensori di carico e analizzando l'interazione con i composti di piccole molecole. Essi possono essere continuati continuamente (linea di base, caricamento, baseline, associazione e dissociazione). In alternativa, può essere continuati separatamente per evitare di sprecare i composti di prova quando il caricamento primo parte soccombente.
  5. Selezionare le colonne che contengono i sensori e fare clic su "Riempimento" per indicare le posizioni dei sensori nella barra sensore.
  6. Rivedere i passi tutto pianificati per verificare gli errori e tornare indietro per correggerli.
  7. Impostare il percorso del file di dati e fare clic su "Go" per avviare il test.
    Nota: I sensori hanno bisogno prewetted per almeno 10 min nel buffer di SD, se questo passaggio è stato fatto, quindi è necessario ignorare l'impostazione "Esperimento partenza ritardata". In caso contrario, impostare un ritardo di s 600 prima preumidificare i sensori.
  8. Mettere una piastra a 96 pozzetti nera nella parte inferiore del vassoio e inserire l'angolo di A1 della piastra nella tacca sul vassoio per la piastra del sedile. Per i pozzi caricare i sensori, 200 μL di tampone per pozzetto riaggiungere 2 pozzi nella riga A e 2 pozzi nella riga B della piastra 96 pozzetti.
  9. Preparare un'altra piastra a 96 pozzetti nera come piatto del campione e riempire i pozzetti con 200 μL SD tampone nella riga B come controllo o biotinilati hEAG1 soluzione proteica (10 μg) nella riga A come assegnate durante la programmazione al punto 5.3.
    Nota: Evitare di introdurre bolle.
  10. Aprire la porta dello strumento e inserire il vassoio di sensore e piastra di esempio nel supporto piatto sinistro e destro, rispettivamente. Controllare che la piastra di vassoio e campione del sensore siano posizionati correttamente basato sulla forma del portatarga sinistra e l'indicatore "A1" in alto a destra della destra portatarga. Chiudere la porta e avviare il test.

6. analisi dei dati

  1. Aprire il software di analisi dei dati e caricare la cartella che contiene i dati di analisi. Fare clic su "Elaborazione" per entrare nell'interfaccia del menu elaborazione e possiamo vedere le curve cinetiche crude colorate.
  2. In Step1: "Selezione di dati", fare clic su "Selezione sensore". In "Sensore vassoio #1", fare clic sui pozzi di sensore solo a contatto con il tampone di SD e fare clic con il pulsante destro "Modifica sensore tipo" a "Sensore di riferimento". Il la ' mappa di esempio piastra ", designare tutti i pozzi di legame non specifico e fare clic con il pulsante destro"Modifica bene tipo"a"Riferimento bene".
  3. Spunta nella casella prima di "Sottrazione" del passaggio 2 e scegliere "Doppio riferimento".
  4. Nel passaggio 3: "Asse Y allineare", selezionare "Baseline" come il punto di allineamento. Per "Intervallo di tempo", inserire le ultime 10 s di quella linea di base (cioè da: 0,1 a: 59,8).
  5. Nel passaggio 4: "Inter-fase di correzione", selezionare "allineamento alla linea di base" per ridurre al minimo segnale turni tra le operazioni di associazione e dissociazione.
  6. Nel passaggio 5: "Processo", selezionare la funzione di filtraggio Savitzky Golay nella maggior parte dei casi e procedere "Dati di processo".
  7. Salvare i dati grezzi per ulteriore analisi di dati utilizzando un altro software in Step 7: "Save Results".
  8. Fare clic su "analisi | Curve Fitting".
    1. Per "Passaggio per analizzare", scegliere "associazione | Dissociazione". Per "Modello", selezionare 1:1.
      Nota: abbiamo scelto il modello 1:1 perché montato bene sul nostro dati originali ed evitata la possibilità di sopra sotto 1:2 o 2:1 modello a causa della loro elevata libertà. Ma altre opzioni sono disponibili qui e possono essere opportunamente scelti per altre analisi di raccordo per i modelli di associazione diversa dell'analita.
    2. Per «Raccordo», scegliere globale (Full). Per "Group By", selezionare "Colore". Selezionare "Rmax scollegato dal sensore" per consentire il montaggio indipendente di risposta del segnale massimo (Rmax).
    3. Fare clic su "Fit Curve!" per avviare l'analisi di regressione non lineare. Equazione di Hill e singola funzione esponenziale sono stati usati nel nostro studio.
    4. Fare clic su "esportazione dei dati | Salvare il Report"per salvare risultati di montaggio. Oppure fare clic su "esportazione dei dati | Esportare i risultati di raccordo"per salvare i dati grezzi per ulteriori grafici e analisi dei dati con altri software.

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Risultati

Abbiamo purificato la proteina di canale bandiera fusione hEAG1 da HEK 293T cellule stabilmente iperespresso hEAG1. La funzione di questa proteina di fusione è stata dimostrata utilizzando il metodo di patch-clamp e la qualità e la specificità della proteina purificata sono confermati mediante Western blot (Figura 1). La proteina purificata canale è biotinilato per eseguire un test di interazione con i lipidi (PIP2) usando l'analisi in tempo re...

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Discussione

Canali ionici di membrana sono stati verificati come gli obiettivi terapeutici primari di oltre il 13% delle droghe attualmente conosciute per il trattamento di una varietà di malattie umane, tra cui malattie cardiovascolari, neurologiche e18. Patch-clamp di registrazione, il golden standard per la misurazione il funzionale dei canali ionici con piccole molecole, è stato ampiamente usato per ligandi di canale ionico di screening. Tuttavia, tali approcci elettrofisiologici non possono dimostrare ...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da SJTU fondo di ricerca interdisciplinare in medicina e ingegneria (YG2016QN66), Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31271217) e base nazionale ricerca programma della Cina (2014CB910304) e Bio-ID Center.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/High Glucose MediumHyCloneSH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x)HyCloneSH30256.01
Fetal Bovine SerumGibco10270
Penicillin/StreptomycinGibco1697550
Cell Culture DishCorning430599150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 SubstituteAmrescoE109
Sodium chlorideBBI Life SciencesA610476
Potassium chlorideBBI Life SciencesA610440
Bovine Serum AlbuminBBI Life SciencesA600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan MonolaurateBBI Life SciencesA600560
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
3x FLAG peptideSigmaF4799
Octet-RED96Pall/FortéBio30-5048
Data Acquisition softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Data Analysis softwarePall/FortéBioVersion 7.1
Biosensor/StreptavidinPall/FortéBio18-5019
Microtiter plateGreiner Bio-one655209
Sulfo-NHS-LC-LC-BiotinThermoFisher21338
Centrifugal MachineThermoFisher75004250
PageRuler Prestained Protein LadderThermoScientific318120
Ultrafiltration deviceMILLIPOREUFC503008NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)SigmaP9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibodySigmaF18041:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20051:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotimeP0010
Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04693159001
Amersham Imager 600 Imaging SystemGE Healthcare Bio-Sciences
Western blot systemBIO-RAD

Riferimenti

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