Una prueba objetiva y Reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones

Resumen

Aquí capacitamos a ratones en una tarea de aprendizaje asociativo para probar la discriminación de olor. Este protocolo permite también estudios sobre cambios estructurales inducidos por el aprendizaje en el cerebro.

Resumen

Olfato es la modalidad sensorial predominante en los ratones y muchos comportamientos importantes, incluyendo alimentación, detección de depredador, apareamiento y crianza de los hijos. Lo importante, ratones pueden ser entrenados para asociar los olores nuevos de respuestas conductuales específicas para proporcionar la penetración en función del circuito olfatorio. Este protocolo describe el procedimiento para los ratones de entrenamiento en una tarea de aprendizaje operante Go/No-Go. En este enfoque, ratones están entrenados en cientos de pruebas automatizadas diariamente durante 2-4 semanas y luego pueden ser probados en novela Go/No-Go olor los pares para evaluar discriminación olfativa, o ser utilizado para estudios sobre cómo aprender olor altera la estructura o función de la olfativa circuito. Además, el bulbo olfatorio de ratón (OB) cuenta con integración continua de las neuronas nacidas en adulto. Curiosamente, aprendizaje olfativo aumenta la supervivencia y conexiones sinápticas de estas neuronas nacido adulto. Por lo tanto, este protocolo puede combinarse con otras técnicas de bioquímicas, electrofisiológicas y proyección de imagen para el estudio de aprender y dependiente de actividad factores que median en la supervivencia neuronal y la plasticidad.

Introducción

El ratón OB, donde información de olor primero entra en sistema nervioso central (SNC), proporciona un excelente modelo para estudiar cambios estructurales dependen de la experiencia. Contorno OB integra continuamente las neuronas nacidas en adulto de una manera dependiente de la actividad. Precursores de la neurona nacido adulto dividen apagado de progenitores que la zona subventricular adyacente a los ventrículos laterales¹. A migrar en el OB, estos precursores neuronales o sobrevivirán, distinguen e integran como células del gránulo inhibitorio o experimentan apoptosis². Selección de destino de la célula está influenciada por la actividad olfativa, incluyendo aprendizaje olfativo^3,4,5,6. Tras la integración, cambios sinápticos inducidos por el aprendizaje ocurren en células del gránulo durante una semana dos periodo crítico^7,8. Así, los ensayos para el aprendizaje olfativo son útiles para examinar cómo dependiente de la experiencia plasticidad influencias estructurales y funcionales reorganización de un circuito del cerebro maduro.

Este protocolo ofrece una forma de entrenamiento olfativo mediante el uso de un paradigma de condicionamiento operante. En esta tarea, ratones privados de agua están entrenados para asociar un olor (el olor a "Ir") con un premio de agua y otro olor (el olor a "Ninguno") con un castigo de tiempo de espera juicio. Progreso a través de una serie gradual de las fases de la formación a lo largo de 2-4 semanas en ratones. Cuando la formación es completa, ratones responden al olor vaya o prohibido con comportamientos discretos, correspondientes (buscando una recompensa de agua en los ensayos Go y no buscan la recompensa de agua ninguno ensayos) (figura 1A). Después de entrenamiento, ratones pueden ser impugnados más con pares de olores químicamente similares probar la discriminación o se convierten en la transición a estudios de investigación aprendizaje olfativo cómo altera la estructura o función de la OB. Aunque las tareas de discriminación de olores se han descrito previamente, más confían en las medidas subjetivas como el número de aspiraciones entre dos odorantes^9,10. Además, la necesidad de calificación humana de tales tareas es mucho tiempo. La tarea de aprendizaje olfativo de Go/No-Go se describe en este protocolo ofrece una medición imparcial, directa de discriminación de olores y el aprendizaje olfativo.

Protocolo

Todos los ratones fueron utilizados bajo un protocolo aprobado por el Baylor College de medicina institucional Animal Care y uso según estándares de NIH. Ratones en este protocolo fueron los ratones adultos (> 6 semanas de edad) en C57BL6/j de fondo e incluyó ratones masculinos y femeninos. Después de las tareas de formación/puesta en escena, ratones vuelven a su jaula casera.

1. construcción y reglas generales para el uso de operante aprendizaje cuadro (figura 1B, C)

1. Montar una cámara de ratón con fondo de la cámara. Mantener el cuadro de la formación en un tráfico bajo, área de tenue para evitar distracciones.
2. Perforar cada puerto de agua con un pequeño agujero en la parte superior para permitir que una aguja de calibre 18 dispensar agua dentro del puerto.
3. Frasco de vidrio se llenan de olor disuelto en aceite mineral (sustituida a la semana) y apriete firmemente la tapa.
4. Conecte la aguja de calibre 18 a tubo de silicona. Perforar la tapa del frasco de vidrio con aguja de calibre 18 y conecte el otro extremo del tubo de silicona a la entrada de los puertos de olor.
5. Colocar cada tubo de silicona en una válvula de olor.
6. Conecte la línea de vacío a los puertos de olor.
7. Conecte dos jeringas de 10 mL a una varilla de metal holding y conecte la tubería a las jeringas. Conecte el otro extremo de la tubería a una aguja de 18 G. Introducir la aguja en el orificio taladrado del puerto de poke de nariz de la cámara del ratón. Conecte el otro extremo de la tubería a la válvula de agua.
8. Llena las dos jeringas de 10 mL con roedores el agua potable.
9. Conecte un medidor de flujo de aire a la entrada de aire y mantener el flujo de aire en 3 – 5 L/min.
10. Conecte las 2 válvulas de agua, 2 válvulas de olor, 2 puertos de agua, Puerto de olor y poder en el sistema de interfaz USB. Conecte las válvulas a los puertos 'Salida', todos los puertos de agua y olor a 'Input' puertos. Conecte todos los equipos para las salidas de la caja de interfaz USB de potencia y por último, conectar la caja de interfaz USB a corriente.
11. Ajustar la succión del vacío para evitar la contaminación cruzada de olores entre los ensayos.
12. Use tubería de olor específico para conectar frascos de olor a la cámara.

2. ratón preparación: 1 – 3 días

1. Ratones se dividen en 3 grupos: control (no es necesario entrenamiento olfativo), pseudo-entrenados (ratones que reciben la recompensa o el castigo al azar) y grupos. Exponer ratones pseudo-capacitados para la prestación de la formación caja y olor, pero no proporcionan formación olfativa debido al resultado de la recompensa y castigo se asocia al azar con el olor entregado.
   Nota: El grupo pseudo capacitado pasará por el paradigma de la formación en las etapas de "Pseudotraining". Ratones entrenados completará todas las etapas de formación. Pseudotraining es opcional si el propósito del experimento es analizar las diferencias conductuales en discriminación de olor o aprendizaje. El protocolo proporciona que aquí agrega este grupo si el experimentador quiere sondear las diferencias neuronales antes y después del entrenamiento. El grupo pseudotrained entonces control de exposición pasiva olor y formación relacionado no olfativa.
2. Comienza restricción de agua en los ratones a 40 mL/kg/día. Evitar la pérdida de peso mayor al 20% del peso inicial de los animales para evitar sufrimiento (figura 2A).
3. Pesan los ratones diariamente para asegurar que están por encima del 80% del peso inicial. Si un ratón cae por debajo de este umbral, quitar el mouse del estudio y acceso libre al agua.
4. Mantener todos los factores ambientales constantes en el protocolo incluida la temperatura, los ruidos y los olores callejeros (incluyendo personal del cuerpo y aromas de perfume/Colonia/desodorante).
   Nota: Como con todas las pruebas animal comportamiento, pequeños cambios ambientales pueden influir mucho resultados.

3. instrucciones para todas las etapas

1. Código de software de formación para cada etapa siguiente. Ejecutar el software en el software de comportamiento.
   Nota: Para todas las etapas de codificación están contenidas en archivos de codificación adicionales. Datos de 20 senderos están agrupados como un solo bloque y ratón funcionamiento se muestra en bloques. Además, cada etapa puede repetirse en un ratón para un número de días hasta que se cumplen los criterios de finalización.
2. No mantenga ratones en el cuadro de comportamiento de más de 60 min/día.
3. Ratón limpia la basura de la jaula antes de cada ratón se transfiere a la jaula. Rocíe y limpie la cámara con etanol al 70% para minimizar la distracción de ratón olor.

4. entrenamiento etapa 1: Asociar agua recompensa con un centro nariz Poke, 1 – 3 días

1. En esta etapa, asociado a ratones con una recompensa de agua sobre la exploración del puerto de agua.
2. Instrucciones de programación de capacitación fase 1
   1. Programa de esta etapa sólo utilizar el puerto de suministro de agua. Deja el ratón recibe una recompensa de agua por cada poke de la nariz.
      Nota: El programa es la salida de la duración del ensayo y el número total de agua premia el ratón que recibió.
3. Establecer la pseudotraining etapa 1 programación de la misma como formación etapa 1.
4. Caja y configuración de ratón
   1. Configurar el cuadro de comportamiento con un puerto de agua en el centro y con los puertos inaccesibles. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de la etapa 1.
5. Considerar esta etapa como completa cuando el ratón logra 100 ensayos dentro de 60 minutos quitar el ratón de la cámara después de 60 min o 100 ensayos hayan terminado (figura 2B).
   Nota: Debido a las diferencias individuales, algunos ratones naturalmente se abstendrán de exploración de la caja.
6. Si es preciso, manualmente entregan agua en el puerto de agua. Repetir esta fase hasta por 3 días.
   Nota: Los ratones que ya están entrenados pueden repetirse más a mantener la paridad y a mantenerlos en restricción de líquidos. También es posible promover a todo un grupo en etapa 2 cuando llega a la media del grupo 100 ensayos/60 min. Esto permitirá que para que todos los ratones continuar entrenamiento el mismo día.

5. entrenamiento etapa 2: Asociar una recompensa de agua puerto lateral con centro puerto nariz Poke, 1 – 5 días

1. En esta etapa, que los ratones meter su nariz en el centro puerto y recibirá inmediatamente una recompensa de agua en las salidas laterales.
2. Caja y configuración de ratón
   1. Configurar este y cada etapa posterior con 2 puertos de agua en los lados y el puerto de olor en el medio. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de fase 2.
3. Instrucciones de programación de entrenamiento etapa 2
   1. Proporcionar el ratón una recompensa inmediata de agua en ambos lados después de un poke de la nariz en el centro de puerto de la entrega de olor. Definir los parámetros de salida para esta etapa como la duración de la prueba, el número de juicios iniciados y la cantidad de agua premios recibidos dentro de 5 s de un poke de la nariz.
4. Establecer la pseudotraining etapa 2 programación de la misma como formación etapa 2.
5. Considerar esta etapa como completa cuando se realizan un mínimo de 40 ensayos en 60 min, con al menos el 25% de agua premios recibidos dentro de 5 s de la poke de nariz de puerto centro. Quite el ratón una vez terminada esta etapa (figura 2C).
   Nota: El programa calcula el porcentaje de agua premios recibidos en tiempo y forma con el fin de determinar la finalización de esta etapa. Aunque ratones varían en cuán rápido que completan esta etapa, más ratones alcanzará criterios de terminación dentro de 5 días. Sin embargo, si un ratón no ha terminado esta etapa dentro de 5 días, haga avanzar el ratón a la siguiente etapa. Este ratón se quitarán de la cohorte.

6. entrenamiento etapa 3: Asociar una recompensa de agua con un olor específico y dentro de una ventana de tiempo específica, 1 – 3 días

1. En esta etapa, que los ratones reciben un olor de s (+) ir a un poke de la nariz en el centro del puerto. Posteriormente, dar una recompensa de agua sobre un poke de nariz en las salidas de agua laterales dentro de 5 s.
2. Instrucciones de programación de entrenamiento etapa 3
   1. Entregar el olor s en el centro de puerto de olor.
   2. Entregar la recompensa de agua si el ratón pasa las salidas laterales dentro de 5 s de la entrega de un olor.
      Nota: El programa comienza requiriendo sólo un poke de nariz de 100 ms en el puerto de centro para dar una recompensa del agua. Una vez que el ratón pasa el puerto del centro para la cantidad correcta de tiempo en el 80% de los ensayos, la duración del tiempo de un poke de nariz requiere para una recompensa de agua aumentará en 50 ms a 400 ms.
   3. Establecer los parámetros de salida idéntica a la etapa 2.
3. Establecer las instrucciones de programación etapa 3 pseudotraining mismo como entrenamiento etapa 3. Sin embargo, debe conectarse el olor s + el controlador entrega de olor para que el olor s + no se asocia con una recompensa de agua.
4. Caja y configuración de ratón
   1. Establecer la misma configuración en etapa 2.
   2. Conectar el olor s con el controlador de entrega de olor. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de la etapa 3. Quite el ratón una vez terminada esta etapa.
5. Considerar esta etapa como completa cuando hay más de 60 premios en 60 min (figura 2D).

7. etapa 4A: Asociación de olor prohibido (S-) y el castigo de tiempo de espera, 1 – 2 días

1. En esta etapa, introduce los ratones a un olor ninguno (S-). Proporcionar un castigo de tiempo los ratones que mal va a los puertos de agua después de oler el olor ninguno.
2. Instrucciones de programación de entrenamiento etapa 4A
   1. Entregar sólo el aroma de s en esta fase al principio, idéntica a la etapa 3. Después de 40 ensayos completa de ratones, comienzan entrega al azar de los olores a s + y S-olores. Programa un castigo fuera de tiempo 2-s si el ratón intenta buscar una recompensa de agua después de ser presentado el olor ninguno.
      Nota: Para ayudar en la distinción de ir vs prohibido, las luces laterales del IR se pueden manipular, que son en Go olores y apagado durante ninguno de los aceites. Las luces funcionan como una referencia secundaria para ratones en la formación inicial. Una vez que los ratones están capacitados con las luces, deben entrenamiento menores ir sin luces para confirmar que han aprendido la tarea con los olores.
   2. Establecer los parámetros de salida como tiempo de duración del juicio, número de ensayos iniciados, número de ensayos completados, % correcto y número total de premios recibidos.
3. Establecer las instrucciones de programación de 4A etapa de pseudotraining el mismo como formación etapa 4S excepto s + y S-olores se presentan aleatoriamente desde el principio. Dar agua castigos recompensa o tiempo de espera al azar, independientemente del desempeño de la tarea.
4. Caja y configuración de ratón
   1. Definir la configuración de la caja el mismo como anterior etapa 3.
   2. Conexión s + y S-olor al controlador de entrega de olor. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de 4A etapa. Después de los ensayos de 40 completa de ratones, cambiar el programa para entregar al azar los olores. Quite el ratón una vez terminada esta etapa.
5. Considerar esta etapa como completa cuando hay 40 ensayos con > 60% de respuestas correctas.

8. etapa 4B: asociar olor prohibido (S-) y el castigo de tiempo, 5-11 días

1. Instrucciones de programación de entrenamiento etapa 4B
   1. Hacer esta etapa idéntica a 4A etapa, sin embargo el castigo de tiempo por tratar de una recompensa de agua después un olor S 4 s.
2. Fijar la recompensa de agua pseudotraining etapa 4B programación instrucciones idénticas a 4A etapa, sin embargo y castigo de tiempo se entregan al azar por ensayo.
3. Caja y configuración de ratón
   1. Definir la configuración de la caja el mismo como anterior etapa 4A.
   2. Conexión s + y S-olor al controlador de entrega de olor. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de etapa 4B. Considerar esta etapa completa cuando hay > 100 ensayos dentro de 60 minutos con una precisión > 85% (figura 2E)
4. Controlar el porcentaje máximo y mínimo correcto para cada sesión de seguimiento de cada ratón en esta etapa. Aproximadamente el 85-90% de los ratones alcanzar criterios de terminación de esta etapa. Excluir a los ratones que no alcanzan la finalización de esta etapa de la Go/No-Go fase de prueba.
5. (Opcional) Al final de esta etapa, aplicar un entrenamiento de la revocación, donde los olores de Go/No-Go se encienden la plataforma vial de olor. Asegúrese de que los ratones no se asocian con otro estímulo, como el sonido de las válvulas asociadas con las salidas laterales.

9. Go/No-Go ensayo tarea: 1 día, 20 Min por ratón por día

1. Considerar esto como la fase final para determinar la exactitud de la identificación de asociaciones de olor y aprender a discriminar pares de olor.
   Nota: Novela olores son utilizados para S + S-para poner a prueba cuánto animales tome aprender nuevas asociaciones. Pares de odorante estructuralmente similares se utilizan para aumentar la dificultad de la tarea. 1-Butanol y 1-Pentanol, acetato de isoamilo vs butirato de isoamilo, ejemplos y + carvona vs - carvona.
2. Instrucciones de programación
   1. Deje que el software de entrenamiento detectar la longitud de poke de la nariz. Programa un poke de nariz de 300 ms en el puerto de olor centro para ejecutar la tarea.
   2. Establecer los parámetros de salida idéntico a etapa 4B, excepto no utilice cualquier luz guiada por señales.
3. Caja y configuración de ratón
   1. Definir la configuración de la caja el mismo como anterior etapa 4B.
   2. Conexión s + y S-olor al controlador de entrega de olor. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de fase Go/No-Go. Exponer a los ratones que han aprendido a la tarea de aprendizaje olfativo de nuevos pares de olores químicamente similares.
      Nota: Ratones de tipo salvaje con discriminación de olor adecuado alcanzan > 85% de precisión con nuevos olores después de aproximadamente 10-20 cuadras o 200-400 ensayos (figura 3A).

Resultados

Una vez que los ratones han aprendido la tarea de aprendizaje olfativo, ahora puede asociar pares de olor novela de recompensa y de castigo. Estos ratones entrenados comienzan normalmente con un 50% la precisión en la tarea Go/No-Go. El porcentaje correcto se puede trazar por el bloque de ensayo como una curva de aprendizaje para los pares de olores nuevos (figura 3A). Dentro de los 10 ensayos de bloque, que toman la mayoría ratones de meno...

Discusión

El sistema olfativo roedor proporciona un modelo único para estudiar la plasticidad dependiente sensorial. Aquí presentamos un paradigma de aprendizaje olfativo para entrenar a ratones para asociar pares de olor con una recompensa o castigo. A través de esta tarea de aprendizaje, se pueden estudiar cambios aguas abajo en experimentos posteriores (electrofisiología, en vivo imágenes neuronales, etcetera). Al finalizar, ratones aprenderán a realizar una tarea de localización de olor simple para aso...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass vial	Qorpak	GLC-01016
Silicon Tubing	Thermo Scientific	86000030
18 gauge needles	BD	305196
1-Butanol	Sigma Aldrich	437603
Propionic Acid	Sigma Aldrich	402907
Mouse Chamber	Med Associates	ENV-307W
Chamber Floor	Med Associates	ENV-307W-GFW
Water Port	Med Associates	ENV-313W	Need two
Odor stimulus	Med Associates	ENV-275	Contain 2 valves to gate odor delivery
Odor Port	Med Associates	ENV-375W-NPP
USB Interface	Med Associates	DIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meter	VWR	97004-952
Behavioral software	Med Associates	SOF-735	This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer software	Med Associates	SOF-731	This software formats the data to Excel
Training Software	Med Associates	DIG-703A-USB	This software is used to program each training stage
Water Valve	Neptune Research	225P012-11	This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor Valve	Neptune Research	360P012-42	This valve is used to gate the odor delivery. Need Two