Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos

Resumo

Aqui, treinamos os ratos em uma tarefa de aprendizagem associativa para testar a discriminação do odor. Este protocolo permite também para estudos sobre aprendizagem-induzido mudanças estruturais no cérebro.

Resumo

A olfação é a modalidade sensorial predominante em camundongos e influencia muitos comportamentos importantes, incluindo forrageio, deteção de predador, acasalamento e parentalidade. Importante, os ratos podem ser treinados para associar odores romance com respostas comportamentais específicas para fornecer a introspecção do função olfativa do circuito. Este protocolo detalha o procedimento para os ratos de treinamento em uma tarefa de aprendizagem operante de avançar/não avançar. Nesta abordagem, os ratos são treinados diariamente em centenas de testes automatizados para 2 – 4 semanas em então podem ser testados na novela avançar/não avançar odor pares para avaliar a discriminação olfativa, ou ser usado para estudos sobre como a aprendizagem de odor altera a estrutura ou a função do olfativo circuito. Além disso, o bulbo olfativo do mouse (OB) apresenta integração contínua de neurônios adulto-nascido. Curiosamente, aprendizado olfativo aumenta a sobrevivência e conexões sinápticas destes neurônios adulto-nascido. Portanto, este protocolo pode ser combinado com outras técnicas bioquímicas, eletrofisiológicas e de imagem para estudar a aprendizagem e atividade-dependente fatores que medeiam a sobrevivência neuronal e plasticidade.

Introdução

O mouse OB, onde informações de odor primeiro entra no sistema nervoso central (SNC), fornece um excelente modelo para estudar as mudanças estruturais de experiência-dependente. Os circuitos de OB integra continuamente neurônios adulto-nasceu em uma maneira dependente da atividade. Precursores de adulto-nascido neurônio dividam fora de progenitores que a linha da zona subventricular adjacente ao ventrículos laterais¹. Após migrar para o OB, estes precursores neuronais sobrevivem, diferenciam e integram-se como células grânulo inibitório ou passam por apoptose². Seleção para o destino da célula é influenciada pela atividade olfativa, incluindo aprendizagem olfactiva^3,4,5,6. Após a integração, alterações sinápticas induzida por aprendizagem ocorrem em células grânulo durante uma duas semanas período crítico^7,8. Assim, os ensaios para aprendizagem olfactiva são útil para examinar como experiência-dependente plasticidade influências reorganização estrutural e funcional de um circuito de cérebro maduro.

Este protocolo oferece uma abordagem para o treinamento olfativo, usando uma paradigma de condicionamento operante. Nesta tarefa, ratos privados de água são treinados para associar uma punição de tempo limite experimental cheiro (o cheiro de "Ir") com uma recompensa de água e outro odor (odor "Go"). Progresso de ratos através de uma série graduada de fases de treinamento ao longo de 2-4 semanas. Quando o treinamento está completo, ratos respondem ao odor Go ou abortar com comportamentos discretos e correspondentes (buscando uma recompensa de água em ensaios de Go e não buscando a recompensa de água em ensaios não-go) (Figura 1A). Após treinamento completo, ratos podem ser ainda mais desafiados com pares de odor quimicamente semelhantes testar a discriminação ou tornar-se uma transição para estudos de investiga aprendizagem como olfativa altera a estrutura ou a função da OB. Embora as tarefas de discriminação do odor têm sido descritas anteriormente, mais dependem de medições subjetivas, tais como número de farejadores entre dois odorantes^9,10. Além disso, a necessidade humana de Pontuação de tais tarefas também é demorada. A tarefa de avançar/não avançar olfativo aprendizagem descrita neste protocolo oferece uma medição imparcial, direta da aprendizagem olfactiva e discriminação do odor.

Protocolo

Todos os ratos foram utilizados no âmbito de um protocolo aprovado pelo Comitê de uso e Baylor College de medicina institucional Cuidado Animal, em conformidade com as normas do NIH. Ratos usados neste protocolo foram todos ratos adultos (> 6 semanas de idade) na C57BL6/j fundo e incluiu a ratos machos e fêmeas. Após a formação/preparação tarefas, ratos são retornados para sua gaiola em casa.

1. construção e regras gerais para a utilização operante, aprendizagem caixa (Figura 1B, C)

1. Monte uma câmara de rato com piso da câmara. Manter a caixa de treinamento em um baixo tráfego, área mal iluminado para evitar distrações.
2. Cada porta de água com um pequeno furo na parte superior para permitir que uma agulha de calibre 18 dispensar a água no interior do porto da broca.
3. Encha o frasco de vidro com odorant dissolvido em óleo mineral (substituído semanalmente) e aperte firmemente a tampa.
4. Conecte a agulha de calibre 18 do silicone. Perfure a tampa do frasco de vidro com agulha de calibre 18 e conecte a outra extremidade do tubo de silicone para a ingestão das portas do odor.
5. Coloque cada tubo do silicone em uma válvula de odor.
6. Conecte a linha de vácuo para os portos de odor.
7. Fixar uma haste de metal segurando duas seringas de 10 mL e conecte o tubo para as seringas. Ligue a outra extremidade do tubo para uma agulha de 18 G. Encaixe a agulha do furo do Porto nariz puxão na câmara de rato. Conecte a outra extremidade do tubo para a válvula de água.
8. Encha as duas seringas de 10 mL com roedor água potável.
9. Conectar-se um medidor de fluxo de ar para a entrada de ar e manter o fluxo de ar de 3 – 5 L/min.
10. Conectar-se a 2 válvulas de água, 2 válvulas de odor, 2 portas de água, Porto de odor e energia para o sistema de interface USB. Conecte todas as válvulas de portas 'Saída', todos os portos de odor e água a 'Entrada' portas. Todos os equipamentos para saídas de caixa de interface USB de energia e por último, conectar a caixa de interface USB para poder conectar-se.
11. Ajuste a sucção do vácuo para evitar a contaminação cruzada de odores entre ensaios.
12. Use tubos de odor específico para conectar odorant frascos para a câmara.

2. Mouse preparação: 1-3 dias

1. Divida os ratos em 3 grupos: controle (sem treinamento olfativo necessária), pseudo treinados (ratos que recebem de recompensa ou punição ao acaso) e treinou grupos. Expor o pseudo treinados ratos para a entrega de caixa e odor de treinamento, mas não fornecem treinamento olfativo porque o resultado da recompensa e punição é aleatoriamente associado com o odor entregado.
   Nota: O grupo pseudo treinado atravessará o paradigma de treinamento sob as fases de "Pseudotraining". Os ratos treinados irão completar todas as fases de treinamento. Pseudotraining é opcional, se o objetivo do experimento é a ensaiar para diferenças comportamentais na discriminação de odor ou aprendizagem. O protocolo fornecido que aqui adiciona este grupo se o experimentador quer sondar para neuronais diferenças antes e depois do treino. O grupo pseudotrained controlaria então para exposição de odor passiva e não-olfactory treinamento relacionado.
2. Começar a restrição de água em ratos para 40 mL/kg/dia. Evite a perda de peso corporal superior a 20% do peso de linha de base dos animais a fim de evitar a angústia(Figura 2).
3. Pese os ratos diariamente para garantir que eles estão acima de 80% do peso inicial. Se um rato cair abaixo deste limiar, remover o mouse do estudo e fornecer o acesso livre à água.
4. Manter todos os fatores ambientais constante em todo o protocolo, incluindo temperatura, ruídos e odores vadios (incluindo pessoal corpo e perfumes perfume/colônia/desodorante).
   Nota: Tal como acontece com todos os testes de comportamento animal, pequenas mudanças ambientais grandemente podem influenciar os resultados.

3. instruções para todas as fases

1. Código de software de treinamento para cada etapa abaixo. Execute o software sobre o software comportamental.
   Nota: Para todas as etapas de codificação estão contidas em arquivos de codificação suplementares. Dados para 20 trilhas são agrupados como um único bloco e mouse desempenho é exibido através de blocos. Além disso, cada estágio pode ser repetido em um mouse para um número de dias até conclusão critérios forem atendidos.
2. Não manter os ratos na caixa comportamento para mais de 60 min/dia.
3. Rato limpa resíduos da gaiola antes de cada mouse é transferido para a gaiola. Spray e limpe a câmara com etanol a 70% para minimizar a distração de odor de rato.

4. formação fase 1: Associando recompensa de água com um Poke de nariz de centro, 1 – 3 dias

1. Nesta etapa, associe os ratos com uma recompensa de água em cima de exploração do porto de água.
2. Instruções de programação de 1 estágio de formação
   1. Programa nesta fase, apenas use a porta de entrega de água. Deixe o mouse receber uma recompensa de água para cada saco de nariz.
      Nota: O programa imprimirá o tempo de duração do julgamento e o número total de água premia o mouse recebido.
3. Defina o pseudotraining fase 1 programação igual a 1ª fase de treinamento.
4. Caixa instalação e configuração do mouse
   1. Configure a caixa de comportamento com um porto de água no centro e com todas as portas de lado inacessíveis. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 1.
5. Considerar nesta fase tão completo quando o mouse atinge 100 ensaios dentro de 60 min. remover o mouse da câmara após 60 min ou 100 testes terem sido concluídos (Figura 2B).
   Nota: Devido às diferenças individuais, alguns ratos naturalmente abster-me de explorar a caixa.
6. Se houver necessidade de encorajamento, manualmente, fornecer água à porta de água. Repita esta etapa para até 3 dias.
   Nota: Os ratos que já são treinados podem ser repetidos mais para manter a paridade e mantê-los na restrição de fluidos. Também é possível promover um grupo inteiro de estágio 2, quando a média do grupo atinge 100 ensaios/60 min. Isto permitirá todos os mouses continuar o treinamento no mesmo dia.

5. formação fase 2: Associando uma recompensa de água lado Porto Porto centro nariz Poke, 1 – 5 dias

1. Nesta fase, deixe os ratos cutucar o nariz na porta do centro e então imediatamente receber uma recompensa de água sobre as portas de lado.
2. Caixa instalação e configuração do mouse
   1. Configure este e todos os estágios subsequentes com 2 portas de água nas laterais e o porto de odor no meio. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 2.
3. Instruções de programação formação fase 2
   1. Fornece o mouse com uma recompensa imediata de água em ambos os lados após um puxão de nariz no centro de Porto de entrega de odor. Definir parâmetros de saída para este estágio, como o tempo de duração do julgamento, o número de ensaios iniciada e o número de recompensas de água recebida dentro de 5 s de um puxão de nariz.
4. Defina o pseudotraining fase 2 programação igual formação fase 2.
5. Considerar esta fase como completa um mínimo de 40 ensaios efectuados em 60 min, pelo menos 25% dos prêmios de água recebidos dentro de 5 s do poke de nariz Porto centro. Remova o mouse uma vez que essa etapa foi concluída (Figura 2C).
   Nota: O programa de treinamento calcula a porcentagem de água recompensas recebido em tempo hábil, a fim de determinar a conclusão desta etapa. Embora ratos variam em quão rápido completa nesta fase, a maioria dos ratos atingirá critérios de conclusão dentro de 5 dias. No entanto, se um rato não foi concluída nesta fase, no prazo de 5 dias, não avance o mouse para a próxima fase. Este rato será retirado da coorte.

6. treinamento estágio 3: Associando uma recompensa de água com um Odor específico e dentro de uma janela de tempo específico, 1 – 3 dias

1. Nesta fase, deixe os ratos recebem um odor de ir s (+) em cima de um puxão de nariz no porto centro. Posteriormente, produzir uma recompensa de água em cima de um puxão de nariz para os portos de água do lado dentro de 5 s.
2. Instruções de programação do treinamento estágio 3
   1. Entrega o odor s + no centro de Porto de odor.
   2. Entregar a recompensa de água se o mouse pokes das portas laterais, dentro de 5 s de uma entrega de odor.
      Nota: O programa começa, exigindo apenas um puxão de nariz de 100 ms no porto centro para produzir uma recompensa de água. Uma vez que o mouse pokes do porto do centro para a quantidade correta de tempo em 80% dos ensaios, o tempo de duração de um puxão de nariz exigida para uma recompensa de água aumentará por 50 ms até 400 ms.
   3. Defina os parâmetros de saída idêntica à fase 2.
3. Defina as instruções de programação estágio 3 pseudotraining o mesmo como formação estágio 3. No entanto, não conecte o odor s + para o controlador de entrega de odor para garantir que o odor de s + não está associado com uma recompensa de água.
4. Caixa instalação e configuração do mouse
   1. Defina a mesma configuração de fase 2.
   2. O odor de s + Conecte o controlador de entrega de odor. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 3. Remova o mouse uma vez que essa etapa foi concluída.
5. Considere esta fase como completa quando há maior que 60 recompensas dentro 60 min (Figura 2D).

7. estágio 4A: associando tudo cancelado (S-) Odor e punição de tempo limite, 1 – 2 dias

1. Nesta fase, apresente os ratos a um odor Go (S-). Fornece um tempo de castigo para os ratos que incorretamente ir para as portas de água depois de cheirar o odor de go.
2. Instruções de programação formação estágio 4A
   1. Entrega apenas o odorant s + neste estágio no início, idêntico à fase 3. Depois de ratos completa 40 os ensaios, começam entrega aleatória dos odores para incluir tanto s + e S-odores. Programe um castigo 2-s expiram se o rato tenta procurar uma recompensa de água depois de ser apresentado o odor go.
      Nota: Para auxiliar na distinção entre Go vs inacessível, as luzes do lado de IR podem ser manipuladas tal que eles estão na durante Go odorantes e off durante go odorantes. As luzes funcionam como uma indicação secundária para ajudar os ratos na formação inicial. Uma vez que os ratos são treinados com as luzes, eles devem formação Under ir sem luzes para confirmar que eles aprenderam a tarefa com odores.
   2. Defina os parâmetros de saída como tempo de duração do julgamento, número de ensaios iniciada, número de ensaios concluída, % correto e número total de prêmios recebidos.
3. Definir as pseudotraining instruções de programação estágio 4A o mesmo como fase de formação 4S exceto s + e S-odores são apresentados aleatoriamente desde o início. Dê água punições recompensa ou tempo limite ao acaso, independentemente do desempenho da tarefa.
4. Caixa instalação e configuração do mouse
   1. Defina a configuração de caixa o mesmo como o estágio anterior 3.
   2. Conecte ambos s + e S-odor ao controlador de entrega de odor. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 4A. Após os julgamentos de ratos completa 40, mude o programa entregar aleatoriamente os odores. Remova o mouse uma vez que essa etapa foi concluída.
5. Considera esta fase como completa quando há 40 ensaios com > 60% de respostas corretas.

8. estágio 4B: associando tudo cancelado (S-) Odor e punição de tempo, 5 – 11 dias

1. Instruções de programação formação estágio 4B
   1. Fazer este estágio idêntico ao estágio 4A, no entanto, a punição de tempo limite para a tentativa de uma recompensa de água depois de um S-odor é 4 s.
2. Definir a recompensa de água pseudotraining estágio 4B instruções idênticas ao estágio 4A, de programação, no entanto e punição de tempo são entregues aleatoriamente por julgamento.
3. Caixa instalação e configuração do mouse
   1. Defina a configuração de caixa o mesmo como anterior etapa 4A.
   2. Conecte ambos s + e S-odor ao controlador de entrega de odor. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio 4B. Considerar nesta fase completa quando há > 100 ensaios dentro 60 min com precisão > 85%(Figura 2)
4. Monitore o percentual máximo e mínimo correto para cada sessão acompanhar o progresso de cada mouse neste estágio. Aproximadamente 85-90% dos ratos alcançar critérios de conclusão para esta fase. Exclua os ratos que não alcançar a conclusão desta fase para avançar/não avançar fase de testes.
5. (Opcional) No final desta fase, aplica um treinamento de reversão, onde os odorantes avançar/não avançar estão ligadas a plataforma de frasco de odor. Certifique-se de que os ratos não são associando com outro estímulo, tais como o som das válvulas associados das portas laterais.

9. avançar/não avançar do ensaio tarefa: 1 dia, 20 Min por Mouse por dia

1. Considere isto como o estágio final para determinar a precisão de identificar associações de odor e aprender a discriminar pares de odor.
   Nota: O romance odorantes são utilizados para S + S-testar animais quanto tempo leva para aprender novas associações. Estruturalmente semelhantes odorant pares são usados para aumentar a dificuldade da tarefa. Exemplos incluem Butanol-1 vs 1-Pentanol, acetato Isoamyl vs Isoamyl butirato, e + carvona vs - carvona.
2. Instruções de programação
   1. Deixe o software de treinamento detectar o comprimento do saco do nariz. Programe um puxão de nariz de 300 ms no porto centro odor para executar a tarefa.
   2. Definir os parâmetros de saída idêntica à fase 4B, exceto que não utilize qualquer luz guiado pistas.
3. Caixa instalação e configuração do mouse
   1. Defina a configuração de caixa o mesmo como anterior estágio 4B.
   2. Conecte ambos s + e S-odor ao controlador de entrega de odor. Coloca um rato na câmara. Fechar a câmara de rato e começar o programa de estágio avançar/não avançar. Expor os ratos que aprenderam a tarefa de aprendizagem olfactiva para novos pares de odores quimicamente semelhantes.
      Nota: Sua ratos com discriminação adequada odor chegar > 85% de precisão com odorantes romance após aproximadamente 10-20 blocos ou ensaios de 200-400(Figura 3).

Resultados

Uma vez que os ratos aprendeu a tarefa de aprendizagem olfactiva, eles agora podem associar pares de odor romance com recompensa e punição. Estes ratos treinados normalmente começam com cerca de 50% precisão na tarefa avançar/não avançar. O percentual correto pode ser plotado pelo bloco experimental como uma curva de aprendizado para pares de odor romance(Figura 3). Dentro de 10 testes de bloco, o que leva a maioria dos ratos a menos d...

Discussão

O sistema olfativo roedor fornece um modelo exclusivo para estudar sensorial plasticidade dependente. Aqui nós apresentamos uma paradigma de aprendizagem olfactiva para treinar ratos associar pares de odorante com uma recompensa ou punição. Através desta tarefa de aprendizagem, alterações de circuito a jusante podem ser estudadas em experimentos subsequentes (eletrofisiologia, imagem latente na vivo neuronal, etc.). Após a conclusão, ratos vão aprender a executar uma tarefa de simples odor marc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass vial	Qorpak	GLC-01016
Silicon Tubing	Thermo Scientific	86000030
18 gauge needles	BD	305196
1-Butanol	Sigma Aldrich	437603
Propionic Acid	Sigma Aldrich	402907
Mouse Chamber	Med Associates	ENV-307W
Chamber Floor	Med Associates	ENV-307W-GFW
Water Port	Med Associates	ENV-313W	Need two
Odor stimulus	Med Associates	ENV-275	Contain 2 valves to gate odor delivery
Odor Port	Med Associates	ENV-375W-NPP
USB Interface	Med Associates	DIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meter	VWR	97004-952
Behavioral software	Med Associates	SOF-735	This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer software	Med Associates	SOF-731	This software formats the data to Excel
Training Software	Med Associates	DIG-703A-USB	This software is used to program each training stage
Water Valve	Neptune Research	225P012-11	This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor Valve	Neptune Research	360P012-42	This valve is used to gate the odor delivery. Need Two