Koku öğrenme ve ayrımcılık farelerde bir objektif ve tekrarlanabilir testi

Özet

Burada, fareler üzerinde koku ayrımcılık test etmek için bir ilişkisel öğrenme görev eğitim. Bu iletişim kuralı öğrenme kaynaklı beyin yapısal değişimler üzerine çalışmalar için de sağlar.

Özet

Koku alma baskın duyusal modalite farelerde ve yiyecek arama, predator algılama, çiftleşme ve ebeveynlik de dahil olmak üzere birçok önemli davranışları etkiler. Önemlisi, fareler roman koku koku devre işlevi içgörü sağlamak için belirli davranışsal yanıt ilişkilendirmek için eğitilmiş olabilir. Bu iletişim kuralı bir görevde başla/başlama-operant öğrenme eğitim Fareler için yordam ayrıntıları. Bu yaklaşımda, fareler üzerinde otomatik deneme sürümlerini yüzlerce her gün 2-4 hafta için eğitilmiştir ve sonra koku ayrımcılık değerlendirmek veya nasıl koku öğrenme yapısı veya koku alma işlevini değiştirir üzerinde çalışmalar için kullanılabilir için roman başla/başlama-koku çiftlerini test edilebilir devre. Ayrıca, fare olfaktör ampul (OB) Yetişkin tarihi nöronların sürekli tümleştirme sahiptir. İlginçtir, koku öğrenme hayatta kalma ve bu yetişkin tarihi nöronların sinaptik bağlantıları artar. Bu nedenle, bu iletişim kuralını nöronal hayatta kalma ve plastisite aracılık öğrenme ve etkinlik bağlı faktörler çalışmaya diğer biyokimyasal, Elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri ile kombine edilebilir.

Giriş

Fare nerede koku bilgi ilk merkezi sinir sistemi (MSS) girer, OB, deneyim bağlı yapısal değişiklikleri incelemek için mükemmel bir model sağlar. OB circuity sürekli bir faaliyet bağlı şekilde yetişkin tarihi nöronlar bütünleştirir. Subventricular bölge için lateral ventrikül¹bitişik satır ataları gelen kapalı nöron yetişkin doğumlu hareketlenme öncesi ilk belirtiler bölün. OB geçiş, üzerine bu nöronal öncüleri hayatta, ayırt etmek ve inhibitör granül hücreler olarak entegre veya apoptosis²tabi. Hücre kaderi için seçimi dahil koku öğrenme^3,4,5,6koku etkinliği tarafından etkilenir. Entegrasyon sonra öğrenme kaynaklı sinaptik granül hücrelerde sırasında iki haftalık kritik dönem^7,8değişikliklerden. Böylece, deneyleri koku öğrenmek için nasıl deneyim bağımlı plastisite etkileri yapısal ve işlevsel reorganizasyon olgun beyin devre incelenmesi için yararlıdır.

Bu iletişim kuralı bir Edimsel Klima paradigması kullanarak koku eğitim için bir yaklaşım sunmaktadır. Bu görev, su yoksun fareler bir koku ("Git" kokusu) su ödül ile ve başka bir koku ("No" kokusu) deneme zaman aşımı ceza ile ilişkilendirmek için eğitilmiştir. Fareler ilerleme eğitim Aşama 2-4 hafta boyunca kademeli bir dizi. Eğitim tamamlandıktan sonra fare (Go denemeler üzerinde bir su ödül arayan ve No denemeler üzerinde su ödül arayan değil) ayrık, karşılık gelen davranışları ile gitmek ya da vazgeçtik koku yanıt (şekil 1A). Eğitim Fareler daha fazla kimyasal olarak benzer koku çiftiyle meydan okunabilir ayrımcılık sınamak veya için geçiş olmak için tamamlandıktan sonra soruşturma nasıl koku öğrenme yapısı veya OB işlevini değiştirir çalışmalar Her ne kadar koku ayrımcılık görevleri daha önce tarif var, en öznel ölçümleri Koklayıcılara iki odorants^9,10arası sayısı gibi güveniyor. Ayrıca, insan gibi görevler puanlama için de zaman yoğun ihtiyacıdır. Bu protokol için açıklanan başla/başlama-koku öğrenme görevi koku ayrımcılık ve koku öğrenme bir tarafsız, doğrudan ölçümü sunmaktadır.

Protokol

Bütün fareler NIH standartlarına uygun olarak Baylor College tıp kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol altında kullanılmıştır. Bu protokol için kullanılan fare vardı tüm yetişkin fareler (> 6 hafta-in yaş) C57BL6/j üzerinde arka plan ve hem erkek hem de dişi fareler dahil. Eğitim/evreleme görevleri sonra fareler için ev onların kafes döndürülür.

1. inşaat ve Edimsel kutu (şekil 1B, C) öğrenme kullanmanın genel kuralları

1. Bir fare odası odası döşeme ile bir araya getirin. Eğitim kutusunu düşük bir trafikte, loş ışıklı alan dikkat dağıtıcı önlemek için tutmak.
2. Her deniz limanı ile liman içinde su dağıtmak bir 18'lik iğne izin vermek için üst üzerinde küçük bir delik matkap.
3. Çözünmüş mineral yağ içinde (haftalık değiştirilmiştir) propil ile cam şişe doldurun ve güvenli bir şekilde kap sıkın.
4. 18'lik iğne silikon tüp takın. 18'lik iğne ile cam şişe kapağı işlemek ve koku bağlantı noktaları alımı için silikon tüp diğer ucunu.
5. Her silikon tüp bir koku vana içine yerleştirin.
6. Vakum hattı koku bağlantı noktalarına bağlayın.
7. İki 10 mL şırınga metal holding paratoner iliştirin ve hortumu şırıngaları için bağlayın. Diğer taraftaki hortumunun bir 18 G iğne bağlayın. İğne fare odası üzerindeki burun poke bağlantı delinmiş deliğe uygun. Diğer ucunu hortumunun su vanası bağlayın.
8. İki 10 mL şırınga kemirgen içme su ile doldurun.
9. Bir hava akış metre hava girişi için bağlanmak ve hava akımı 3 – 5 L/dk korumak.
10. 2 su vanaları, 2 koku vanalar, 2 su çıkışı, koku bağlantı noktası ve güç USB arayüzü sisteme bağlayın. 'Çıkış' bağlantı noktaları için tüm vanalar, 'Giriş' tüm koku ve su noktalarına bağlanmak bağlantı noktaları. USB arabirimi kutusundan çıkış güç ve son olarak, güç için USB arayüzü kutusu bağlanmak için tüm RGB sinyali.
11. Kokuların denemeler arasında çapraz bulaşma kaçınmak için vakum emme ayarlayın.
12. Koku özel boru propil şişeleri odasına bağlanmak için kullanın.

2. fare Hazırlanışı: 1-3 gün

1. Fareler 3 gruba ayırın: Denetim (koku eğitim gerek yok), rasgele ödül ya da ceza alması (sözde eğitimli fareler) ve eğitim grupları. Sözde eğitimli fareler eğitim kutusu ve koku teslimat için ortaya çıkarmak, ama ödül ceza karşı sonucu teslim kokusu ile rastgele ilişkili olduğundan koku eğitim sağlamak değil.
   Not: Sözde eğitimli grup eğitim paradigması altında belgili tanımlık "Pseudotraining" sahne devam edecek. Eğitimli fareler tüm eğitim aşamaları tamamlayacak. Pseudotraining deneme amacı koku ayrımcılık ya da öğrenme davranış farklılıkları için tahlil için ise isteğe bağlıdır. Protokol deneyci için nöronal fark öncesi ve eğitim sonrası sonda istiyorsa bu grup ekler sağlanan. Pseudotrained grup sonra pasif koku maruz kalma ve koku sigara ilgili eğitim için kontrol ediyorum.
2. Su kısıtlama 40 mL/kg farelerde başlar/gün. Vücut ağırlığı kaybı % 20'sinden hayvanların temel ağırlık büyük sıkıntı (Şekil 2A) önlemek için kaçının.
3. Temel ağırlık % 80'i olduklarından emin olmak için her gün fareler tartın. Bir fare bu eşiğin altına düşerse, çalışma fareyi kaldırın ve su ücretsiz erişim sağlar.
4. Tüm çevresel faktörler sıcaklık, gürültü ve sokak kokuları (kişisel vücut ve parfüm/Köln/deodorant kokular da dahil olmak üzere) dahil olmak üzere Protokolü sabit tutmak.
   Not: Bütün hayvan davranış testleri gibi ile küçük çevresel değişiklikler büyük ölçüde sonuçları etkileyebilir.

3. tüm aşamaları için yönergeler

1. Eğitim yazılımı her aşaması için kod. Yazılım üzerinde davranış yazılımını çalıştırın.
   Not: ek kodlama dosyalarında bulunan tüm aşamaları için kodlama. Tek bir blok ve fare performans blok görüntülenen veri 20 parkurları gruplandırılır. Ayrıca, her aşamada tamamlanması kriterleri karşılanana kadar gün sayısı için bir fare üzerinde tekrar edilebilir.
2. Fareler daha--dan 60 dk/gün için davranış kutusunda tutma.
3. Temiz fare atık her fare kafese transfer edilmeden önce belgili tanımlık kafes. Sprey ve odası fare kokusu oyalama en aza indirmek için % 70 etanol ile silin.

4. eğitim Aşama 1: İlişkilendirme su ödül ile bir merkezi burnunu Poke, 1-3 gün

1. Bu aşamada, su ödül deniz limanı keşfi üzerine fare ilişkilendirin.
2. Eğitim Aşama 1 programlama yönergeleri
   1. Bu aşamada sadece su teslim bağlantı noktası kullanmak için program. Her burun poke için su ödül almak fare izin.
      Not: Program zaman süresi dava çıktısı ve su toplam sayısı alınan fare senin.
3. Pseudotraining sahne aynı derecede eğitim sahne 1 programlama 1 ayarlayın.
4. Kutusu yapılandırma ve fare ayarlar─▒n─▒
   1. Davranış kutusu tüm yan bağlantı ulaşılmaz ve merkezi bir deniz limanı ile yapılandırın. Bir fare odanın içine yerleştirin. Fare odası kapatıp Aşama 1 program başlamak.
5. Bu sahne düşünün ne zaman fare 60 dk. Kaldır içinde 100 denemeler elde tam 60 dk veya 100 denemeler edildikten sonra odası fare (Şekil 2B) tamamlandı.
   Not: bireysel farklılıklar nedeniyle bazı fareler doğal olarak kutu keşfetmek kaçınacaktır.
6. El ile teşvik gerekli su su bağlantı noktasına teslim. Bu aşamada 3 gün için yineleyin.
   Not: zaten eğitilmiştir fareler daha fazla eşliği sağlamak ve onları sıvı kısıtlama için tekrar edilebilir. Grup ortalama 100 denemeler/60 dk ulaştığında bir grup sahne 2 için teşvik etmek mümkündür. Bu tüm fareler aynı gün eğitim devam etmek için izin verir.

5. eğitim sahne 2: bir yan bağlantı noktası su ödül ile Merkezi bağlantı noktası burnunu Poke, 1-5 gün ilişkilendirme.

1. Bu aşamada, fareler Merkezi bağlantı noktası burnunu poke ve sonra hemen yan bağlantı noktalarında su ödül almak izin.
2. Kutusu yapılandırma ve fare ayarlar─▒n─▒
   1. Bu ve sonraki her aşamasında iki tarafta 2 su çıkışı ve orta koku bağlantı noktasına yapılandırın. Bir fare odanın içine yerleştirin. Fare odası kapatıp Stage 2 program başlamak.
3. Eğitim Stage 2 programlama yönergeleri
   1. Fareyi bir acil su ödül ile her iki tarafta bir burun poke sonra merkeze koku teslim bağlantı noktası sağlamanız. Grubu çıkış parametreleri bu sahne için süre belgili tanımlık duruşma, başlatılan deneme sayısı ve 5 içinde alınan su ödüller sayısı olarak burun poke s.
4. Pseudotraining sahne eğitim Stage 2 ile aynı programlama 2 ayarlayın.
5. En az 40 denemeler yapılma su Ödülleri 5 içinde alınan en az % 25 ile 60 dakika içinde bu aşamada tam olarak dikkate Merkezi bağlantı noktası burnunu poke s. Bu aşamada (Şekil 2C) tamamlandıktan sonra fareyi kaldırın.
   Not: Eğitim programı bu aşamada tamamlanması belirlemek için zamanında alınan su ödüller yüzdesini hesaplar. Fareler ne kadar hızlı olarak değişir, ancak onlar bu adımını tamamlamak, çoğu fare tamamlama ölçütleri 5 gün içinde ulaşacaktır. Bir fare 5 gün içinde bu aşama tamamlanmadı, ancak, fare sonraki aşamaya ilerlemek değil. Bu fare kohort kaldırılacak.

6. eğitim sahne 3: belirli bir koku ile ve belirli bir zaman penceresi, 1-3 gün içinde su ödül ilişkilendirme

1. Bu aşamada, git (S+) kokusu burnunu poke üzerine Merkezi bağlantı noktası alırsınız fareler izin. Daha sonra yan su bağlantı noktalarına 5 içinde bir burun poke üzerine su ödül verim s.
2. Eğitim Stage 3 programlama yönergeleri
   1. Merkezi S+ koku koku bağlantı noktası sunar.
   2. Yan bağlantı noktaları 5 içinde fare pokes su ödül teslim bir koku teslimat s.
      Not: Sadece 100 ms burun körü bir su ödül vermeye Merkezi bağlantı noktası kılarak program başlar. Fareyi zaman denemelerin % 80 doğru miktarda Merkezi bağlantı noktası pokes sonra burun poke zaman süresi su ödül tarafından 50 ms artırmak için gerekli kadar 400 ms.
   3. 2. aşama aynı çıkış parametrelerini ayarlamak.
3. Pseudotraining sahne 3 programlama yönergeleri aynı eğitim sahne 3 ayarlayın. Ancak, S+ koku S+ koku su ödül ile ilişkili değil emin olmak için koku teslim denetleyiciye bağlamak değil.
4. Kutusu yapılandırma ve fare ayarlar─▒n─▒
   1. Aynı yapılandırma 2 aşamada ayarlayın.
   2. S+ koku koku teslim denetleyicisine bağlanma. Bir fare odanın içine yerleştirin. Fare odası kapatın ve Stage 3 programı başlar. Bu aşamada tamamlandıktan sonra fareyi kaldırın.
5. 60 ödül 60 dk (Şekil 2D) içinde daha büyük olduğunda bu aşamada tam olarak düşünün.

7. aşama 4A: vazgeçtik (S-) koku ve zaman aşımı ceza, 1-2 gün ilişkilendirme

1. Bu aşamada, fareler için No koku (S-) tanıtmak. Bir zaman aşımı ceza yanlış su noktalarına No koku kokulu sonra gidip farelere sağlar.
2. Eğitim sahne 4A programlama yönergeleri
   1. Başlangıçta, evre 3 aynı bu aşamada sadece S+ propil teslim. Fareler tam 40 denemeler sonra rastgele S+ ve S-kokuları içerir kokuları teslimini başlar. Fare No koku sunulan sonra su ödül aramak çalışırsa bir 2-s zaman aşımı ceza programı.
      Not: öyle ki onlar gitmek odorants sırasında bulunan ve kapalı gitmek vs vazgeçtik ayırt yardımcı olmak için IR yan ışıklar manipüle edilebilir No odorants sırasında. Işıklar içinde ilk eğitim fare yardım etmek için ikincil bir işaret olarak hareket ederler. Bir kez fareler ışıkları ile eğitim, altında git eğitim kokuları görevle öğrendiler onaylamak için ışıklar olmadan olması gerektiği.
   2. Çıkış parametreleri deneme, başlatılan deneme sayısı, tamamlanan denemeler sayısı, % doğru ve alınan ödüller toplam sayısı zaman süresi ayarlayın.
3. Pseudotraining sahne 4A programlama yönergeleri aynı eğitim sahne 4S S+ dışında olarak ayarla ve S-kokuları rastgele başından beri sunulmaktadır. Su ödül veya zaman aşımı cezalar, görev performansı ne olursa olsun teslim.
4. Kutusu yapılandırma ve fare ayarlar─▒n─▒
   1. Kutusu yapılandırma aynı önceki aşama 3 ayarlayın.
   2. S+ ve S-koku koku teslim denetleyicisine bağlanma. Bir fare odanın içine yerleştirin. Fare odası kapatın ve sahne 4A programına başlamak. Fareler tam 40 denemeler sonra rastgele kokuları sunmak için program geçin. Bu aşamada tamamlandıktan sonra fareyi kaldırın.
5. > %60 doğru yanıt ile 40 denemeler olduğunda bu aşamada tam olarak düşünün.

8. sahne 4B: vazgeçtik (S-) koku ve zaman aşımı ceza, 5-11 gün ilişkilendirme

1. Eğitim sahne 4B programlama yönergeleri
   1. Ancak su ödül S koku sonra çalışırken zaman aşımına cezası 4 bu sahne sahne 4A, aynı yapmak s.
2. Yönergeler için sahne 4A, aynı ancak programlama pseudotraining sahne 4B su ödül ayarlayın ve zaman aşımı ceza rastgele deneme teslim edilir.
3. Kutusu yapılandırma ve fare ayarlar─▒n─▒
   1. Kutusu yapılandırma aynı önceki sahne 4A ayarlayın.
   2. S+ ve S-koku koku teslim denetleyicisine bağlanma. Bir fare odanın içine yerleştirin. Fare odası kapatın ve sahne 4B programına başlamak. Bu aşamada tam dikkate vardır > doğruluk ile 60 dakika içinde 100 denemeler > % 85 (Şekil 2E)
4. Bu aşamada her fare'nın gelişimini takip etmek üzere her oturum için doğru maksimum ve minimum yüzde izlemek. Fareler yaklaşık % 85-90 bu sahne için tamamlama ölçütleri ulaşmak. Bu aşamada tamamlanması için başla/başlama-test aşamasında elde yapmak fare hariç.
5. (İsteğe bağlı) Bu aşamanın sonunda, nerede başla/başlama-odorants koku şişe platformda anahtarlanır bir ters eğitim uygulamak. Fareler yan bağlantı noktaları ile ilişkili kapakların ses gibi başka bir uyarıcı ile ilişkilendirme değil emin olun.

9. başla/başlama-tahlil görev: 1 gün, 20 dk fare günlük ücret

1. Bu koku dernekler belirleme ve koku çiftleri ayırımcılık için öğrenme doğruluk belirlemek için son aşaması düşünün.
   Not: Roman odorants S için kullanılmaktadır +/ S-ne kadar hayvan test etmek için almak yeni dernekler öğrenmek için. Yapısal olarak benzer propil çiftleri görev zorluk artırmak için kullanılır. Örnek 1-Butanol 1-Pentanol, izoamil asetat izoamil bütrat, vs. verilebilir ve + Carvone vs - Carvone.
2. Programlama yönergeleri
   1. Burnunu poke uzunluğunu tespit eğitim yazılımı izin. 300 ms burun körü Merkezi koku bağlantı noktası görevi yürütmesi için program.
   2. Çıkış parametreleri aynı sahne 4B, herhangi bir ışık destekli kullanmayın dışında ayarla İpuçları.
3. Kutusu yapılandırma ve fare ayarlar─▒n─▒
   1. Kutusu yapılandırma aynı önceki sahne 4B ayarlayın.
   2. S+ ve S-koku koku teslim denetleyicisine bağlanma. Bir fare odanın içine yerleştirin. Fare odası kapatıp sahne başla/başlama-program başlamak. Kimyasal olarak benzer kokuların roman çiftleri koku öğrenme göreve öğrendim fareler ortaya çıkarmak.
      Not: Yeterli koku ayrımcılık ile Wildtype fareler ulaşmak > % 85 doğruluk ile yaklaşık 10-20 blok veya 200-400 denemeler (şekil 3A) sonra roman odorants.

Sonuçlar

Fareler koku öğrenme görev öğrendim sonra onlar şimdi roman koku çiftleri ödül ve ceza ile ilişkilendirebilirsiniz. Bu eğitimli fareler, normalde yaklaşık %50 ile başlamak başla/başlama-görev üzerinde doğruluk. Doğru yüzde deneme bloğu tarafından roman koku çiftleri (şekil 3A) için bir öğrenme eğrisi olarak çizilebilir. Gerçekleştirmek için 30 dk daha az çoğu fare al, 10 içinde blok denemeler, fareler doğr...

Tartışmalar

Kemirgen koku alma sistemi duyusal bağımlı plastisite eğitim için benzersiz bir model sağlar. Burada fareler propil çiftleri bir ödül veya ceza ile ilişkilendirmek için eğitmek için bir koku öğrenme paradigma mevcut. Bu öğrenme görevi aşağı akım devre değişiklikler sonraki deneylerde (Elektrofizyoloji, in vivo nöronal görüntüleme, vb) okudu olabilir. Tamamlandıktan sonra fare bir su ödül bir koku ile ve bir zaman aşımı ceza başka bir koku ile ilişkilendirmek için bir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass vial	Qorpak	GLC-01016
Silicon Tubing	Thermo Scientific	86000030
18 gauge needles	BD	305196
1-Butanol	Sigma Aldrich	437603
Propionic Acid	Sigma Aldrich	402907
Mouse Chamber	Med Associates	ENV-307W
Chamber Floor	Med Associates	ENV-307W-GFW
Water Port	Med Associates	ENV-313W	Need two
Odor stimulus	Med Associates	ENV-275	Contain 2 valves to gate odor delivery
Odor Port	Med Associates	ENV-375W-NPP
USB Interface	Med Associates	DIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meter	VWR	97004-952
Behavioral software	Med Associates	SOF-735	This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer software	Med Associates	SOF-731	This software formats the data to Excel
Training Software	Med Associates	DIG-703A-USB	This software is used to program each training stage
Water Valve	Neptune Research	225P012-11	This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor Valve	Neptune Research	360P012-42	This valve is used to gate the odor delivery. Need Two