JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы обучаем мыши на задачу ассоциативные обучения для тестирования запах дискриминации. Этот протокол также позволяет для исследований по вопросам обучения индуцированная структурные изменения в головном мозге.

Аннотация

Обоняние является преобладающим сенсорные модальности в мышах и влияет на многие важные поведения, включая нагула, обнаружения хищника, спаривания и воспитания. Важно отметить, что мыши могут быть обучены связать Роман запах с конкретных поведенческих реакций, чтобы обеспечить проницательность в функцию обоняния цепи. Этот протокол подробно процедура подготовки мышей на Go / оперантной обучения задачу. В этом подходе мышей обучаются на сотни автоматизированных процессов ежедневно для 2 – 4 недели и затем могут быть проверены на роман Go / запаха пар для оценки обонятельных дискриминации, или использоваться для исследований как запах обучения изменяет структуру или функцию обоняния цепи. Кроме того мышь обонятельные луковицы (OB) есть Продолжающаяся интеграция взрослого родился нейронов. Интересно, что обонятельные обучения увеличивает выживание и синаптических связей этих нейронов, взрослого родился. Таким образом этот протокол может сочетаться с другими биохимическими, электрофизиологических и изображений методами учиться обучения и деятельности зависимых факторов, которые посредником выживаемость нейронов и пластичности.

Введение

Мышь Обь, где запах информации впервые входит центральной нервной системы (ЦНС), обеспечивает отличную модель для изучения опыта-зависимых от структурных изменений. OB-амперный постоянно интегрирует взрослого родился нейронов образом зависящих от деятельности. Взрослый родился нейрон прекурсоров разделить покинуть из прародителей, которые выстилают субвентрикулярной зоны, прилегающей к боковых желудочков1. После переноса в Обь, эти нейронные прекурсоров выжить, дифференцировать и интегрировать как тормозной блок ячеек или проходят apoptosis2. Выбор для ячейки судьба зависит от обонятельных деятельности, включая обонятельных обучения3,4,5,6. После интеграции обучения индуцированная синаптических изменения происходят в клетках гранул в течение двух недель критического периода7,8. Таким образом анализы для обоняния обучения являются полезными для изучения как опыт зависимых пластичности влияния структурных и функциональных реорганизации цепи зрелых мозга.

Этот протокол предлагает один из подходов к обонятельной обучения с использованием парадигмы оперантного кондиционирования. В этой задаче лишен воды мышей обучаются связать один запах («Go» запах) с наградой воды и другой запах («Закрытых» запах) с ожидания судебного наказания. Мышей прогресс через серию градуированных подготовки фаз в течение 2-4 недель. После завершения подготовки мышей реагировать на ходу или бесполезное запах с дискретной, соответствующего поведения (ищу награду воды на ходу испытаний и не ищет воды награду на запретную испытаний) (рис. 1A). После обучения, мышей может оспариваться далее с химически аналогичные запах пар для тестирования дискриминации или стать transitioned к изучает расследования как обонятельных обучения изменяет структуру или функцию Оби. Хотя запах дискриминации задачи описали ранее, наиболее полагаться на субъективные измерений, таких как количество нюхает между двумя отдушки9,10. Кроме того потребность человека забил такие задачи также требует больших затрат времени. Go / обонятельных обучения задачи, описанные в настоящем Протоколе предлагает беспристрастной, прямое измерение запах дискриминации и обонятельные обучения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все мыши были использованы под протоколом, утвержденным Baylor колледж медицины институциональных животных ухода и использования Комитетом в соответствии со стандартами NIH. Мышей, используемые в настоящем протоколе были все взрослых мышей (> 6 недель возраста) на C57BL6/j фон и включали как мужчин, так и женские мышей. После подготовки/постановка задачи мышей возвращаются в свои дома клетке.

1. Строительство и общие правила для использования оперантного обучения Box (Рисунок 1B, C)

  1. Соберите мыши камере с пола камеры. Держите поле обучение в низкий трафик, тускло освещенной области, чтобы избежать отвлекающих факторов.
  2. Просверлите каждый порт воды с небольшим отверстием на вершине, чтобы позволить 18 иглы отказаться от воды внутри порта.
  3. Заполните стеклянный флакон с одоранта, растворенного в минеральном масле (заменил за неделю) и надежно завинтите крышку.
  4. Соединить Силиконовая трубка 18-иглы. Пробить стеклянный флакон колпачок с 18-калибровочного иглой и подключите другой конец трубки силиконовые потребление запах портов.
  5. Место каждого Силиконовая трубка в клапан с запахом.
  6. Подключите линии вакуумной к портам запах.
  7. Прикрепите два 10 мл-шприцы Металл Холдинг стержень и подключение труб к шприцы. Подключите другой стороне трубки иглы 18 G. Игла вписываются в просверленное отверстие порта совать нос в камере мыши. Подключите другой конец шланга к клапан воды.
  8. Заполните два 10 мл-шприцы грызунов питьевой водой.
  9. Подключение воздуха-расходомер для забора воздуха и поддерживать поток воздуха на 3-5 Л/мин.
  10. Подключите 2 водяные клапаны, 2 клапанов с запахом, 2 портов, запах порт и питания к системе интерфейс USB. Подключите все клапаны «Выход» порты, все порты запах и воды «Ввод» порты. Подключите все оборудование для питания выходы из окна интерфейса USB и наконец, подключить USB интерфейс к власти.
  11. Отрегулируйте вакуумного всасывания, чтобы избежать перекрестного загрязнения запахов между испытаниями.
  12. Используйте запах конкретного труб для подключения одоранта флаконов в палату.

2. мыши подготовка: 1 – 3 дня

  1. Разделите мышей на 3 группы: управления (нет необходимости обонятельных обучения), псевдо-подготовленных (мышей, получающих вознаграждение или наказание наугад) и подготовку групп. Разоблачить псевдо-обученных мышей для обучения ящик и запах, но не дают обонятельный обучения потому, что итоги награду и наказание случайным образом ассоциируется с запахом доставлены.
    Примечание: Псевдо-обученные группы будет проходить через обучение парадигмы в стадии «Pseudotraining». Обученные мыши будет завершить все этапы обучения. Pseudotraining является необязательным, если цель эксперимента пробирного поведенческие различия в запах дискриминации или обучения. Протоколу при условии, что здесь добавляет эту группу, если экспериментатор хочет зонд для нейронов различия до и после тренировки. Pseudotrained группа будет затем управления для воздействия пассивного запаха и не обонятельный связанные учебных.
  2. Начать воды ограничений в мышей до 40 мл/кг/день. Избегайте потери веса более чем на 20% животных базовый вес во избежание бедствие (рисA).
  3. Чтобы убедиться, что они находятся выше 80% массы исходных весят мышей ежедневно. Если мышь падает ниже этого порога, удалите мышь из исследования и обеспечивают свободный доступ к воде.
  4. Держите все экологические факторы постоянной на протяжении всего протокола, включая температуру, шум и бродячих запахов (включая личные тела и ароматы духов/Кельн/дезодорант).
    Примечание: Как с все испытания поведения животных, небольшие экологические изменения могут значительно повлиять результаты.

3. инструкции для всех этапов

  1. Код учебного программного обеспечения для каждой стадии ниже. Запустите программное обеспечение на поведенческие программного обеспечения.
    Примечание: Кодирования для всех этапов, содержатся в дополнительном кодирования файлов. Данные для 20 тропы сгруппированы как единый блок и мышь производительности отображается через блоки. Кроме того каждый этап может повторяться мыши на несколько дней, пока не будут выполнены критерии завершения.
  2. Не держите мышей в поле поведение для более чем 60 мин/день.
  3. Чистой мыши отходы от клетки перед каждой мыши переходит к клетке. Спрей и протрите в камеру с 70% этанола для сведения к минимуму отвлечение запах мыши.

4. Подготовка 1 этап: Связывание воды вознаграждение с совать нос центр, 1-3 дня

  1. В этой стадии свяжите мышей с водой вознаграждение по исследованию воды порта.
  2. Подготовка инструкции по программированию Stage 1
    1. Программы этой стадии только использовать порт доставки воды. Пусть мыши получить награду воды для каждого совать нос.
      Примечание: Программа будет выводить продолжительность судебного разбирательства и общее количество воды награды получили мыши.
  3. Установите pseudotraining Stage 1 Программирование то же самое, как обучение Stage 1.
  4. В стандартной конфигурации и настройки мыши
    1. Настройте поле поведение с портом воды в центре и все порты стороне недоступными. Место мыши в камеру. Закрыть камеру мыши и начать этап 1 программы.
  5. Рассмотрим этот этап как завершенные, когда мышь достигает 100 испытания в течение 60 мин удалить мыши из камеры после 60 мин или 100 испытания были завершены (рис. 2B).
    Примечание: Из-за индивидуальных различий, некоторые мыши будет естественно воздержаться от изучения поле.
  6. Если необходима поддержка, вручную доставить воду в воду-порт. Повторите этот этап для до 3 дней.
    Примечание: Мышей, которые уже обучаются может повторяться далее поддерживать паритет и держать их на ограничение жидкости. Это также можно содействовать целую группу к этапу 2, при среднем группа достигает 100 испытания/60 мин. Это позволит обеспечить всех мышей, чтобы продолжить обучение в тот же день.

5. обучение этап 2: Связывание в сторону порта воды награду с центр Порт совать нос, 1 – 5 дней

  1. В этой стадии пусть мышей совать свой нос в центре Порту и затем сразу же получить награду воды на стороне портов.
  2. В стандартной конфигурации и настройки мыши
    1. Настройте этот и все последующие стадии с 2 портами воды на сторонах и запах порт в середине. Место мыши в камеру. Закрыть камеру мыши и начать этап 2 программы.
  3. Обучение 2 этап программирования инструкции
    1. Предоставить мышь с наградой немедленное воды с обеих сторон после совать нос в центре Порт доставки запах. Задать параметры вывода для этой стадии как продолжительность судебного разбирательства, количество судебных процессов начато, и количество воды награды, полученные в течение 5 s совать нос.
  4. Установите pseudotraining этап 2, то же самое, как обучение этап 2 Программирование.
  5. Рассмотрим этот этап как завершенный, когда минимум 40 испытания выполняются в 60 мин, по крайней мере 25% воды награды, полученные в течение 5 s совать нос порт центра. По завершении этого этапа (рис. 2C) удалите мышь.
    Примечание: Учебная программа вычисляет процент воды награды, полученные своевременно для того, чтобы определить завершение этого этапа. Хотя мышей различаются в том, как быстро они завершить этот этап, большинство мышей достигнет критерии завершения в течение 5 дней. Однако если мышь не завершили этот этап в течение 5 дней, не заранее мышь на следующий этап. Эта мышь будет удален из когорты.

6. обучение этап 3: Связывание воды вознаграждение со специфическим запахом и в течение определенного времени окна, 1-3 дня

  1. В этой стадии пусть мышей получить идти (S+) запах после совать нос в центре Порту. Впоследствии, выход воды награду после совать нос в сторону порты воды в течение 5 s.
  2. Инструкции по программированию 3 стадии обучения
    1. Доставить S+ запах в центре Порт запах.
    2. Доставить воду вознаграждение, если мышь тычет в сторону порты в течение 5 s доставки запах.
      Примечание: Программа начинается только требуя совать нос 100 мс в центре Порту приносить награду воды. После того, как мышь тычет в центре Порт для правильного количества времени в 80% судебных разбирательств, длительность совать нос, необходимые для воды вознаграждение увеличится на 50 мс до 400 мс.
    3. Задайте параметры вывода идентичны к стадии 2.
  3. Установите pseudotraining этап 3 инструкции по программированию же как 3 стадии обучения. Однако не подключайте S+ запах к контроллеру доставки запах чтобы убедиться что S+ запах связан не с наградой воды.
  4. В стандартной конфигурации и настройки мыши
    1. Установите ту же конфигурацию на этапе 2.
    2. Подключите S+ запах запах контроллер доставки. Место мыши в камеру. Закрыть камеру мыши и начать этап 3 программы. После завершения этой стадии, удалите мышь.
  5. Рассмотрим этот этап как завершенный, когда есть более чем 60 награды в течение 60 мин (Рисунок 2D).

7. этап 4A: ассоциировать запах бесполезное (S-) и ожидания наказания, 1 – 2 дня

  1. В этой стадии ввести мышей к запретной запах (S-). Предоставляют время наказания для мышей, которые неправильно идти к портам воды после пахнуть запретной запах.
  2. Подготовка инструкции по программированию на стадии 4A
    1. Доставить только S+ одоранта в этой стадии в начале, идентичны к этапу 3. После завершения 40 испытаний мышей Начните случайных доставки запахов включить S+ и S-запахи. Программа 2-s время ожидания наказания если мышь пытается искать воду награду после предъявления запретной запах.
      Примечание: Для оказания помощи в разграничении идти против бесполезное, ИК бортовые огни можно манипулировать таким образом, чтобы они на во время идти отдушки и выключения течение запретной одорантов. Огни в качестве вторичного Кий для помощи мышей в начальной подготовки. После того, как мышь обучаются с огнями, они должны заместитель идти обучение без света, чтобы подтвердить, что они научились задачу с запахов.
    2. Задайте параметры вывода как продолжительность судебного разбирательства, количество судебных процессов начато, количество завершенных судебных разбирательств, % правильно, и общее количество полученных наград.
  3. Установите pseudotraining стадии 4A инструкции по программированию же как этап подготовки 4S за исключением S+ и S-запахи представлены случайным образом с самого начала. Дать воде вознаграждение или ожидания наказания наугад, независимо от выполнения задач.
  4. В стандартной конфигурации и настройки мыши
    1. Настроить поле же как предыдущий этап 3.
    2. Подключиться к контроллеру доставки запах S+ и S-запах. Место мыши в камеру. Закрыть камеру мыши и начать этап программы 4A. После испытания, полный 40 мышей перейдите программу случайным образом доставить запахи. После завершения этой стадии, удалите мышь.
  5. Рассмотрим этот этап как завершенный, когда есть 40 испытаний с > 60% правильных ответов.

8. этап 4B: сопоставление запах бесполезное (S-) и время ожидания наказания, 5 – 11 дней

  1. Обучение этап 4б программирования инструкции
    1. Сделать этот этап идентичен стадии 4A, однако время ожидания наказание за попытку награду воды после S-запах 4 s.
  2. Установите pseudotraining этап 4б программирование инструкции идентичен стадии 4A, однако вознаграждение воды и время ожидания наказания случайно доставляются в суд.
  3. В стандартной конфигурации и настройки мыши
    1. Настроить поле же как предыдущий этап 4A.
    2. Подключиться к контроллеру доставки запах S+ и S-запах. Место мыши в камеру. Закрыть камеру мыши и начать этап 4б программы. Рассмотрим этот этап полной, когда есть > 100 испытания в течение 60 мин с точностью > 85% (Рисунок 2E)
  4. Следить за правильным для каждого сеанса для отслеживания прогресса в каждой мыши в этой стадии максимальный и минимальный процент. Приблизительно 85-90% мышей достичь критерии завершения для этого этапа. Исключите мышей, которые не добиться завершения этого этапа для Go / фазы тестирования.
  5. (Необязательно) В конце этой стадии примените обучение разворота, где Go / отдушки переключаются на платформе флакон запах. Убедитесь, что мышей не связать с другим стимулом, например звук клапанов, связанные с портами стороне.

9. Go/анализа задачи: 1 день, 20 мин на мышь в день

  1. Рассмотрим это как заключительный этап для определения точности идентификации запаха ассоциаций и учить различать запах пар.
    Примечание: Роман отдушки используются для S +/ S-проверить сколько животных принимают выучить новые ассоциации. Структурно аналогичных одоранта пары используются для увеличения сложности задачи. Примеры включают в себя 1-бутанол против 1-Pentanol, изоамиловый ацетата против изоамиловый бутират, и + карвона против - карвона.
  2. Инструкции по программированию
    1. Пусть обучения программное обеспечение определить длину совать нос. Программа 300 мс носом тыкать в центр запах порт для выполнения задачи.
    2. Задать параметры вывода идентичен этап 4б, за исключением не использовать любой свет руководствуясь подсказками.
  3. В стандартной конфигурации и настройки мыши
    1. Настроить поле же как предыдущий этап 4б.
    2. Подключиться к контроллеру доставки запах S+ и S-запах. Место мыши в камеру. Закрыть камеру мыши и начать этап Go/программы. Разоблачить мышей, которые научились обонятельные обучения задачу Роман пар химически аналогичные запахов.
      Примечание: Wildtype мышей с дискриминацией надлежащей запах достичь > 85% точности с Роман отдушки после приблизительно 10-20 блоков или 200-400 испытаний (рисA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После мышей научились обонятельные обучения задачи, они могут теперь связать Роман запах пар с награду и наказание. Эти обученные мыши обычно начинаются с около 50% точность на Go / задача. Процент правильных можно изобразить на испытательный блок как кривой обучения для...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Грызун обонятельной системы обеспечивает уникальную модель для изучения сенсорных зависимых пластичности. Здесь мы представляем обонятельных обучения парадигмы обучить мышей, чтобы связать одоранта пар с награду или наказание. Посредством этой задачи обучения ниже по течению цепи и...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что без конфликта интересов и не конкурирующие интересы.

Благодарности

Этот протокол приспособлен от предыдущей работы в нашей лаборатории (Хуан и др. 8). все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) колледж Бейлор. Она поддерживается Макнэйр медицинский институт, Грант R01NS078294 NINDS для B.R.A., низ IDDRC Грант U54HD083092, NIDDK Грант F30DK112571 СПМ и Грант F31NS092435 NINDS в CKM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass vialQorpakGLC-01016
Silicon TubingThermo Scientific86000030
18 gauge needlesBD305196
1-ButanolSigma Aldrich437603
Propionic AcidSigma Aldrich402907
Mouse ChamberMed AssociatesENV-307W
Chamber FloorMed AssociatesENV-307W-GFW
Water PortMed AssociatesENV-313WNeed two
Odor stimulusMed AssociatesENV-275Contain 2 valves to gate odor delivery 
Odor PortMed AssociatesENV-375W-NPP
USB InterfaceMed AssociatesDIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meterVWR97004-952
Behavioral softwareMed AssociatesSOF-735This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer softwareMed AssociatesSOF-731This software formats the data to Excel
Training SoftwareMed AssociatesDIG-703A-USBThis software is used to program each training stage
Water ValveNeptune Research225P012-11This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor ValveNeptune Research360P012-42This valve is used to gate the odor delivery. Need Two

Ссылки

  1. Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).
  2. Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).
  3. Yamaguchi, M., Mori, K. Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb. PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).
  4. Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory. J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).
  5. Arenkiel, B. R., et al. Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing. PloS one. 6 (12), 29423(2011).
  6. Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).
  7. Quast, K. B., et al. Developmental broadening of inhibitory sensory maps. Nat Neurosci. 20 (2), 189(2017).
  8. Huang, L., et al. Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb. J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).
  9. Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Sci. (99), e52615(2015).
  10. Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).
  11. Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat Neurosci. 3 (10), 1035(2000).
  12. Cang, J., Isaacson, J. S. In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb. J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).
  13. Parthasarathy, K., Bhalla, U. S. Laterality and symmetry in rat olfactory behavior and in physiology of olfactory input. J Neurosci. 33 (13), 5750-5760 (2013).
  14. Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. Rats smell in stereo. Science. 311 (5761), 666-670 (2006).
  15. Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes. J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).
  16. Sakamoto, M., et al. Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning. J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).
  17. Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566(2016).
  18. Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nat Neurosci. 20 (4), 612(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133No Go Go

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены