מבחן אובייקטיבי, לשחזור של למידה חוש הריח ואפליה בעכברים

Summary

כאן, אנחנו מאמנים עכברים בפעילות associative learning כדי לבדוק את ריח אפליה. פרוטוקול זה מאפשר גם במחקרים על למידה-induced שינויים מבניים במוח.

Abstract

חוש הריח המודאליות חושית הדומיננטית בעכברים, משפיע על התנהגויות חשובות רבות, כולל שיחור מזון, איתור טורף, הזדווגות, והורות. חשוב, עכברים יכולים להיות מאומנים כדי לשייך ריחות הרומן תגובות התנהגותיות ספציפיות כדי לספק תובנות פונקציה מעגל חוש הריח. פרוטוקול זה מפרט את ההליך עבור עכברים הדרכה בפעילות הולכים/לא הולכים למידה operant. בגישה זו, עכברים מאומנים על מאות ניסויים אוטומטית מדי יום במשך 2-4 שבועות, ואז יכול להיבדק על הרומן הולכים/לא הולכים ריח זוגות כדי להעריך את חוש הריח אפליה, או לשמש עבור מחקרים על איך ריח למידה משנה את מבנה או הפונקציה של חוש הריח מעגל. בנוסף, הנורה הריח העכבר (אבוב) כולל אינטגרציה מתמשכת של מבוגר-נולד נוירונים. מעניין, חוש הריח למידה מגביר הישרדות והן קשרים סינפטיים של נוירונים אלה למבוגרים-נולד. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם טכניקות טיפול נוספות הביוכימי אלקטרופיזיולוגיות, הדמיה ללמוד למידה, תלויי-פעילות גורמים מתווכים עצביים הישרדות, פלסטיות.

Introduction

העכבר אבוב, שבו מידע ריח נכנס לראשונה על מערכת העצבים המרכזית (CNS), מספק מודל מצויין ללמוד שינויים מבניים תלויי-ניסיון. OB circuity משתלבת ללא הרף למבוגרים-נולד נוירונים באופן בלתי תלוי-פעילות. מבוגר-נולד נוירון מבשרי לחלק של אבות כי קו לאזור subventricular הסמוך החדרים הצדדיים¹. בעת העברת לתוך המכ, מבשרי עצביים אלה לשרוד, להבדיל, ו לשלב כתאי גרגר מעכבות או עוברים אפופטוזיס². הבחירה לגורל תא מושפעת פעילות חוש הריח, כולל למידה חוש הריח^3,4,5,6. לאחר שילוב, מתרחשים שינויים סינפטיים הנוצרות על-ידי למידה בתאים גרגר במהלך שבועיים קריטי תקופה^7,8. לפיכך, מבחני ללמידה חוש הריח שימושיים לבחינת תלויי-ניסיון איך פלסטיות השפעות מבניות ופונקציונליים ארגון מחדש של מעגל חשמלי במוח הבוגר.

פרוטוקול זה מציע גישה אחת הכשרה חוש הריח באמצעות של פרדיגמה אופרנטית. במשימה זו, עכברים נטולי מים מאומנים כדי לשייך עונש זמן קצוב משפט אחד (לריח "ללכת") עם פרס המים וריח אחר ריח (ריח "האסור"). עכברים התקדמות דרך סדרה מדורגת של הכשרה שלבים במשך 2-4 שבועות. בסיום ההכשרה, עכברים להגיב לריח או מבוטל עם התנהגויות דיסקרטית, המקביל (המבקשים פרס מים על ניסויים קדימה, לא מחפשים. הפרס מים על ניסויים האסור) (איור 1א'). לאחר השלמת התרגול, עכברים ניתן לערער עוד יותר עם זוגות ריח כימי דומה לבדיקת אפליה או להפוך לקביעת מחקרים למידה איך הריח החוקר משנה את מבנה או הפונקציה של הרופא הקבוע למרות ריח אפליה הפעילויות שתוארו קודם לכן, ביותר להסתמך על מדידות סובייקטיבית כגון מספר שמסניפים בין שני odorants^9,10. יתר על כן, הצורך האנושי הניקוד של משימות כגון הוא גם אינטנסיבית. הפעילות הולכים/לא הולכים חוש הריח למידה המתוארים פרוטוקול זה מציע לא משוחדת, ישיר מדידה של אפליה ריח ולמידה חוש הריח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העכברים שימשו תחת פרוטוקול אושרה על ידי ביילור המכללה של רפואה מוסדיים חיה טיפול שימוש הוועדה בהתאם לסטנדרטים NIH. עכברים בשימוש פרוטוקול זה היו עכברים בוגרים כל (> גיל 6 שבועות) ב- C57BL6/j רקע וכללה עכברים גם זכר וגם נקבה. לאחר פעילויות הדרכה/הזמני, עכברים מוחזרות אל הכלוב שלהם הביתה.

1. בנייה, חוקים כלליים לשימוש Operant למידה תיבת (איור 1B, C)

1. להרכיב תא עכבר עם רצפת החדר. להשאיר את תיבת הכשרה בפקק נמוך, אזור בתאורה כדי למנוע הסחות דעת.
2. תרגיל כל יציאת מים עם חור קטן על גבי כדי לאפשר של מחט בקוטר 18 לוותר על מים בתוך הנמל.
3. מילוי בקבוקון זכוכית עם odorant מומס שמן מינרלי (מוחלפים שבועית), בצורה מאובטחת להדק את הכובע.
4. להתחבר מחט בקוטר 18 סיליקון אבובים. פירס קאפ בקבוקון זכוכית עם מחט בקוטר 18, וחבר את הקצה השני של סיליקון אבובים הצריכה של היציאות ריח.
5. מקם כל צינורות סיליקון לתוך השסתום ריח.
6. להתחבר לקו ואקום ליציאות ריח.
7. לצרף שני מזרקים 10 מ"ל מוט מתכת אחזקות, להתחבר לצנרת תארגן את הדברים. להתחבר לצד השני של הצנרת מחט 18 גרם. להתאים את המחט לתוך החור מסועף של היציאה לתקוע את האף על תא העכבר. חבר את הקצה השני של הצנרת השסתום במים.
8. למלא את שני מזרקים 10 מ"ל מים לשתיה מכרסמים.
9. להתחבר עם מד זרימת אוויר צריכת האוויר ולשמור על זרימת האוויר ב- 3-5 L/דקה.
10. לחבר את 2 שסתומים מים, 2 שסתומים ריח, 2 יציאות מים, ריח יציאת וכוח למערכת ממשק USB. להתחבר שסתומים כל יציאות 'פלט', לכל ריח ומים היציאות 'קלט' יציאות. התחבר כל ציוד חשמל פלטי מהתיבה ממשק USB, ולהתחבר לבסוף, תיבת ממשק USB לשלטון.
11. להתאים את היניקה ואקום כדי למנוע זיהום צולב של ריחות בין ניסויים.
12. השתמש אבובים ריח ספציפי כדי להתחבר בקבוקונים odorant לתא.

2. העכבר הכנה: 1 – 3 ימים

1. לחלק עכברים 3 קבוצות: שליטה (אין הכשרה חוש הריח הכרחי), מיומן מדומים (עכברים המקבלים גמול או עונש באקראי), הכשרה לקבוצות. לחשוף עכברים מדומים הכשרה להעברת תיבת ואת ריח האימונים, אך אינם מספקים הדרכה חוש הריח כי התוצאה של גמול נגד ענישה משויך באופן אקראי עם הריח מועברים.
   הערה: הקבוצה מדומים מיומן יעברו הכשרה הפרדיגמה תחת בשלבים "Pseudotraining". עכברים מיומן ישלימו את כל שלבי ההכשרה. Pseudotraining הוא אופציונלי אם מטרת הניסוי היא assay על הבדלים התנהגותיים ריח אפליה או למידה. הפרוטוקול מסופקים שכאן מוסיף קבוצה זו אם הנסיין רוצה לחקור עצביים ההבדלים לפני ואחרי האימונים. הקבוצה pseudotrained ישלטו ואז ריח פסיבי חשיפה והדרכה הקשורים-חוש הריח.
2. להתחיל הגבלת מים בעכברים כדי 40 מ"ל/ק"ג/יום. למנוע אובדן משקל גוף גדול מ- 20% ממשקל בסיסית החיה כדי למנוע מצוקה (איור 2א).
3. שוקלים העכברים מדי יום כדי להבטיח שהם מעל 80% ממשקל בסיסית. אם עכבר יורד מתחת לסף זה, להסיר את העכבר מן המחקר ולספק גישה חופשית למים.
4. שמור כל הגורמים הסביבתיים קבועה לאורך כל פרוטוקול כולל טמפרטורה, רעש, ריחות תועה (כולל ריחות בושם/בושם/דאודורנט והגוף אישי).
   הערה: כמו עם כל הבדיקות התנהגות בעלי חיים, שינויים סביבתיים קטן יכול מאוד להשפיע על התוצאות.

3. הנחיות בכל שלבי

1. קוד תוכנה הדרכה עבור כל שלב להלן. להפעיל את התוכנה על התוכנה התנהגותית.
   הערה: קידוד עבור כל השלבים הכלולים קבצי קידוד משלימה. נתונים עבור 20 מסלולי מקובצים כמו מופע יחיד בלוק ועכבר מוצג לאורך רחובות. יתר על כן, בכל שלב ניתן לחזור על העכבר במשך מספר ימים, עד השלמת הקריטריונים ימולאו.
2. אל תשמור עכברים בתיבת התנהגות עבור יותר מ 60 דקות/יום.
3. העכבר נקי פסולת מן הכלוב לפני כל עכבר מועברת לכלוב. רסס ונגב את התא עם 70% אתנול כדי למנוע הפרעות ריח העכבר.

4. אימון שלב 1: שיוך מים פרס עם האף למרכז דגדג, 1-3 ימים

1. בשלב זה, לשייך עכברים פרס מים על חקר יציאת מים.
2. אימון שלב 1 הוראות תכנות
   1. תוכנית בשלב זה רק להשתמש הנמל משלוח מים. תן את העכבר ולקבל תגמול מים על כל לתקוע את האף.
      הערה: התוכנית יהיה הפלט משך הזמן של המשפט, המספר הכולל של מים מזכה את העכבר התקבל.
3. הגדר את שלב א' pseudotraining תכנות כמו אימון שלב 1.
4. תיבת התקנה וקביעת תצורה של העכבר
   1. לקבוע את תצורת תיבת התנהגות עם יציאת מים במרכז, עם כל היציאות לוואי בלתי נגישים. הנח את העכבר אל החדר. לסגור את תא העכבר ולהתחיל את התוכנית בשלב א'.
5. לקחת בחשבון בשלב זה כמשימה שהושלמה כאשר העכבר משיגה ניסויים 100 בתוך 60 דקות להסיר העכבר מן החדר לאחר 60 דקות או מבחנים 100 כבר הושלמה (איור 2B).
   הערה: עקב הבדלים אישיים, עכברים באופן טבעי יימנעו לחקור את התיבה.
6. אם עידוד נחוצה, באופן ידני לספק מים לתוך יציאת מים. חזור על שלב זה עד 3 ימים.
   הערה: עכברים כבר מאומנים שיכול לחזור עוד יותר כדי לשמור על הזוגיות, לשמור אותם על הגבלת נוזלים. אפשרי גם לקדם קבוצה שלמה לשלב 2 קבוצה הממוצע מגיע ל 100 ניסויים על 60 דקות. זה יאפשר עכברים כל להמשיך אימון באותו יום.

5. אימון שלב 2: פרס המים הצדדית שיוך יציאה ממרכז האף פוק, 1 – 5 ימים

1. בשלב זה, תן העכברים לתקוע את האף שלהם בנמל מרכז, לאחר מכן מיד מקבלים גמול מים ביציאות בצד.
2. תיבת התקנה וקביעת תצורה של העכבר
   1. להגדיר את זה, בכל שלב לאחר מכן עם 2 יציאות מים על הצדדים והנמל ריח באמצע. הנח את העכבר אל החדר. לסגור את תא העכבר ולהתחיל את התוכנית שלב 2.
3. אימון שלב 2 הוראות תכנות
   1. לספק העכבר פרס מים מיידי משני הצדדים לאחר דגדג את האף אל המרכז יציאת המשלוח ריח. להגדיר את פרמטרי פלט בשלב זה כמו משך הזמן של המשפט, מספר הנסיונות יזמה מספר פרסים מים התקבל בתוך 5 s של אגרוף באף.
4. הגדר את שלב 2 pseudotraining תכנות כמו אימון שלב 2.
5. לקחת בחשבון בשלב זה כמשימה שהושלמה כאשר מינימום של 40 ניסויים מתבצעות ב 60 דקות, לפחות 25% של המים פרסים התקבל בתוך 5 s של לתקוע את האף את מרכז יציאה. להסיר את העכבר לאחר שלב זה השלים (איור 2C).
   הערה: התוכנית אימונים מחשבת את אחוז המים התגמולים קיבל באופן מסודר על מנת לקבוע השלמתו של שלב זה. למרות עכברים להשתנות כמה מהר הם להשלים שלב זה, במרבית העכברים יגיעו קריטריוני השלמה בתוך 5 ימים. עם זאת, אם עכבר לא הושלמה בשלב זה בתוך 5 ימים, לא מראש את העכבר לשלב הבא. העכבר הזה יוסר קבוצה.

6. אימון שלב 3: שיוך פרס מים עם ריח מסוים, בתוך חלון זמן ספציפי, 1-3 ימים

1. בשלב זה, תן העכברים מקבלים ריח ללכת (S+) על אגרוף באף לנמל מרכז. לאחר מכן, תשואות פרס מים עם טיפת האף לתוך היציאות מים בצד בתוך 5 s.
2. הכשרה בשלב 3 הוראות תכנות
   1. לספק הריח S+ במרכז יציאת ריח.
   2. להעביר את הפרס מים אם העכבר הוא דוחף את היציאות צד בתוך 5 s של משלוח ריח.
      הערה: התוכנית מתחילה ואחרת רק אגרוף באף 100 ms בנמל מרכז להניב פרס המים. ברגע העכבר הוא דוחף את היציאה מרכז עבור הסכום הנכון של זמן ב- 80% של ניסויים, משך הזמן של אגרוף באף הנדרש עבור פרס המים יגדל 50 מילישניות עד 400 אלפיות השניה.
   3. הגדר את פרמטרי פלט זהה לשלב 2.
3. הגדר הוראות תכנות בשלב 3 pseudotraining זהה הכשרה בשלב 3. עם זאת, אל תחבר לריח S+ אל בקר משלוח ריח כדי להבטיח כי הריח S+ אינה קשורה פרס מים.
4. תיבת התקנה וקביעת תצורה של העכבר
   1. הגדר תצורה זהה בשלב 2.
   2. להתחבר לריח S+ הבקר משלוח ריח. הנח את העכבר אל החדר. לסגור את תא העכבר ולהתחיל את התוכנית בשלב 3. להסיר את העכבר לאחר השלמת שלב זה.
5. שקול את הבמה הזו כמשימה שהושלמה כאשר יש חזקים יותר פרסים 60 בתוך 60 דקות (איור 2D).

7. שלב 4A: שיוך מבוטל (S-) ריח ועונש פסק זמן, 1 – 2 ימים

1. בשלב זה, להכיר את העכברים ריח האסור (S-). לספק עונש פסק זמן העכברים באופן שגוי לעבור בין יציאות מים לאחר שהריח את הריח האסור.
2. שלב ההכשרה 4A הוראות תכנות
   1. לספק רק את odorant S+ בשלב זה בהתחלה, זהה לשלב 3. לאחר ניסויים 40 מלא עכברים, להתחיל אקראי מסירת ריחות כדי לכלול גם את S+ וגם את S-ריחות. תוכנית עונש פסק זמן 2-s אם העכבר מנסה לחפש פרס מים לאחר שהוצגו לריח האסור.
      הערה: כדי לסייע בהבחנה קדימה לעומת מבוטל, האורות בצד IR ניתן לטפל כך הם נמצאים במהלך odorants ללכת לסירוגין במהלך odorants האסור. האורות לשמש רמז משני כדי לסייע עכברים ההכשרה הראשונית. ברגע עכברים מאומנים עם האורות, הם צריכים ללכת תחת הדרכה ללא אורות כדי לוודא שהם למדו את הפעילות עם ריחות.
   2. הגדר את פרמטרי פלט משך זמן של משפט, מספר הנסיונות יזם, מספר הנסיונות הושלמה, אחוז נכון, המספר הכולל של תגמולים התקבל.
3. הגדר שלב pseudotraining 4A הוראות תכנות אותו אימון שלב 4S חוץ S+, S-ריחות מוצגים באופן אקראי מן ההתחלה. לתת מים עונשים גמול או פסק זמן באקראי, ללא קשר לפעילות ביצועים.
4. תיבת התקנה וקביעת תצורה של העכבר
   1. הגדר תצורת תיבת זהה הקודם שלב 3.
   2. להתחבר הבקר משלוח ריח S+ והן S-ריח. הנח את העכבר אל החדר. לסגור את תא העכבר ולהתחיל את התוכנית 4A הבמה. לאחר ניסויים 40 מלאה עכברים לעבור את התוכנית להעביר באופן אקראי את ריחות. להסיר את העכבר לאחר השלמת שלב זה.
5. שקול את הבמה הזו כמשימה שהושלמה כאשר 40 ניסויים עם > 60% תגובות נכונות.

8. במה 4B: שיוך מבוטל (S-) ריח ועונש פסק זמן, 5-11 ימים

1. שלב ההכשרה 4B הוראות תכנות
   1. להפוך בשלב זה זהה הבמה 4A, אולם העונש פסק זמן על ניסיון פרס מים לאחר ריח-S הוא 4 s.
2. הגדר את הפרס מים pseudotraining הבמה 4B תכנות הוראות זהה הבמה 4A, עם זאת, פסק זמן העונש נמסרים באופן אקראי לכל משפט.
3. תיבת התקנה וקביעת תצורה של העכבר
   1. הגדר תצורת תיבת זהה 4A בשלב הקודם.
   2. להתחבר הבקר משלוח ריח S+ והן S-ריח. הנח את העכבר אל החדר. לסגור את תא העכבר ולהתחיל את התוכנית 4B הבמה. שקול בשלב זה מלאה כאשר קיימים > ניסויים 100 בתוך 60 דקות עם דיוק > 85% (איור 2E)
4. לעקוב אחר האחוז המזערי והמרבי הנכון עבור כל מושב לעקוב אחר ההתקדמות של כל עכבר בשלב זה. כ- 85-90% של עכברים להגיע קריטריוני השלמה בשלב זה. הכללת עכברים אינם זוכים השלמת שלב זה עבור הולכים/לא הולכים שלב הבדיקה.
5. (אופציונלי) בסוף שלב זה, החל אימון היפוך, איפה הולכים/לא הולכים odorants מוחלפות על פלטפורמת המבחנה ריח. ודא כי העכברים הם לא להתרועע עם גירוי אחר, כמו הצליל של השסתומים המשויך היציאות בצד.

9. הולכים/לא הולכים assay פעילות: 1 יום, 20 דקות לכל העכבר ליום

1. . ראה זאת לשלב הגמר לקביעת רמת הדיוק של זיהוי ריח אגודות ולמידה להפלות זוגות ריח.
   הערה: הרומן odorants מנוצלים עבור S / S-כדי לבדוק כמה זמן חיות לקחת ללמוד אסוציאציות חדשות. זוגות odorant מבנית דומה משמשים כדי להגביר את הקושי של המשימות. דוגמאות 1-Butanol לעומת 1-Pentanol, אצטט Isoamyl לעומת Isoamyl Butyrate, ו + Carvone לעומת - Carvone.
2. הוראות תכנות
   1. תן את תוכנת אימון לזהות את אורך לתקוע את האף. תוכנית אגרוף באף 300 ms בנמל ריח מרכז לביצוע המשימה.
   2. הגדר את פרמטרי פלט זהה הבמה 4B, רק אל תשתמש כל האור מודרכת רמזים.
3. תיבת התקנה וקביעת תצורה של העכבר
   1. הגדר תצורת תיבת זהה 4B בשלב הקודם.
   2. להתחבר הבקר משלוח ריח S+ והן S-ריח. הנח את העכבר אל החדר. לסגור את תא העכבר ולהתחיל את הבמה הולכים/לא הולכים התוכנית. חושפים את העכברים אשר למדו את המשימה למידה חוש הריח זוגות הרומן של ריחות כימית דומה.
      הערה: להגיע Wildtype עכברים עם ריח נאותה אפליה > 85% דיוק עם הרומן odorants לאחר כ 10-20 בלוקים או 200-400 מבחנים (איור 3א).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ברגע עכברים למדו את המשימה למידה חוש הריח, הם יכולים עכשיו לקשר ריח הרומן זוגות עם שכר ועונש. אלו עכברים מיומן בדרך כלל מתחילים עם-50% דיוק במשימה הולכים/לא הולכים. ניתן להתוות את האחוז הנכון על ידי ניסיון לחסום כמו עקומת למידה עבור זוגות ריח הרומן (איור 3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מערכת הריח מכרסמים מספקת מודל ייחודי ללמוד פלסטיות התלויים חושית. כאן נציג של פרדיגמה למידה חוש הריח לאלף עכברים לשיוך odorant זוגות עם פרס או עונש. דרך פעילות למידה זו, שניתן ללמוד במורד הזרם במעגל שינויים בניסויים הבאים (אלקטרופיזיולוגיה, ויוו הדמיה עצביים, וכד'). בגמר, עכברים ילמדו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass vial	Qorpak	GLC-01016
Silicon Tubing	Thermo Scientific	86000030
18 gauge needles	BD	305196
1-Butanol	Sigma Aldrich	437603
Propionic Acid	Sigma Aldrich	402907
Mouse Chamber	Med Associates	ENV-307W
Chamber Floor	Med Associates	ENV-307W-GFW
Water Port	Med Associates	ENV-313W	Need two
Odor stimulus	Med Associates	ENV-275	Contain 2 valves to gate odor delivery
Odor Port	Med Associates	ENV-375W-NPP
USB Interface	Med Associates	DIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meter	VWR	97004-952
Behavioral software	Med Associates	SOF-735	This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer software	Med Associates	SOF-731	This software formats the data to Excel
Training Software	Med Associates	DIG-703A-USB	This software is used to program each training stage
Water Valve	Neptune Research	225P012-11	This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor Valve	Neptune Research	360P012-42	This valve is used to gate the odor delivery. Need Two