Una prova oggettiva e riproducibile di apprendimento olfattivo e discriminazione nei topi

Riepilogo

Qui, ci alleniamo topi su un compito di apprendimento associativo per testare la discriminazione di odore. Questo protocollo consente inoltre di studi sui cambiamenti strutturali indotti su apprendimento nel cervello.

Abstract

L'olfatto è predominante modalità sensoriale in topi e influenza molti comportamenti importanti, tra cui foraggiamento, rilevamento di predator, accoppiamento e genitorialità. D'importanza, topi possono essere addestrati per associare gli odori romanzo con risposte comportamentali specifiche per fornire la comprensione nella funzione olfattiva circuito. Questo protocollo in dettaglio la procedura per topi di formazione su un compito di apprendimento operante passa/non passa. In questo approccio, topi sono addestrati su centinaia di prove automatizzate al giorno per 2 – 4 settimane e possono essere testati su romanzo passa/non passa odore coppie per valutare discriminazione olfattiva, o essere utilizzato per gli studi su come apprendimento odore altera la struttura o la funzione dell'olfattiva circuito. Il bulbo olfattivo del mouse (OB) dispone inoltre di integrazione in atto dei neuroni adulti-Nato. Interessante, apprendimento olfattivo aumenta la sopravvivenza e la connessioni sinaptiche di questi neuroni adulto-Nato. Pertanto, il presente protocollo può essere combinato con altre tecniche biochimiche, elettrofisiologiche e di formazione immagine per studiare i fattori di apprendimento e attività-dipendente che mediano la sopravvivenza neuronale e plasticità.

Introduzione

Il mouse OB, dove informazioni odore entrano per la prima il sistema nervoso centrale (SNC), fornisce un eccellente modello per studiare i cambiamenti strutturali di esperienza-dipendente. I circuiti OB integra continuamente adulto-Nato neuroni in maniera dipendente di attività. Precursori del neurone adulto-Nato dividono fuori da progenitori che costeggiano la zona subventricular adiacente al ventricoli laterali¹. Dopo la migrazione in OB, questi precursori neuronali o sopravvivono, differenziano e integrano come cellule del granello inibitorio o subiscono apoptosi². Selezione per il destino della cellula è influenzata dall'attività olfattiva, cui apprendimento olfattivo^3,4,5,6. Dopo l'integrazione, cambiamenti sinaptici indotti dall'apprendimento si verificano nelle cellule del granello durante un periodo critico^7,di due settimane⁸. Così, saggi per apprendimento olfattivo sono utili per esaminare come esperienza-dipendente plasticità influenze riorganizzazione strutturale e funzionale di un circuito del cervello maturo.

Questo protocollo offre un approccio alla formazione olfattiva utilizzando un paradigma di condizionamento operante. In questo compito, topi d'acqua-sfavoriti sono addestrati ad associare un odore (odore di "Go") con una ricompensa di acqua e un altro odore (l'odore "Off limits") con una punizione di prova timeout. Progresso di topi attraverso una serie graduata di fasi di formazione nel corso di 2-4 settimane. Quando la formazione è completa, topi rispondono all'odore Go o zona pericolosa con comportamenti discreti, corrispondenti (alla ricerca di una ricompensa di acqua sulle prove di Go e non cerca la ricompensa di acqua sulle sperimentazioni off limits) (Figura 1A). Dopo l'allenamento è completo, topi possono essere ulteriormente contestati con coppie di odore chimicamente simili a test di discriminazione o diventare la transizione a studi d'istruttoria come olfattivo apprendimento altera la struttura o la funzione di OB. Anche se le mansioni di distinzione di odore precedentemente sono stati descritti, più si basano su misure soggettive quali numero di annusa tra due odoranti^9,10. Inoltre, la necessità per il Punteggio umano di tali compiti è anche dispendiose. L'attività di apprendimento olfattivo passa/non passa descritta in questo protocollo garantisce una misurazione imparziale, diretta di odore discriminazione e apprendimento olfattivo.

Protocollo

Tutti i topi sono stati utilizzati nell'ambito di un protocollo approvato dal comitato di uso e Baylor College di medicina istituzionali cura degli animali in conformità con gli standard NIH. Topi usati in questo protocollo sono stati tutti i topi adulti (> 6 settimane di età) su C57BL6/j sfondo e incluso topi sia maschili che femminili. Dopo le attività di formazione/messa in scena, topi vengono restituiti al loro gabbia a casa.

1. costruzione e regole generali per l'utilizzo di Operant apprendimento Box (Figura 1B, C)

1. Assemblare una camera del mouse con il pavimento di camera. Tenere la scatola di formazione in un basso traffico, zona poco illuminata per evitare distrazioni.
2. Trapano ogni porta di acqua con un piccolo foro in alto per consentire un ago calibro 18 erogare acqua all'interno del porto.
3. Riempire la fiala di vetro con odorant disciolto in olio minerale (sostituito settimanalmente) e serrare il tappo.
4. Collegare ago calibro 18 alla tubazione del silicone. Forare il tappo della fiala di vetro con ago calibro 18 e collegare l'altra estremità del tubo in silicone per l'assunzione delle porte di odore.
5. Posizionare ogni tubazione del silicone in una valvola di odore.
6. Collegare la linea del vuoto per i porti di odore.
7. Collegare due siringhe da 10 mL ad un'asta di metallo che tiene e collegare le siringhe. Collegare l'altra estremità del tubo di un ago da 18 G. Montare l'ago nel foro della porta poke naso sulla camera del mouse. Collegare l'altra estremità del tubo alla valvola dell'acqua.
8. Riempire le due siringhe da 10 mL con acqua potabile del roditore.
9. Collegare un misuratore di flusso d'aria per la presa d'aria e mantenere il flusso di aria a 3 – 5 L/min.
10. Collegare le 2 valvole acqua, 2 valvole di odore, 2 porte di acqua, porta odore e alimentazione per il sistema di interfaccia USB. Collegare tutte le valvole a 'Output' porte, tutte le porte di odore e acqua al 'Ingresso' porte. Collegare tutte le apparecchiature per uscite dalla casella interfaccia USB di potenza e infine, collegare la scatola di interfaccia USB per potere.
11. Regolare l'aspirazione di vuoto per evitare la contaminazione incrociata di odori tra le prove.
12. Tubazione di odore specifico consente di connettere odorant fiale alla camera.

2. Mouse preparazione: 1 – 3 giorni

1. Topi si divide in 3 gruppi: controllo (nessuna formazione olfattiva necessaria), pseudo-(topi addestrati che ricevono ricompensa o punizione a caso) e addestrato gruppi. Esporre i topi pseudo-addestrati per la consegna di casella e odore di formazione, ma non forniscono formazione olfattiva perché l'esito di ricompensa e punizione è casualmente associato con l'odore consegnato.
   Nota: Il gruppo pseudo-addestrato passerà attraverso il paradigma di formazione sotto le fasi di "Pseudotraining". Topi addestrati completerà tutte le fasi di formazione. Pseudotraining è facoltativo se lo scopo dell'esperimento è quello di analizzare per differenze di comportamento in odore di discriminazione o di apprendimento. Il protocollo prevedeva che aggiunge qui questo gruppo se lo sperimentatore vuole sonda per un neurone differenze prima e dopo l'allenamento. Il gruppo pseudotrained sarebbe quindi controllare per l'esposizione passiva odore e formazione relative al non-olfattiva.
2. Iniziare la limitazione dell'acqua nei topi a 40 mL/kg/giorno. Evitare la perdita di peso corporeo supera al 20% del peso basale degli animali al fine di evitare afflizione (Figura 2A).
3. Pesare i topi di tutti i giorni per assicurarsi che siano oltre l'80% del peso basale. Se un mouse scende sotto questa soglia, rimuovere il mouse dallo studio e fornire libero accesso all'acqua.
4. Tutti i fattori ambientali. mantenere costante in tutto il protocollo tra cui temperatura, rumore e odori randagi (compreso personale del corpo e profumi deodorante/profumo/Colonia).
   Nota: Come con tutti i test di comportamento animale, piccoli cambiamenti ambientali possono notevolmente influenzare risultati.

3. istruzioni per tutte le fasi

1. Codice software di addestramento per ogni tappa qui sotto. Eseguire il software sul software comportamento.
   Nota: Per tutte le fasi di codifica sono contenuti in file codifica supplementari. Dati per 20 sentieri sono raggruppate come un singolo blocco e mouse prestazioni viene visualizzato in blocchi. Inoltre, ogni fase può essere ripetuta su un mouse per un numero di giorni fino a quando i criteri di completamento.
2. Non tenere i topi nella finestra di comportamento per più di 60 min/giorno.
3. Rifiuti del mouse pulito dalla gabbia prima che ogni mouse è trasferito alla gabbia. Spruzzare e pulire la camera con etanolo al 70% di minimizzare le distrazioni di odore del mouse.

4. formazione fase 1: Associando i acqua ricompensa con un centro naso Poke, 1 – 3 giorni

1. In questa fase, è necessario associare topi con una ricompensa di acqua all'esplorazione del porto dell'acqua.
2. Istruzioni di programmazione 1 Stage di formazione
   1. Programma questa fase di usare solo la bocca di mandata acqua. Lasciare che il mouse riceverà una ricompensa di acqua per ogni poke di naso.
      Nota: Il programma visualizzerà la durata della prova e il numero totale di acqua premia il mouse ha ricevuto.
3. Impostare la pseudotraining fase 1 la stessa formazione fase 1 di programmazione.
4. Configurazione casella e impostazioni del mouse
   1. Configurare la casella di comportamento con una porta acqua al centro e con tutte le porte lato inaccessibile. Posto un mouse nella camera. Chiudere la camera del mouse e iniziare il programma di Stage 1.
5. Considera questa fase come completo quando il mouse raggiunge 100 prove entro 60 min. Rimuovi il mouse dalla camera dopo 60 min o 100 prove sono state completate (Figura 2B).
   Nota: A causa di differenze individuali, alcuni topi naturalmente si asterranno da esplorare la casella.
6. Se è necessario incoraggiamento, manualmente di fornire acqua alla porta dell'acqua. Ripetere questa fase per fino a 3 giorni.
   Nota: I topi che sono già addestrati possono essere ripetuti ulteriormente per mantenere la parità e per tenerli sulla limitazione fluida. È anche possibile promuovere un intero gruppo di fase 2, quando la media del gruppo raggiunge 100 prove/60 min. Questo permetterà per tutti i mouse continuare la formazione nello stesso giorno.

5. formazione fase 2: Associando i porta sul lato acqua ricompensa con centro porto naso Poke, 1 – 5 giorni

1. In questa fase, ha lasciato i topi ficcare il naso nel porto centro e quindi immediatamente ricevere una ricompensa di acqua sulle porte laterali.
2. Configurazione casella e impostazioni del mouse
   1. È possibile configurare questo e ogni fase successiva con 2 porte di acqua sui lati e la porta di odore nel mezzo. Posto un mouse nella camera. Chiudere la camera del mouse e iniziare il programma di Stage 2.
3. Istruzioni di programmazione 2 Stage di formazione
   1. Fornire il mouse con una ricompensa immediata acqua su entrambi i lati dopo un poke di naso nel centro bocca di mandata di odore. Impostare i parametri di output per questa fase come la durata del processo, il numero di prove ha avviato e il numero di acqua ricompense ricevute entro 5 s di un poke di naso.
4. Impostare il pseudotraining Stage 2 programmazione la stessa formazione Stage 2.
5. Considera questa fase come completa quando un minimo di 40 prove vengono eseguite in 60 min, con almeno il 25% di acqua ricompense ricevute entro 5 s della stoccata di naso di Porto centro. Rimuovere il mouse una volta che questa fase è stata completata (Figura 2C).
   Nota: Il programma di formazione calcola la percentuale di acqua premi ricevuti in modo tempestivo al fine di determinare il completamento di questa fase. Anche se i topi variano in quanto velocemente completano questa fase, maggior parte dei topi raggiungerà i criteri di completamento entro 5 giorni. Tuttavia, se un mouse non ha completato questa fase entro 5 giorni, non fare avanzare il mouse alla fase successiva. Questo mouse verrà rimosso dal gruppo.

6. formazione fase 3: Associando una ricompensa di acqua con un odore specifico e in un intervallo di tempo specifico, 1 – 3 giorni

1. In questa fase, lasciate che i topi ricevere un odore di andare (s +) su di un poke di naso nel porto centro. Successivamente, resa una ricompensa di acqua su un naso poke nelle porte lato acqua entro 5 s.
2. Istruzioni di programmazione 3 Stage di formazione
   1. Consegnare l'odore di s + nel centro della porta di odore.
   2. Consegnare la ricompensa di acqua se il mouse sporge le porte laterali entro 5 s di una consegna di odore.
      Nota: Il programma inizia richiedendo solo un poke di naso di 100 ms nel porto centro a cedere una ricompensa di acqua. Una volta che il mouse sporge dal centro port per la giusta quantità di tempo nell'80% delle prove, la durata di tempo di un poke di naso richiesto per una ricompensa di acqua aumenta di 50 ms fino a 400 ms.
   3. Impostare i parametri di output identici alla fase 2.
3. Impostare le istruzioni di programmazione fase 3 pseudotraining la stessa formazione Stage 3. Tuttavia, non collegare l'odore di s + al controller di consegna odore per garantire che l'odore di s + non è associato con una ricompensa di acqua.
4. Configurazione casella e impostazioni del mouse
   1. Impostare la stessa configurazione in fase 2.
   2. Collegare l'odore di s + al controller di consegna di odore. Posto un mouse nella camera. Chiudere la camera del mouse e iniziare il programma di Stage 3. Rimuovere il mouse una volta completata questa fase.
5. Considerare questa fase come completa quando ci sono maggiore di 60 premi entro 60 min (Figura 2D).

7. fase 4A: associando i zona pericolosa (S-) odore e la punizione di timeout, 1 – 2 giorni

1. In questa fase, è necessario introdurre i topi un odore no-go (S-). Fornire una punizione di time out per i topi che vanno in modo non corretto per le porte di acqua dopo sentente l'odore off limits.
2. Istruzioni di programmazione di formazione fase 4A
   1. Fornire solo il odorant s + in questa fase all'inizio, identica alla fase 3. Dopo 40 prove completa di topi, avviare l'erogazione casuale degli odori per includere sia s + e S-odori. Programma una punizione 2-s time out se il mouse tenta di cercare una ricompensa di acqua dopo essere stato presentato l'odore off limits.
      Nota: Per aiutare nella distinzione Go vs no-go, le luci laterali di IR possono essere manipolate tale che essi sono on durante Go odoranti e off durante odoranti off limits. Le luci agiscono come spunto secondario per aiutare topi nella formazione iniziale. Una volta che i topi sono addestrati con le luci, dovrebbero formazione Under-go senza luci per confermare che hanno imparato l'attività con gli odori.
   2. Impostare i parametri di output come durata di tempo della prova, numero di prove ha avviato, numero di prove completate, % corretto e numero totale di premi ricevuti.
3. Impostare le istruzioni di programmazione 4A tappa pseudotraining la stessa formazione Stadio 4S tranne s + e S-odori vengono presentati in modo casuale dall'inizio. Dare acqua punizioni ricompensa o timeout in modo casuale, indipendentemente dalle prestazioni di attività.
4. Configurazione casella e impostazioni del mouse
   1. Impostare la configurazione della casella la stessa fase precedente 3.
   2. È possibile collegare sia s + e S-odore al controller di consegna di odore. Posto un mouse nella camera. Chiudere la camera del mouse e iniziare il programma di 4A tappa. Dopo le prove di 40 completa di topi, passare al programma di consegnare in modo casuale gli odori. Rimuovere il mouse una volta completata questa fase.
5. Considerare questa fase come completa quando ci sono 40 prove con > 60% di risposte corrette.

8. fase 4B: associando i zona pericolosa (S-) odore e la punizione di Time Out, 5 – 11 giorni

1. Istruzioni di programmazione di formazione fase 4B
   1. Rendere questa fase identica alla 4A tappa, tuttavia la punizione di time out per tentare una ricompensa di acqua dopo un S-odore è 4 s.
2. Impostare la ricompensa di acqua pseudotraining fase 4B programmazione istruzioni identiche alla 4A tappa, tuttavia e punizione di tempo fuori in modo casuale vengono consegnati al trial.
3. Configurazione casella e impostazioni del mouse
   1. Impostare la configurazione della casella lo stesso come precedente fase 4A.
   2. È possibile collegare sia s + e S-odore al controller di consegna di odore. Posto un mouse nella camera. Chiudere la camera del mouse e iniziare il programma di Stage 4B. Considerare questa fase completa quando ci sono > 100 prove entro 60 min con precisione > 85% (Figura 2E)
4. Monitorare la percentuale di massima e minima corretta per ogni sessione di seguire i progressi di ogni mouse in questa fase. Circa 85-90% dei topi di raggiungere criteri di completamento per questa fase. Escludere i topi che non realizzare il completamento di questa fase per la fase test passa/non passa.
5. (Opzionale) Alla fine di questa fase, applicare una formazione di inversione, dove gli odoranti di passa/non passa sono accesi la piattaforma del flaconcino di odore. Garantire che i topi non associa a un altro stimolo, ad esempio il suono delle valvole associate con le porte laterali.

9. Go/No-Go analisi attività: 1 giorno, 20 Min per topo al giorno

1. Considerare questo come la fase finale per determinare la precisione di identificando le associazioni odore ed imparando a discriminare coppie di odore.
   Nota: Il romanzo odoranti sono utilizzate per S + S-per testare gli animali quanto tempo prendere per imparare nuove associazioni. Coppie odorant strutturalmente simili vengono utilizzate per aumentare la difficoltà del compito. Gli esempi includono 1-butanolo vs 1-pentanolo, acetato di isoamile vs Isoamyl butirrato, e + Carvone vs - Carvone.
2. Istruzioni per la programmazione
   1. Lasciare che il software di formazione rilevare la lunghezza di poke di naso. Programmare un poke di naso di 300 ms nel porto centro odore per eseguire l'attività.
   2. Impostare i parametri di output identica alla fase 4B, tranne non utilizzare qualsiasi luce guidata spunti.
3. Configurazione casella e impostazioni del mouse
   1. Impostare la configurazione della casella lo stesso come precedente fase 4B.
   2. È possibile collegare sia s + e S-odore al controller di consegna di odore. Posto un mouse nella camera. Chiudere la camera del mouse e iniziare il programma di Stage passa/non passa. Esporre i topi che hanno imparato il compito di apprendimento olfattivo di romanzo coppie di odori chimicamente simili.
      Nota: Topi selvatici con discriminazione odore adeguata raggiungono > 85% di precisione con romanzo odoranti dopo circa 10-20 isolati o prove di 200-400 (Figura 3A).

Risultati

Una volta che i topi hanno imparato l'attività di apprendimento olfattivo, ora possono associare coppie romanzo odore con ricompensa e la punizione. Questi topi addestrati iniziano normalmente con circa il 50% precisione il compito di passa/non passa. La percentuale corretta possa essere tracciata dal blocco di prova come una curva di apprendimento per coppie romanzo odore (Figura 3A). All'interno di 10 prove di blocco, che prendono la maggi...

Discussione

Il sistema olfattivo roditore fornisce un modello unico per studiare la plasticità dipendente sensoriale. Qui presentiamo un paradigma di apprendimento olfattivo per addestrare i topi per associare odorant coppie con una ricompensa o punizione. Attraverso questa attività di apprendimento, cambiamenti di circuito a valle possono essere studiate in esperimenti successivi (elettrofisiologia, in vivo imaging neuronale, ecc.). A completamento, topi imparerà a eseguire un'operazione di semplice odore accia...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass vial	Qorpak	GLC-01016
Silicon Tubing	Thermo Scientific	86000030
18 gauge needles	BD	305196
1-Butanol	Sigma Aldrich	437603
Propionic Acid	Sigma Aldrich	402907
Mouse Chamber	Med Associates	ENV-307W
Chamber Floor	Med Associates	ENV-307W-GFW
Water Port	Med Associates	ENV-313W	Need two
Odor stimulus	Med Associates	ENV-275	Contain 2 valves to gate odor delivery
Odor Port	Med Associates	ENV-375W-NPP
USB Interface	Med Associates	DIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meter	VWR	97004-952
Behavioral software	Med Associates	SOF-735	This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer software	Med Associates	SOF-731	This software formats the data to Excel
Training Software	Med Associates	DIG-703A-USB	This software is used to program each training stage
Water Valve	Neptune Research	225P012-11	This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor Valve	Neptune Research	360P012-42	This valve is used to gate the odor delivery. Need Two