Endomicroscopía preclínica de barrido láser confocal acoplada a fibras (pCLE) in vivo de capilares del hipocampo en ratones despiertos

Resumen

Mientras que las imágenes multifotónicas solo son efectivas a profundidades limitadas de la superficie del tejido, es posible lograr imágenes con una resolución de 3 μm a cualquier profundidad a través de pCLE. Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de pCLE para medir la dinámica microvascular en el hipocampo de ratones ictales y salvajes.

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir la endomicroscopía preclínica de barrido láser confocal acoplada a haces de fibra óptica (pCLE) en su aplicación específica para dilucidar los efectos del flujo sanguíneo capilar durante las convulsiones, impulsados por las células murales. Las imágenes corticales in vitro e in vivo han demostrado que las constricciones capilares impulsadas por los pericitos pueden ser el resultado de la actividad neuronal local funcional, así como de la aplicación de fármacos, en animales sanos. Aquí, se presenta un protocolo sobre cómo usar pCLE para determinar el papel de la dinámica microvascular en la degeneración neural en la epilepsia, a cualquier profundidad de tejido (específicamente en el hipocampo). Describimos una técnica de reposacabezas que ha sido adaptada para registrar la LECp en animales despiertos, para abordar los posibles efectos secundarios de los anestésicos sobre la actividad neuronal. Con estos métodos, se pueden realizar registros electrofisiológicos y de imágenes durante varias horas en estructuras neuronales profundas del cerebro.

Introducción

A diferencia de otros métodos de imagen microscópica 1,2,3,4,5,6,7,8, la microscopía confocal in vivo basada en fibra óptica permite medir la dinámica del flujo sanguíneo en cualquier región del cerebro, a cualquier profundidad^, a alta velocidad (hasta 240 Hz dependiendo del tamaño del campo de visión⁹). Una sonda de fibra óptica permite la obtención de imágenes de escaneo láser confocal in vivo con una resolución de 3 μm porque la punta de la sonda (un objetivo sin lente compuesto por un haz de 5000-6000 fibras individuales de 3 μm de diámetro) se puede colocar con la precisión de un microelectrodo, dentro de los 15 μm del objetivo fluorescente de interés. Al igual que en la obtención de imágenes in vivo de dos fotones, los fluoróforos deben introducirse previamente en el objetivo de la imagen. Por ejemplo, la fluoresceína dextrano (o puntos cuánticos) se puede inyectar en la vasculatura, o las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente se pueden transfectar en las células, o los tintes fluorescentes como Oregon Green BAPTA-1 se pueden cargar a granel en las células, antes de la obtención de imágenes.

Investigaciones recientes que utilizan estas técnicas han encontrado que la actividad motora de las células murales que conduce a vasoespasmos capilares ictales (constricciones repentinas que ocurren en la posición de las células murales^{durante las} convulsiones) puede contribuir a la neurodegeneración en el hipocampo ictal⁹. Mientras que estudios de imagen previos mostraron constricciones pericitarias in vitro e in vivo relacionadas con aplicaciones de fármacos 6,7,10,11,12^, Leal-Campanario et al. encontraron la primera evidencia de constricciones capilares espontáneas in vivo en el cerebro murino. Para establecer su relevancia para la epilepsia del lóbulo temporal humano, estudiaron ratones machos (P30-40 viejos) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null)^14,15 (JAX stock #003532), un modelo genético de ataxia episódica humana tipo 1 ¹⁵. Los pericitos provocaron vasoconstricciones murales del hipocampo^{patológicas y} fisiológicas 9 en los animales epilépticos espontáneos y sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT). Estas observaciones se replicaron en animales WT que se volvieron epilépticos con ácido kaínico, lo que indica su generalización a otras formas de epilepsia. Además, Leal-Campanario et al determinaron, utilizando nuevos enfoques de microscopía estereológica, que las neuronas apoptóticas, pero no sanas, en animales epilépticos estaban acopladas espacialmente a la microvasculatura del hipocampo. Debido a que la excitotoxicidad no tiene una asociación espacial conocida con la vasculatura, este resultado indicó que la hipoxia anormal inducida por isquemia vasoespasmica capilar contribuye a la neurodegeneración en la epilepsia. La Figura 1 muestra un esquema de la configuración general.

Protocolo

El protocolo sigue las Directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Neurológico Barrow.

1. Posicionamiento estereotáxico para craneotomía

1. Pesar y luego anestesiar al ratón con un cóctel de ketamina y xilacina (100 mg/kg-10 mg/kg i.p.). Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado observando su falta de reacción al pellizco de la cola y/o los dedos de los pies.
2. Coloque una almohadilla térmica debajo del mouse y use un termómetro rectal para monitorear continuamente su temperatura corporal durante la cirugía inicial de implantación anestesiada (Figura 2A).
3. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad ocular.
4. Estabilizar la cabeza del animal en un marco estereotáxico para roedores, equipado con un adaptador de ratón. Para orientar correctamente el ratón en el marco estereotáxico, coloque los dientes del animal dentro del orificio de la barra de mordida (Figura 2A y Figura 3A, ítem g). Apriete la pinza nasal hasta que quede ajustada (Figura 2A, B y Figura 3A, punto h). La posición del cuerpo del mouse debe ser lo más recta posible (como en la Figura 2A).
   1. Asegure aún más la cabeza del animal con barras para las orejas de ratón con manguitos de soporte de mandíbula (Figura 2A y Figura 3A, punto i), para sujetar firmemente los procesos cigomáticos del cráneo.
      NOTA: Una vez asegurada, la cabeza del ratón no debe tener rango de movimiento horizontal.
5. Una vez que el ratón esté ajustado al marco estereotáxico (Figura 3B, ítem j), limpie y esterilice el cuero cabelludo limpiándolo con un exfoliante de cloro-hexedina 2-3 veces, cada vez seguido de un enjuague con alcohol. Luego, aplique lidocaína tópica en la parte superior de la cabeza.
6. Haga una incisión a lo largo de la línea media de posterior a anterior (comience la incisión en la base del cráneo y complétela entre los ojos; 12-15 mm) a lo largo de la línea media sagital del cráneo, utilizando unas tijeras finas o una cuchilla. Retraiga los bordes del cuero cabelludo con cuatro pinzas serrefine bulldog de 28 mm para exponer el cráneo y maximizar el área de trabajo (Figura 2B y Figura 3C).
7. Use un bisturí o una microespátula (Figura 3C) para raspar el periostio hasta los bordes de la incisión. Use una tijera o fórceps para separar los tejidos (Figura 3C) para retraer cuidadosamente los músculos de la parte posterior del cuello (Figura 2B).
8. Seque la parte superior del cráneo con un aplicador con punta de algodón, humedecido con alcohol o peróxido de hidrógeno al 30%, para optimizar la visualización de las suturas craneales. Aplique solución salina en el cráneo una vez que se haya extirpado el tejido conectivo.
9. Una vez que la cabeza del ratón esté estabilizada en el aparato estereotáxico, coloque la punta de la aguja de una jeringa (21 G) en el portaelectrodos (Figura 3B, ítem l) y fije el portaelectrodos al micromanipulador estereotáxico, bajando la punta de la aguja hasta el nivel del cráneo (Figura 2D).
10. Ajuste la dirección medial-lateral del cráneo midiendo la altura del cráneo a cualquier distancia posterior al bregma (es decir, -2,0 mm) y a dos distancias iguales laterales desde la línea media a cada lado del cráneo (es decir, ± 1,5 mm) (Figura 2D). Apunte a una diferencia de altura entre ubicaciones que sea inferior a 0,05 mm en la dirección dorsal-ventral.
    1. Si es superior a 0,05 mm, gire el cráneo del ratón con la barra de mordida, o vuelva a colocar la cabeza del ratón aflojando las barras de las orejas con cuidado, desplazando lateralmente la cabeza y las barras de las orejas según sea necesario, y luego volviendo a apretar las barras de las orejas.
11. Una vez que el cráneo se posiciona en el dispositivo estereotáxico, determine y registre las coordenadas estereotácticas de las suturas de cráneo bregma y lambda a lo largo de los ejes anteroposterior (AP), lateral medial (ML) y ventral dorsal (DV).
12. Identificar el punto diana (hipocampo derecho) con la ayuda de un atlas estereotáxico. A continuación, encuentra en el cráneo las coordenadas del punto objetivo en relación con el bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (Figura 2E).
13. Con un marcador quirúrgico, marque cuatro esquinas de una ventana de imágenes de 1,4 mm x 2 mm en el cráneo con puntos, centrados alrededor del punto objetivo directamente sobre el hipocampo (Figura 2F), para la craneotomía posterior.
14. Utilice el marcador quirúrgico para dibujar dos puntos adicionales: uno sobre el hueso parietal superior izquierdo (Figura 2G) y otro sobre el hueso frontal derecho (Figura 2H), para indicar la futura colocación de dos tornillos óseos (Figura 3A, punto b) que anclarán la cabeza (Figura 3B, punto m) al cráneo.
15. Utilice el marcador quirúrgico para dibujar tres puntos más que indiquen dónde se insertarán los electrodos de registro del EEG epidural: un punto colocado a 1 mm a cada lado de la línea media y un punto adicional en la línea media situado a 1 mm detrás de Lambda (Figura 2E, Figura 4A y Figura 5B).

2. Instalación de la tapa de la cabeza

1. Con una fresa de 0,7 mm de diámetro (Figura 3C), taladre con cuidado dos pequeños agujeros en el cráneo, en las posiciones de los puntos que indican la colocación de los tornillos óseos (consulte el paso 1.15 anterior). A continuación, se toman dos tornillos óseos (ranurados de acero inoxidable, longitud: 4 mm; diámetro: 0,85 mm) previamente desinfectados con etanol al 70-80%, y se atornillan al cráneo para una mayor estabilidad de la cabeza (Figura 2I-J y Figura 3A, ítem b).
   1. Asegúrese de que las puntas de los tornillos no sobresalgan más allá de la parte inferior del hueso hacia la cavidad del cráneo, con el riesgo de dañar el cerebro. Obsérvese que uno de los dos tornillos óseos será anterior a los dos tornillos de cabeza y el otro posterior a ellos (Figura 2G-J).
2. Rocía solución salina sobre el cráneo para enfriarlo y limpiarlo. A continuación, seca el cráneo por completo y aplica una fina capa de cianoacrilato alrededor de los tornillos.
3. Utilice una pieza de alineación personalizada (Figura 3A, punto c) sujeta al microaccionamiento montado en el dispositivo estereotáxico (Figura 2F-J y Figura 3A, elemento d), de modo que la posición de la cabeza esté alineada a lo largo de la línea media, con la cresta anterior superpuesta a la brema suprayacente. Esta pieza personalizada de acero inoxidable tiene forma de L (en ángulo de 90°), con dos orificios separados por 4 mm (Figura 2F-J y Figura 3A, elemento c).
   1. Utilice el manipulador estereotáxico para colocar la pieza de alineación en forma de L, con dos tornillos de accionamiento ranurados de cabeza de relleno unidos (M1,6 x 0,35 métrico grueso, 12 mm de longitud; Figura 3A, punto a) sobre el bregma, hasta que la base de los tornillos quede plana sobre el cráneo, teniendo cuidado de no ejercer presión sobre el cráneo (Figura 2I-J).
4. Aplique cianoacrilato seguido de cemento dental para unir la base de los tornillos al cráneo. Tenga cuidado de no obstruir las marcas de referencia de la ventana de imágenes sobre el hipocampo (Figura 2K).

3. Cirugía de craneotomía de ventana por imágenes

1. En cada una de las posiciones de las marcas de referencia de craneotomía que indican las esquinas de la ventana de imagen (véase el paso 1.14 anterior), taladre un orificio de rebaba de 0,7 mm de diámetro, seguido de delinear suavemente la periferia de la ventana de craneotomía de 1,4 mm x 2 mm con la fresa, con cortes iterativamente más profundos (Figura 2L).
2. Tenga cuidado de no perforar demasiado profundo o con demasiada fuerza sobre el cráneo, que es delgado y frágil, con un grosor de aproximadamente 300 μm. Una vez que el colgajo óseo esté completo, haga palanca en el colgajo suelto con la punta de un bisturí, teniendo cuidado de no dañar la duramadre subyacente.
3. Cubra la ventana abierta con cera para huesos (Figura 2M).
4. Con una fresa de 0,9 mm de diámetro, taladre tres orificios para la colocación futura de los electrodos de EEG epidurales (consulte el paso 1.15 anterior) teniendo cuidado de no cortar la duramadre (Figura 2E, L).
5. Cubre los tres agujeros con cera para huesos.
6. Aplique suavemente cianoacrilato alrededor de los bordes de la ventana de imágenes cubierta de cera ósea y los orificios del EEG, teniendo cuidado de no sellar las craneotomías (Figura 2L).
7. Construya una pared de cemento dental que abarque la ventana de imágenes y los orificios del EEG y la una a la tapa de la cabeza previamente cementada (Figura 2M y Figura 3B, ítem m).
8. Deja que el cemento se seque durante al menos 10 minutos.
9. Cierre los márgenes sueltos de la herida con suturas simples interrumpidas, utilizando seda trenzada negra 4-0 o 5-0 (Figura 2N y Figura 3C).

4. Postoperatorio

1. Use un aplicador con punta de algodón para aplicar el ungüento de lidocaína alrededor de la piel expuesta para amortiguar la sensación alrededor del borde de la herida.
2. Use un aplicador estéril con punta de algodón para aplicar Neosporin sobre la piel expuesta.
3. Retire al animal del marco estereotáxico (Figura 2N).
4. Inyectar ketoprofeno (5 mg/kg) IP o IM para analgesia postquirúrgica.
5. Observe al animal hasta que esté alerta y en movimiento (esto generalmente ocurrirá en cuestión de minutos).
6. Coloque al animal en una jaula caliente y continúe monitoreando su recuperación hasta que beba o coma y esté listo para ser transferido al alojamiento de los animales.
7. Revise al animal al menos una vez al día durante aproximadamente una semana después de la cirugía, observando cualquier signo de comportamiento apático y/o comida/bebida inadecuada (Figura 2O).

5. Inyección de tinte y registro de EEG

1. Espere un mínimo de un día después de la cirugía de implantación de la cabeza para iniciar las grabaciones.
2. Coloque el ratón en un dispositivo de restricción de espuma moldeado a su cuerpo, dentro del marco estereotáxico (Figura 3B, ítems n y j).
3. Asegure la tapa de la cabeza (Figura 3 B-I, elemento m) a una barra de montaje personalizada que está unida al marco estereotáxico (Figura 3A, B, elementos e y j, y Figura 4A). La sección larga del ítem e (Figura 3A,B) debe tener una longitud entre 9,4 y 13 mm. Fije el elemento f (una placa de montaje con dimensiones de 1,5 cm x 0,5 cm, con dos orificios separados 4 mm de centro a centro) en el elemento e (Figura 3A, B, elementos e, f y k). Este sistema de alineación colocará el ratón despierto de forma segura en el marco estereotáxico durante las sesiones de imágenes (Figura 4).
4. Inserte los electrodos de registro de EEG epidural (Figura 5A), colocando los electrodos de tierra (cables blancos) dentro del orificio central posterior y los electrodos de registro (cables rojos) en los orificios anterior izquierdo y derecho (Figura 2E, Figura 4E y Figura 5E). Coloque cada uno de los cables en forma de L entre el cráneo y la duramadre (Figura 5C) para optimizar el contacto eléctrico.
5. Inyecte la vena de la cola con dextrano fijable con lisina fluoresceína verde (0,2 ml/25 g de peso corporal de fluoresceína al 5% p/p), para visualizar el flujo sanguíneo dentro del hipocampo.
   1. Para mejorar la dilatación de la vena central de la cola del ratón antes de la inyección, utilice una o más de las siguientes estrategias: a) Aplique etanol al 70% en la vena central con un aplicador con punta de algodón; b) Sumerja la cola en agua tibia (35-40 °C) durante 1-3 minutos; c) Exponga la cola a una lámpara de calefacción durante unos minutos.
   2. Asegure la cola del ratón con dos dedos y ubique la vena central, que se encuentra inmediatamente debajo de la piel. Inserte la aguja (jeringa de insulina ultrafina con aguja integrada 30G), con el bisel hacia arriba, en la vena, aproximadamente a mitad de camino o dos tercios de la base de la cola. Mantenga la aguja paralela a la cola durante la inyección.
   3. Inyecte el tinte lenta y constantemente, teniendo cuidado de evitar cualquier cambio en la posición de la aguja o la cola.
      NOTA: No debe haber resistencia al presionar el émbolo de la jeringa.
   4. Después de completar la inyección, retire la aguja y aplique una presión suave en el sitio de punción para sellar el vaso.
   5. Permita que se produzca la coagulación.

6. Endomicroscopía preclínica de barrido láser confocal acoplada a haz de fibra óptica (pCLE) in vivo

1. Inmediatamente después de la inyección de la vena de cola (paso 5.5.3 anterior), sujete el haz de fibra óptica biselado de 300 μm (que contiene 5000-7000 fibras de 3 μm en cada haz) en la orientación hacia abajo del brazo móvil del accionamiento estereotáxico robótico.
2. Retire la cera ósea de la craneotomía.
3. Retire la duramadre con la punta doblada de la aguja de una jeringa.
4. Usando el sistema de posicionamiento robótico, primero mueva el objetivo de la fibra a la ubicación estereotáxica antero-posterior e izquierda-derecha apropiada, con la punta puesta a cero en el eje z en la superficie de la corteza.
5. Inicie el registro del EEG (Figura 5D).
6. Inicie el escaneo láser confocal del plano posterior del objetivo de fibra, seguido directamente por el descenso del objetivo lentamente en el eje z utilizando los controles z del micromotor robótico, hasta que alcance la profundidad objetivo dentro del cerebro (Figura 4C). Vea los resultados de las imágenes en el software microscópico mientras desciende.
   1. Si la punta de la fibra se encuentra dentro de la región de grabación X-Y-Z de destino, y dos o más vasos entran en el campo de visión de la ventana de imagen, detenga el descenso e inicie las grabaciones de vídeo. Obtenga vídeos time-lapse de campo completo en directo del flujo sanguíneo a 11,7 Hz utilizando el software de imágenes de Cellvizio Lab. (Se pueden obtener velocidades más altas con un campo de visión más pequeño). Las grabaciones pueden tener lugar durante 4-5 horas seguidas, en días consecutivos si es necesario.
7. Utilizando una jeringa de 10 ml con un tubo de silicona biselado fijado a la punta de la aguja, alimente al animal durante los registros proporcionándole periódicamente pasta hecha con gránulos de ratón molidos con agua.
8. Al final de la sesión de imágenes, finalice las grabaciones.
9. Retire suavemente las derivaciones del EEG y límpielas con Tergazyme.
10. Retire lentamente el haz de fibra óptica del cerebro del animal invirtiendo la fibra a lo largo del eje z de entrada.
11. Suelte al animal del poste de la cabeza y de las sujeciones corporales.
12. Si corresponde, siga los protocolos de eutanasia y procesamiento de tejidos necesarios para visualizar los vasos sanguíneos y realizar inmunohistoquímica.
13. Si planea grabar del mismo animal en una sesión futura, cubra la ventana de imágenes con cera de hueso o silástica.

Resultados

Desarrollamos estos métodos para evaluar si los vasoespasmos capilares anormales impulsados por pericitos en el hipocampo, que ocurren como resultado de convulsiones, podrían causar hipoxia franca que contribuya a la muerte celular en el foco ictal ^9,13.

El desarrollo de la tapa de la cabeza y su instalación adecuada proporcionaron una alta estabilidad en los registros, lo que permitió el registro simultáneo del EEG y el flujo san...

Discusión

Desarrollamos un sistema de sujeción de la cabeza para experimentos electrofisiológicos simultáneos y de fibra óptica con pCLE en ratones despiertos, reduciendo la contaminación potencial de la respuesta debido a los fármacos anestésicos. La tapa de la cabeza y el aparato de montaje son fáciles de construir y son reutilizables para experimentos de imágenes de comportamiento despierto crónico. Comprobamos la calidad de los registros con el estándar de oro para la obtención de imágenes microscópicas de flujo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121