Endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pCLE) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées

Résumé

Alors que l’imagerie multiphotonique n’est efficace qu’à des profondeurs limitées de la surface du tissu, il est possible d’obtenir une imagerie d’une résolution de 3 μm à n’importe quelle profondeur via pCLE. Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser une imagerie pCLE pour mesurer la dynamique microvasculaire dans l’hippocampe de souris ictales et de souris de type sauvage.

Résumé

L’objectif de ce protocole est de décrire l’endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des faisceaux de fibres optiques (pCLE) dans son application spécifique pour élucider les effets du flux sanguin capillaire pendant les crises, entraînés par les cellules murales. L’imagerie corticale in vitro et in vivo a montré que les constrictions capillaires induites par les péricytes peuvent résulter d’une activité neuronale locale fonctionnelle, ainsi que de l’application de médicaments, chez des animaux sains. Ici, un protocole est présenté sur la façon d’utiliser la pCLE pour déterminer le rôle de la dynamique microvasculaire dans la dégénérescence neurale dans l’épilepsie, à n’importe quelle profondeur tissulaire (en particulier dans l’hippocampe). Nous décrivons une technique d’appuie-tête qui a été adaptée pour enregistrer la pCLE chez les animaux éveillés, afin de traiter les effets secondaires potentiels des anesthésiques sur l’activité neuronale. Grâce à ces méthodes, des enregistrements électrophysiologiques et d’imagerie peuvent être effectués pendant plusieurs heures dans les structures neuronales profondes du cerveau.

Introduction

Contrairement à d’autres méthodes d’imagerie microscopique 1,2,3,4,5,6,7,8, la microscopie confocale in vivo à base de fibres optiques permet de mesurer la dynamique du flux sanguin dans n’importe quelle région du cerveau, à n’importe quelle profondeur^, à grande vitesse (jusqu’à 240 Hz selon la taille du champ de vision⁹). Une sonde à fibre optique permet l’imagerie confocale à balayage laser in vivo à une résolution de 3 μm, car la pointe de la sonde (un objectif sans lentille composé d’un faisceau de 5000 à 6000 fibres individuelles de 3 μm de diamètre) peut être positionnée avec la précision d’une microélectrode, à moins de 15 μm de la cible fluorescente d’intérêt. Comme pour l’imagerie in vivo à deux photons, les fluorophores doivent être préalablement introduits dans la cible d’imagerie. Par exemple, du dextran de fluorescéine (ou des points quantiques) peut être injecté dans le système vasculaire, ou des protéines fluorescentes génétiquement codées peuvent être transfectées dans les cellules, ou des colorants fluorescents tels que le vert d’Oregon BAPTA-1 peuvent être chargés en vrac dans les cellules, avant l’imagerie.

Des recherches récentes utilisant ces techniques ont montré que l’activité motrice des cellules murales conduisant à des vasospasmes capillaires ictaux – des constrictions soudaines qui se produisent à la position des cellules murales pendant les crises 9 – peut contribuer à la neurodégénérescence de l’hippocampe ictal⁹. Alors que des études d’imagerie antérieures ont montré des constrictions péricytaires in vitro et in vivo liées à des applications médicamenteuses 6,7,10,11,12^, Leal-Campanario et al. ont trouvé la première preuve de constrictions capillaires spontanées in vivo dans le cerveau murin. Pour établir la pertinence de l’épilepsie du lobe temporal humain, ils ont étudié des souris mâles (P30-40 old) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) ^14,15 (JAX stock #003532), un modèle génétique de l’ataxie épisodique humaine de type 1¹⁵. Les péricytes ont entraîné des vasoconstrictions murales de l’hippocampe pathologiques et physiologiques⁹ chez les animaux spontanément épileptiques et leurs compagnons de portée de type sauvage (WT). Ces observations ont été reproduites chez des animaux WT rendus épileptiques avec de l’acide kaïnique, indiquant ainsi leur généralisation à d’autres formes d’épilepsie. Leal-Campanario et al. ont en outre déterminé, à l’aide de nouvelles approches de microscopie stéréologique, que les neurones apoptotiques – mais pas sains – chez les animaux épileptiques étaient spatialement couplés à la microvascularisation de l’hippocampe. Étant donné que l’excitotoxicité n’a pas d’association spatiale connue avec le système vasculaire, ce résultat indique que l’hypoxie anormale induite par l’ischémie vasospasmique capillaire anormale contribue à la neurodégénérescence dans l’épilepsie. La figure 1 montre un schéma de la configuration générale.

Protocole

Le protocole suit les directives des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut neurologique Barrow.

1. Positionnement stéréotaxique pour la craniotomie

1. Peser puis anesthésier la souris avec un cocktail de kétamine-xylazine (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.). Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié en observant son absence de réaction au pincement de la queue et/ou des orteils.
2. Placez un coussin chauffant sous la souris et utilisez un thermomètre rectal pour surveiller en permanence sa température corporelle pendant la chirurgie d’implantation anesthésiée initiale (Figure 2A).
3. Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse oculaire.
4. Stabilisez la tête de l’animal dans un cadre stéréotaxique pour rongeurs, équipé d’un adaptateur de souris. Pour orienter correctement la souris dans le cadre stéréotaxique, placez les dents de l’animal à l’intérieur du trou de la barre de morsure (Figure 2A et Figure 3A, élément g). Serrez le serre-nez jusqu’à ce qu’il soit bien ajusté (Figure 2A, B et Figure 3A, point h). Le positionnement du corps de la souris doit être aussi droit que possible (comme dans la figure 2A).
   1. Fixez davantage la tête de l’animal à l’aide de barres auriculaires de souris munies de brassards de maintien de la mâchoire (figure 2A et figure 3A, point i), afin de serrer fermement les apophyses zygomatiques du crâne.
      REMARQUE : Une fois fixée, la tête de la souris ne doit pas avoir d’amplitude de mouvement horizontal.
5. Une fois que la souris est ajustée au cadre stéréotaxique (Figure 3B, point j), nettoyez et stérilisez le cuir chevelu en l’essuyant avec un gommage au chlore-hexédine 2 à 3 fois, suivi à chaque fois d’un rinçage à l’alcool. Ensuite, appliquez de la lidocaïne topique sur le dessus de la tête.
6. Faites une incision le long de la ligne médiane de l’arrière vers l’avant (commencez l’incision à la base du crâne et complétez-la entre les yeux ; 12-15 mm) le long de la ligne médiane sagittale du crâne, à l’aide de ciseaux fins ou d’une lame. Rétractez les bords du cuir chevelu à l’aide de quatre pinces serrefine bouledogue de 28 mm pour exposer le crâne et maximiser la zone de travail (Figure 2B et Figure 3C).
7. À l’aide d’un scalpel ou d’une microspatule (figure 3C), grattez le périoste jusqu’aux bords de l’incision. Utilisez des ciseaux ou une pince pour séparer les tissus (figure 3C) pour rétracter soigneusement les muscles à l’arrière du cou (figure 2B).
8. Séchez le sommet du crâne à l’aide d’un applicateur à embout en coton, humidifié avec de l’alcool ou du peroxyde d’hydrogène à 30 %, afin d’optimiser la visualisation des sutures crâniennes. Appliquez une solution saline sur le crâne une fois que le tissu conjonctif a été retiré.
9. Une fois que la tête de la souris est stabilisée dans l’appareil stéréotaxique, placez une pointe d’aiguille de seringue (21 G) dans le porte-électrode (Figure 3B, article l) et fixez le porte-électrode au micromanipulateur stéréotaxique, en abaissant la pointe de l’aiguille au niveau du crâne (Figure 2D).
10. Ajustez la direction médiale-latérale du crâne en mesurant la hauteur du crâne à n’importe quelle distance postérieure au bregma (c.-à-d. -2,0 mm) et à deux distances égales latérales de la ligne médiane de chaque côté du crâne (c.-à-d. ± 1,5 mm) (Figure 2D). Visez une différence de hauteur entre les emplacements inférieure à 0,05 mm dans la direction dorsale-ventrale.
    1. S’il est supérieur à 0,05 mm, faites pivoter le crâne de la souris à l’aide de la barre de morsure, ou repositionnez la tête de la souris en desserrant soigneusement les barres auriculaires, en déplaçant latéralement la tête et les barres auriculaires au besoin, puis en resserrant les barres auriculaires.
11. Une fois que le crâne est positionné dans le dispositif stéréotaxique, déterminez et enregistrez les coordonnées stéréotaxiques des sutures crâniennes bregma et lambda le long des axes antéropostérieur (AP), latéral médial (ML) et dorsal ventral (DV).
12. Identifiez le point cible (hippocampe droit) à l’aide d’un atlas stéréotaxique. Ensuite, trouvez sur le crâne les coordonnées du point cible par rapport au bregma (AP : -2,7 mm, ML : -2,7 mm) (Figure 2E).
13. À l’aide d’un marqueur chirurgical, marquez les quatre coins d’une fenêtre d’imagerie de 1,4 mm x 2 mm sur le crâne avec des points, centrés autour du point cible directement au-dessus de l’hippocampe (Figure 2F), pour une craniotomie ultérieure.
14. À l’aide du marqueur chirurgical, tracez deux points supplémentaires : l’un sur l’os pariétal supérieur gauche (figure 2G) et l’autre sur l’os frontal droit (figure 2H), pour indiquer l’emplacement futur de deux vis à os (figure 3A, élément b) qui ancreront la tête (figure 3B, élément m) au crâne.
15. À l’aide du marqueur chirurgical, tracez trois autres points indiquant l’endroit où les électrodes d’enregistrement de l’EEG péridural seront insérées : un point positionné à 1 mm de chaque côté de la ligne médiane et un point supplémentaire sur la ligne médiane positionné à 1 mm derrière Lambda (Figure 2E, Figure 4A et Figure 5B).

2. Installation du capuchon de tête

1. À l’aide d’une fraise de 0,7 mm de diamètre (figure 3C), percez soigneusement deux petits trous dans le crâne, à la position des points indiquant l’emplacement des vis à os (voir l’étape 1.15 ci-dessus). Ensuite, prenez deux vis en os (fendues en acier inoxydable, longueur : 4 mm ; diamètre : 0,85 mm) préalablement désinfectées à l’éthanol à 70-80 % et vissez-les sur le crâne pour une stabilité supplémentaire de la tête (Figure 2I-J et Figure 3A, point b).
   1. Assurez-vous que les pointes des vis ne dépassent pas du bas de l’os dans la cavité crânienne, ce qui risquerait d’endommager le cerveau. Notez que l’une des deux vis à os sera antérieure aux deux vis tête-capuchon et l’autre postérieure à celles-ci (Figure 2G-J).
2. Vaporisez du sérum physiologique sur le crâne pour le refroidir et le nettoyer. Ensuite, séchez complètement le crâne et appliquez une fine couche de cyanoacrylate autour des vis.
3. Utiliser une pièce d’alignement personnalisée (figure 3A, article c) fixée au microentraînement monté sur le dispositif stéréotaxique (figure 2F-J et figure 3A, élément d), de manière à ce que la position de l’embout de tête soit alignée le long de la ligne médiane, avec la crête antérieure recouvrant le bregma. Cette pièce en acier inoxydable sur mesure est en forme de L (inclinée à 90°), avec deux trous séparés de 4 mm (figure 2F-J et figure 3A, article c).
   1. Utilisez le manipulateur stéréotaxique pour positionner la pièce d’alignement en forme de L, avec deux vis d’entraînement à fente à tête cylindrique fixées (M1,6 x 0,35 métrique grossière, longueur de 12 mm ; Figure 3A, point a) au-dessus du bregma, jusqu’à ce que la base des vis repose à plat sur le crâne, en prenant soin de ne pas exercer de pression sur le crâne (Figure 2I-J).
4. Appliquez du cyanoacrylate suivi d’un ciment dentaire pour fixer la base des vis au crâne. Veillez à ne pas obstruer les repères de référence de la fenêtre d’imagerie au-dessus de l’hippocampe (Figure 2K).

3. Chirurgie de craniotomie de fenêtre d’imagerie

1. À chacune des positions des repères de craniotomie qui indiquent les coins de la fenêtre d’imagerie (voir l’étape 1.14 ci-dessus), percez un trou de bavure de 0,7 mm de diamètre, puis délimitez doucement la périphérie de la fenêtre de craniotomie de 1,4 mm x 2 mm avec la perceuse, avec des coupes itératives plus profondes (Figure 2L).
2. Veillez à ne pas percer trop profondément ou avec trop de force sur le crâne, qui est mince et fragile, ayant une épaisseur d’environ 300 μm. Une fois que le lambeau osseux est terminé, soulevez le lambeau lâche avec la pointe d’un scalpel, en veillant à ne pas endommager la dure-mère sous-jacente.
3. Recouvrez la fenêtre ouverte avec de la cire d’os (figure 2M).
4. À l’aide d’une fraise de 0,9 mm de diamètre, percez trois trous pour la mise en place future des électrodes EEG péridurales (voir l’étape 1.15 ci-dessus) en prenant soin de ne pas couper la dure-mère (Figure 2E,L).
5. Couvrez les trois trous avec de la cire d’os.
6. Appliquez délicatement du cyanoacrylate sur les bords de la fenêtre d’imagerie recouverte de cire d’os et des trous EEG, en prenant soin de ne pas sceller les craniotomies (Figure 2L).
7. Construisez un mur de ciment dentaire qui englobe la fenêtre d’imagerie et les trous EEG et le lie à l’embout de tête préalablement cimenté (Figure 2M et Figure 3B, élément m).
8. Laissez sécher le ciment pendant au moins 10 minutes.
9. Fermez les bords lâches de la plaie avec de simples sutures interrompues, en utilisant de la soie tressée noire 4-0 ou 5-0 (Figure 2N et Figure 3C).

4. Post-chirurgie

1. Utilisez un applicateur à embout de coton pour appliquer une pommade à la lidocaïne autour de la peau exposée afin d’atténuer la sensation autour du bord de la plaie.
2. Utilisez un applicateur stérile à embout de coton pour appliquer Neosporin sur la peau exposée.
3. Retirez l’animal du cadre stéréotaxique (Figure 2N).
4. Injecter du kétoprofène (5 mg/kg) IP ou IM pour l’analgésie post-chirurgicale.
5. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il soit alerte et en mouvement (cela se produit généralement en quelques minutes).
6. Placez l’animal dans une cage chaude et continuez à surveiller son rétablissement jusqu’à ce qu’il boive ou mange et qu’il soit prêt à être transféré dans un logement pour animaux.
7. Surveillez l’animal au moins une fois par jour pendant environ une semaine après l’opération, en surveillant tout signe de comportement apathique et/ou de nourriture/boisson inadéquate (Figure 2O).

5. Injection de colorant et enregistrement EEG

1. Attendez au moins un jour après la chirurgie d’implantation du capuchon de tête pour commencer les enregistrements.
2. Placez la souris dans un dispositif de retenue en mousse moulé à son corps, à l’intérieur du cadre stéréotaxique (figure 3B, éléments n et j).
3. Fixez le capuchon de tête (Figure 3 B-I, article m) à une barre de montage personnalisée qui est fixée au cadre stéréotaxique (Figure 3A, B, éléments e et j et Figure 4A). La section longue de l’article e (figure 3A,B) doit avoir une longueur comprise entre 9,4 et 13 mm. Fixez l’élément f (une plaque de montage de dimensions 1,5 cm x 0,5 cm, avec deux trous séparés de 4 mm d’un centre à l’autre) à l’élément e (Figure 3A, B, éléments e, f et k). Ce système d’alignement positionnera la souris éveillée en toute sécurité sur le cadre stéréotaxique tout au long des séances d’imagerie (Figure 4).
4. Insérez les électrodes d’enregistrement EEG péridurale (Figure 5A), en plaçant les électrodes de masse (fils blancs) dans le trou central postérieur et les électrodes d’enregistrement (fils rouges) dans les trous antérieurs gauche et droit (Figure 2E, Figure 4E et Figure 5E). Positionnez chacun des fils en forme de L entre le crâne et la dure-mère (figure 5C) pour optimiser le contact électrique.
5. Injecter dans la veine caudale du dextran fixable à la lysine à la fluorescéine verte (0,2 mL/25 g en poids corporel de fluorescéine à 5 % p/p), pour visualiser le flux sanguin dans l’hippocampe.
   1. Pour améliorer la dilatation de la veine centrale de la queue de la souris avant l’injection, utilisez une ou plusieurs des stratégies suivantes : a) Appliquer de l’éthanol à 70 % sur la veine centrale à l’aide d’un applicateur à embout en coton ; b) Trempez la queue dans de l’eau tiède (35-40 °C) pendant 1 à 3 minutes ; c) Exposez la queue à une lampe chauffante pendant quelques minutes.
   2. Fixez la queue de la souris avec deux doigts et localisez la veine centrale, qui se trouve immédiatement sous la peau. Insérez l’aiguille (seringue à insuline ultrafine avec aiguille intégrée 30G), avec le biseau vers le haut, dans la veine, à environ mi-chemin ou aux deux tiers de la base de la queue. Gardez l’aiguille parallèle à la queue pendant l’injection.
   3. Injectez le colorant lentement et régulièrement, en prenant soin d’éviter tout changement de position de l’aiguille ou de la queue.
      REMARQUE : Il ne doit y avoir aucune résistance lorsque vous appuyez sur le piston de la seringue.
   4. Une fois l’injection terminée, retirez l’aiguille et appliquez une légère pression sur le site de ponction pour sceller le vaisseau.
   5. Permettre à la coagulation de se produire.

6. Endomicroscopie confocale confocale à balayage laser (pCLE) confocale in vivo couplée à des faisceaux de fibres optiques

1. Directement après l’injection de la veine caudale (étape 5.5.3 ci-dessus), serrez le faisceau de fibres optiques biseautées de 300 μm (contenant 5000 à 7000 fibres de 3 μm dans chaque faisceau) dans l’orientation vers le bas du bras mobile du variateur stéréotaxique robotisé.
2. Retirez la cire osseuse de la craniotomie.
3. Retirez la dure-mère à l’aide de l’extrémité pliée d’une aiguille de seringue.
4. À l’aide du système de positionnement robotisé, déplacez d’abord l’objectif de la fibre à l’emplacement stéréotaxique antéro-postérieur et gauche-droite approprié, avec la pointe mise à zéro sur l’axe z à la surface du cortex.
5. Lancez l’enregistrement EEG (Figure 5D).
6. Lancez un balayage laser confocal du fond de l’objectif à fibre, suivi directement en descendant lentement l’objectif sur l’axe z à l’aide des commandes z du micromoteur robotique, jusqu’à ce qu’il atteigne la profondeur cible dans le cerveau (Figure 4C). Visualisez les résultats d’imagerie dans le logiciel microscopique pendant la descente.
   1. Si l’extrémité de la fibre se trouve dans la région d’enregistrement cible X-Y-Z et que deux vaisseaux ou plus pénètrent dans le champ de vision de la fenêtre d’imagerie, arrêtez la descente et lancez les enregistrements vidéo. Obtenez des vidéos en accéléré plein champ en direct du flux sanguin à 11,7 Hz à l’aide du logiciel d’imagerie de Cellvizio Lab. (Des vitesses plus élevées peuvent être obtenues avec un champ de vision plus petit). Les enregistrements peuvent avoir lieu pendant 4 à 5 heures d’affilée, en jours consécutifs si nécessaire.
7. À l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’un tube en silicone biseauté fixé à l’extrémité de l’aiguille, nourrir l’animal pendant les enregistrements en lui fournissant périodiquement de la pâte faite de pastilles de souris broyées avec de l’eau.
8. À la fin de la session d’imagerie, mettez fin aux enregistrements.
9. Retirez délicatement les sondes EEG et nettoyez-les avec Tergazyme.
10. Retirez lentement le faisceau de fibres optiques du cerveau de l’animal en inversant la fibre le long de l’axe z d’entrée.
11. Libérez l’animal du poteau de tête et des dispositifs de retenue.
12. S’il y a lieu, suivez les protocoles d’euthanasie et de traitement tissulaire nécessaires pour visualiser les vaisseaux sanguins et effectuer l’immunohistochimie.
13. Si vous prévoyez d’enregistrer à partir du même animal lors d’une session ultérieure, couvrez la fenêtre d’imagerie avec de la cire d’os ou du silastic.

Résultats

Nous avons développé ces méthodes pour évaluer si des vasospasmes capillaires anormaux induits par le péricyte dans l’hippocampe – survenant à la suite de convulsions – pourraient provoquer une hypoxie franche qui contribue à la mort cellulaire dans le foyer ictal ^9,13.

Le développement de la coiffe et son installation correcte ont permis une grande stabilité dans les enregistrements, permettant l’enregistrement simult...

Discussion

Nous avons mis au point un système de retenue de la tête pour des expériences simultanées de pCLE électrophysiologique et à fibre optique chez des souris éveillées, réduisant ainsi la contamination potentielle de la réponse due aux médicaments anesthésiques. Le capuchon de tête et l’appareil de montage sont simples à construire et sont réutilisables pour les expériences d’imagerie chronique au comportement éveillé. Nous avons vérifié la qualité des enregistrements par rapport à l’étalon-or de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121