깨어 있는 마우스의 해마 모세혈관의 In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE)

요약

다광자 이미징은 조직 표면의 제한된 깊이에서만 효과적이지만 pCLE를 통해 모든 깊이에서 3μm 해상도의 이미징을 달성할 수 있습니다. 여기에서는 ictal 및 야생형 마우스의 해마에서 미세혈관 역학을 측정하기 위해 pCLE 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

이 프로토콜의 목표는 벽화 세포에 의해 구동되는 발작 중 모세관 혈류 효과를 설명하기 위한 특정 응용 분야에서 광섬유 번들 결합 전임상 컨포칼 레이저 스캐닝 내현미경(pCLE)을 설명하는 것입니다. 시험관 내 및 생체 내 피질 영상은 pericyte에 의해 유발되는 모세혈관 수축이 건강한 동물의 기능적 국소 신경 활동뿐만 아니라 약물 적용으로 인해 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 여기에서는 pCLE를 사용하여 모든 조직 깊이(특히 해마)에서 간질의 신경 퇴행에서 미세혈관 역학의 역할을 결정하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 신경 활동에 대한 마취제의 잠재적인 부작용을 해결하기 위해 깨어 있는 동물의 pCLE를 기록하도록 조정된 머리 구속 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법을 사용하여 뇌의 심부 신경 구조에서 몇 시간에 걸쳐 전기 생리학 및 영상 기록을 수행할 수 있습니다.

서문

다른 현미경 이미징 방법(1,2,3,4,5,6,7,8)과 달리^, 생체 내 광섬유 기반 컨포칼 현미경은 모든 뇌 영역^, 모든 깊이에서 고속(시야 크기에 따라 최대 240Hz)으로 혈류 역학을 측정할 수 있습니다⁹). 광섬유 프로브는 프로브의 팁(5000-6000개의 3μm 직경의 개별 섬유 번들로 구성된 렌즈 없는 대물렌즈)이 관심 형광 대상의 15μm 이내에서 미세 전극의 정확도로 배치될 수 있기 때문에 3μm 해상도에서 생체 내 컨포칼 레이저 스캐닝 이미징을 가능하게 합니다. in vivo two-photon imaging과 마찬가지로, 형광단은 이미징 타겟에 미리 도입되어야 합니다. 예를 들어, 플루오레세인 덱스트란(또는 퀀텀닷)을 혈관 조직에 주입하거나, 유전적으로 인코딩된 형광 단백질을 세포에 transfection하거나, Oregon Green BAPTA-1과 같은 형광 염료를 이미징 전에 세포에 벌크 로딩할 수 있습니다.

이러한 기법을 이용한 최근 연구에서는 발작 중 벽화 세포의 위치에서 발생하는 갑작스러운 수축인 외측 모세혈관 경련(ictal capillary vasospasm)9을 유발하는 벽체 세포 운동 활동이 전골 해마(ictal hippocampus⁾9의 신경 퇴화에 기여할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 이전의 이미징 연구는 약물 적용과 관련된 in vitro 및 in vivo pericyte constrictings를 보여주었지만 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al.은 쥐 뇌에서 생체 내 자발적 모세혈관 수축의 첫 번째 증거를 발견했습니다. 인간 측두엽 간질과의 관련성을 확립하기 위해, 그들은 인간 일시적 운동 실조증 유형 1 15의 유전 모델인 수컷(P30-40세) 녹아웃(KO) Kv1.1(kcna1-null) 마우스^14,15(JAX stock #003532)를 연구했다. pericyte는 자발적 간질을 하는 동물과 야생형(WT) 새끼에서 병리학적 및 생리학적 해마 벽화 혈관 수축(vasopcontractions)⁹을 유도했다. 이러한 관찰은 카이닌산으로 간질에 걸린 WT 동물에서 복제되었으며, 따라서 다른 형태의 간질에 대한 일반화를 나타냅니다. Leal-Campanario 등은 또한 새로운 입체학적 현미경 접근 방식을 사용하여 간질 동물의 세포사멸(건강하지는 않음) 뉴런이 해마 미세혈관에 공간적으로 결합되어 있음을 확인했습니다. 흥분독성은 혈관구조와 공간적 연관성이 알려져 있지 않기 때문에, 이 결과는 비정상적인 모세혈관 혈관 경련성 허혈 유발 저산소증이 간질의 신경 퇴행에 기여한다는 것을 나타냈다. 그림 1은 일반 설정의 개략도를 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 NIH Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals를 따릅니다. 모든 절차는 Barrow Neurological Institute의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.

1. 개두술을 위한 입체 위치 지정

1. 무게를 잰 다음 케타민-자일라진(100mg/kg–10mg/kg i.p.) 칵테일로 마우스를 마취합니다. 꼬리 및/또는 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 관찰하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
2. 마우스 아래에 온열 패드를 놓고 직장 체온계를 사용하여 초기 마취 이식 수술 중에 체온을 지속적으로 모니터링합니다(그림 2A).
3. 안구 건조증을 예방하기 위해 안과 연고를 바르십시오.
4. 쥐 어댑터가 장착된 설치류 입체 프레임에 동물의 머리를 고정합니다. 입체 프레임에서 마우스의 방향을 올바르게 지정하려면 동물의 이빨을 바이트 바의 구멍 안에 놓습니다(그림 2A 및 그림 3A, 항목 g). 노즈 cl을 조입니다.amp 꼭 맞을 때까지 (그림 2A, B 및 그림 3A, 항목 h). 마우스의 몸체 위치는 가능한 한 직선이어야 합니다(그림 2A 참조).
   1. 턱 홀더 커프가 있는 마우스 이어바(그림 2A 및 그림 3A, 항목 i)를 사용하여 동물의 머리를 추가로 고정하여 두개골의 접합 돌기를 단단히 고정합니다.
      알림: 일단 고정되면 마우스 헤드는 수평 동작 범위가 없어야 합니다.
5. 마우스가 입체 프레임(그림 3B, 항목 j)에 맞게 조정되면 클로르헥세딘 스크럽으로 두피를 2-3회 닦고 매번 알코올 헹굼으로 두피를 세척하고 살균합니다. 그런 다음 국소 리도카인을 머리 위에 바른다.
6. 가는 가위나 칼날을 사용하여 두개골의 시상 정중선을 따라 후방에서 전방까지 정중선을 따라 절개합니다(두개골 기저부에서 절개를 시작하여 눈 사이 12-15mm). 4개의 28mm 불독 세레파인 클램프로 두피의 테두리를 집어넣어 두개골을 노출시키고 작업 영역을 최대화합니다(그림 2B 및 그림 3C).
7. 메스 또는 미세 주걱(그림 3C)을 사용하여 골막을 절개 가장자리까지 긁어냅니다. 조직 분리 가위 또는 집게(그림 3C)를 사용하여 목 뒤쪽의 근육을 조심스럽게 집어넣습니다(그림 2B).
8. 두개골 봉합사의 시각화를 최적화하기 위해 알코올 또는 30% 과산화수소를 적신 면 끝이 있는 어플리케이터로 두개골 상단을 건조시킵니다. 결합 조직이 제거되면 두개골에 식염수를 바릅니다.
9. 마우스의 머리가 입체 장치에 안정화되면 주사기 바늘 팁(21G)을 전극 홀더(그림 3B, 항목 l)에 놓고 전극 홀더를 입체 미세 조작기에 부착하여 바늘 끝을 두개골 높이까지 낮춥니다(그림 2D).
10. 브레그마 후방의 모든 거리(즉, -2.0mm)와 두개골 양쪽의 정중선에서 측면의 두 개의 동일한 거리(즉, ± 1.5mm)에서 두개골의 높이를 측정하여 두개골의 내측-측면 방향을 조정합니다(그림 2D). 등쪽-복부 방향으로 0.05mm 미만의 위치 간 높이 차이를 목표로 합니다.
    1. 0.05mm보다 큰 경우 바이트 바를 사용하여 마우스의 두개골을 회전하거나 이어바를 조심스럽게 풀고 필요에 따라 헤드와 이어바를 옆으로 이동한 다음 이어바를 다시 조여 마우스의 머리 위치를 변경합니다.
11. 두개골이 입위 장치에 배치되면 전후(AP), 내측(ML) 및 배쪽 복부(DV) 축을 따라 브레그마 및 람다 두개골 봉합사의 정위 좌표를 결정하고 기록합니다.
12. 입체 아틀라스(stereotaxic atlas)를 사용하여 목표 지점(오른쪽 해마)을 식별합니다. 그런 다음 두개골에서 브레그마(AP: -2.7mm, ML: -2.7mm)를 기준으로 표적 좌표를 찾습니다(그림 2E).
13. 수술용 마커를 사용하여 후속 개두술을 위해 해마 바로 위의 표적 지점(그림 2F)을 중심으로 두개골에 있는 1.4mm x 2mm 이미징 창의 네 모서리를 점으로 표시합니다.
14. 수술 마커를 사용하여 왼쪽 상단 두정골 위(그림 2G)와 오른쪽 전두골 위(그림 2H)에 두 개의 점을 추가로 그려 헤드 캡(그림 3B, 항목 m)을 두개골에 고정할 두 개의 뼈 나사(그림 3A, 항목 b)의 향후 배치를 나타냅니다.
15. 수술 마커를 사용하여 경막외 EEG 기록 전극이 삽입될 위치를 나타내는 점 3개를 더 그립니다: 정중선의 양쪽에 1mm 위치에 있는 점 1개와 Lambda 뒤 1mm 위치에 있는 정중선에 추가 점 1개(그림 2E, 그림 4A 및 그림 5B).

2. 헤드 캡 설치

1. 직경 0.7mm의 버(그림 3C)를 사용하여 뼈 나사 위치를 나타내는 점 위치에서 두개골에 두 개의 작은 구멍을 조심스럽게 뚫습니다(위의 1.15단계 참조). 그런 다음 이전에 에탄올 70-80%로 소독한 두 개의 뼈 나사(스테인리스 스틸 슬롯, 길이: 4mm, 직경: 0.85mm)를 두개골에 나사로 고정하여 헤드 캡 안정성을 높입니다(그림 2I-J 및 그림 3A, 항목 b).
   1. 나사 끝이 뼈 바닥을 넘어 두개강으로 돌출되어 뇌가 손상될 위험이 없는지 확인하십시오. 두 개의 뼈 나사 중 하나는 두 개의 헤드 캡 나사의 앞쪽에 있고 다른 하나는 뒤쪽에 있습니다(그림 2GJ).
2. 두개골 위에 식염수를 뿌려 식히고 청소하십시오. 그런 다음 두개골을 완전히 말리고 나사 주위에 시아노아크릴레이트를 얇게 바릅니다.
3. 입체 장치(그림 2F-J 및 그림 3A, 항목 d)에 장착된 마이크로 드라이브에 고정된 맞춤형 정렬 조각(그림 3A, 항목 c)을 사용하여 헤드 캡의 위치가 앞쪽 융기가 브레그마 위에 놓이도록 정중선을 따라 정렬되도록 합니다. 이 맞춤형 스테인리스 스틸 조각은 L자형(90° 각도)이며 두 개의 구멍이 4mm 떨어져 있습니다(그림 2F-J 및 그림 3A, 항목 c).
   1. 입체 조작기를 사용하여 두 개의 필리스터 헤드 슬롯 드라이브 나사가 부착된 L자형 정렬 조각을 배치합니다(M1.6 x 0.35 미터법 거친, 12mm 길이; 그림 3A, 항목 a) 나사 바닥이 두개골에 평평하게 놓일 때까지 브레그마 위에 두개골에 압력이 가해지지 않도록 주의합니다(그림 2I-J).
4. 시아노아크릴레이트를 바른 다음 치과용 시멘트를 도포하여 나사 바닥을 두개골에 부착합니다. 해마 위의 이미징 창 참조 표시를 가리지 않도록 주의하십시오(그림 2K).

3. 영상창 개두술 수술

1. 이미징 창의 모서리를 나타내는 개두술 참조 표시의 각 위치에서(위의 1.14단계 참조) 0.7mm 직경의 버 구멍을 뚫은 다음 드릴로 1.4mm x 2mm 개두술 창의 주변을 반복적으로 더 깊게 절단하여 부드럽게 묘사합니다(그림 2L).
2. 두께가 약 300μm인 얇고 깨지기 쉬운 두개골에 너무 깊거나 너무 많은 힘을 가하지 않도록 주의하십시오. 뼈 피판이 완성되면 메스 끝으로 느슨한 피판을 들어 올리고 밑에 있는 경막이 손상되지 않도록 주의합니다.
3. 열린 창을 뼈 왁스로 덮습니다(그림 2M).
4. 0.9mm 직경의 버를 사용하여 경막외 EEG 전극의 향후 배치를 위해 3개의 구멍을 뚫습니다(위의 1.15단계 참조) 경막을 절단하지 않도록 주의합니다(그림 2E,L).
5. 세 개의 구멍을 뼈 왁스로 덮습니다.
6. 골왁지로 덮인 이미징 창과 EEG 구멍의 가장자리 주위에 시아노아크릴레이트를 부드럽게 바르고 개두술을 밀봉하지 않도록 주의합니다(그림 2L).
7. 이미징 창과 EEG 구멍을 둘러싸고 이전에 시멘트로 된 헤드 캡에 결합하는 치과용 시멘트 벽을 만듭니다(그림 2M 및 그림 3B, 항목 m).
8. 시멘트를 최소 10분 동안 건조시킵니다.
9. 4-0 또는 5-0 검은색 꼰 실크를 사용하여 간단한 단속 봉합사로 느슨한 상처 가장자리를 닫습니다(그림 2N 및 그림 3C).

4. 수술 후

1. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 노출된 피부 주위에 리도카인 연고를 바르면 상처 가장자리 주변의 감각을 약화시킵니다.
2. 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 노출된 피부에 네오스포린을 바릅니다.
3. 입체 프레임에서 동물을 제거합니다(그림 2N).
4. 수술 후 진통을 위해 케토프로펜(5mg/kg) IP 또는 IM을 주사합니다.
5. 동물이 경계하고 움직일 때까지 관찰하십시오(보통 몇 분 이내에 발생함).
6. 동물을 따뜻한 케이지에 넣고 물을 마시거나 먹고 동물 사육장으로 옮길 준비가 될 때까지 회복 상태를 계속 모니터링합니다.
7. 수술 후 약 1주일 동안 적어도 하루에 한 번 동물을 검사하여 무기력한 행동 및/또는 부적절한 식사/음주의 징후가 있는지 관찰합니다(그림 2O).

5. 염료 주입 및 EEG 기록

1. 헤드 캡 이식 수술 후 최소 하루를 기다렸다가 녹음을 시작합니다.
2. 마우스를 입체 프레임 내에서 몸체에 맞게 성형된 폼 억제 장치에 넣습니다(그림 3B, 항목 n 및 j).
3. 헤드 캡(그림 3 B-I, 항목 m)을 입체 프레임(그림 3A, B, 항목 e 및 j, 그림 4A)에 부착된 맞춤형 장착 막대에 고정합니다. 항목 e(그림 3A,B)의 긴 섹션은 길이가 9.4 – 13mm 사이여야 합니다. 항목 f(크기가 1.5cm x 0.5cm인 장착 플레이트, 중앙에서 중앙으로 4mm 떨어진 두 개의 구멍이 있음)를 항목 e(그림 3A, B, 항목 e, f 및 k)에 고정합니다. 이 정렬 시스템은 이미징 세션 전반에 걸쳐 깨어 있는 마우스를 입체 프레임에 안전하게 배치합니다(그림 4).
4. 경막외 EEG 기록 전극(그림 5A)을 삽입하고 접지 전극(흰색 와이어)을 후방 중앙 구멍에 배치하고 기록 전극(빨간색 와이어)을 전방 왼쪽 및 오른쪽 구멍에 배치합니다(그림 2E, 그림 4E 및 그림 5E). 각 와이어를 두개골과 경막 사이의 L자형에 배치하여(그림 5C) 전기 접촉을 최적화합니다.
5. 꼬리 정맥에 녹색 플루오레세인 라이신 고정 가능한 덱스트란(플루오레세인 5% w/w 25g)을 주입하여 해마 내 혈류를 시각화합니다.
   1. 주사 전에 쥐 꼬리의 중심 정맥의 확장을 향상시키려면 다음 전략 중 하나 이상을 사용하십시오 : a) 면봉 어플리케이터를 사용하여 중앙 정맥에 70 % 에탄올을 적용합니다. b) 꼬리를 따뜻한 물(35-40°C)에 1-3분 동안 담그십시오. c) 꼬리를 가열 램프에 몇 분 동안 노출시킵니다.
   2. 두 손가락으로 쥐의 꼬리를 고정하고 피부 바로 아래에 있는 중심 정맥을 찾습니다. 바늘(바늘 30G가 통합된 초미세 인슐린 주사기)을 비스듬히 위로 향하게 하여 꼬리 바닥에서 약 절반에서 2/3 지점의 정맥에 삽입합니다. 주입하는 동안 바늘을 꼬리와 평행하게 유지하십시오.
   3. 바늘이나 꼬리의 위치가 변하지 않도록 주의하면서 염료를 천천히 꾸준히 주입합니다.
      알림: 주사기 플런저를 누를 때 저항이 없어야 합니다.
   4. 주입 완료 후 바늘을 빼고 천자 부위에 부드러운 압력을 가하여 혈관을 밀봉합니다.
   5. 응고가 일어나도록 하십시오.

6. 생체 내 광섬유 번들 결합 전임상 컨포칼 레이저 스캐닝 내현미경(pCLE)

1. 꼬리 정맥 주입(위의 5.5.3단계) 직후, 300μm 비스듬한 광섬유 다발(각 다발에 5000–7000 3μm 섬유 포함)을 로봇 입체 드라이브의 모바일 암에 아래쪽 방향으로 고정합니다.
2. 개두술에서 뼈 왁스를 제거합니다.
3. 주사기 바늘의 구부러진 끝을 사용하여 경막을 제거합니다.
4. 로봇 포지셔닝 시스템을 사용하여 먼저 섬유 대물렌즈를 적절한 전방 후방 및 좌우 입체 위치로 이동하고 팁이 피질 표면의 z축에서 영점 조정됩니다.
5. EEG 기록을 시작합니다(그림 5D).
6. 광섬유 대물렌즈의 뒷면에 대한 컨포칼 레이저 스캐닝을 시작한 다음 로봇 마이크로 드라이브의 z-컨트롤을 사용하여 대물렌즈가 뇌 내의 목표 깊이에 도달할 때까지 z축에서 대물렌즈를 천천히 하강시킵니다(그림 4C). 하강하는 동안 현미경 소프트웨어에서 이미징 결과를 볼 수 있습니다.
   1. 광섬유 팁이 대상 X-Y-Z 기록 영역 내에 있고 두 개 이상의 선박이 이미징 창의 FOV에 들어가는 경우 하강을 중지하고 비디오 녹화를 시작합니다. Cellvizio Lab의 이미징 소프트웨어를 사용하여 11.7Hz에서 혈류의 라이브 전체 필드 타임랩스 동영상을 얻을 수 있습니다. (더 작은 FOV로 더 높은 속도를 얻을 수 있습니다). 녹음은 한 번에 4-5시간 동안 진행될 수 있으며 필요한 경우 연속적으로 며칠 동안 진행될 수 있습니다.
7. 바늘 끝에 비스듬한 실리콘 튜브가 고정된 10mL 주사기를 사용하여 생쥐 알갱이로 만든 페이스트를 주기적으로 물로 빻아 동물에게 먹이를 줍니다.
8. 이미징 세션이 끝나면 녹화를 종료합니다.
9. EEG 리드를 부드럽게 제거하고 Tergazyme으로 청소하십시오.
10. 입구의 z축을 따라 섬유를 뒤집어 동물의 뇌에서 광섬유 다발을 천천히 제거합니다.
11. 머리 기둥과 신체 구속 장치에서 동물을 풀어줍니다.
12. 적절한 경우 필요한 안락사 및 조직 처리 프로토콜을 따라 혈관을 시각화하고 면역조직화학을 수행합니다.
13. 향후 세션에서 동일한 동물의 사진을 촬영할 계획이라면 이미징 창을 뼈 왁스 또는 실라스틱으로 덮으십시오.

결과

우리는 발작의 결과로 발생하는 해마의 비정상적인 세포 주위 모세혈관 혈관 경련이 ictal 초점 ^9,13에서 세포 사멸에 기여하는 솔직한 저산소증을 유발할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 이러한 방법을 개발했습니다.

헤드 캡의 개발과 적절한 설치는 기록에 높은 안정성을 제공하여 ictal 및 interictal 기간 동안 야생형 및 간질성 각성...

토론

우리는 깨어 있는 쥐에서 전기생리학 및 광섬유 pCLE 실험을 동시에 수행할 수 있는 헤드 캡 구속 시스템을 개발하여 마취제로 인한 잠재적인 반응 오염을 줄였습니다. 헤드 캡과 장착 장치는 구성이 간단하며 만성 각성 행동 이미징 실험에 재사용할 수 있습니다. 생체 내 현미경 혈류 영상(TPLSM)의 황금 표준과 비교하여 기록의 품질을 확인했습니다.

여기에 설명된 프로토콜을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121