Endoscopia pré-clínica de varredura a laser confocal acoplada a fibra in vivo (pCLE) de capilares do hipocampo em camundongos acordados

Resumo

Considerando que a imagem multifóton só é eficaz em profundidades limitadas da superfície do tecido, é possível obter imagens com resolução de 3 μm em qualquer profundidade via pCLE. Aqui, apresentamos um protocolo para conduzir imagens de pCLE para medir a dinâmica microvascular no hipocampo de camundongos ictais e selvagens.

Resumo

O objetivo deste protocolo é descrever a endomicroscopia pré-clínica confocal de varredura a laser (pCLE) acoplada a feixe ótico de fibra óptica em sua aplicação específica para elucidar os efeitos do fluxo sanguíneo capilar durante convulsões, impulsionados por células murais. Imagens corticais in vitro e in vivo mostraram que constrições capilares impulsionadas por pericitos podem resultar de atividade neural local funcional, bem como da aplicação de fármacos, em animais saudáveis. Aqui, um protocolo é apresentado sobre como usar o pCLE para determinar o papel da dinâmica microvascular na degeneração neural na epilepsia, em qualquer profundidade tecidual (especificamente no hipocampo). Descrevemos uma técnica de apoio cefálico que foi adaptada para registrar a pCLE em animais acordados, para abordar os potenciais efeitos colaterais dos anestésicos sobre a atividade neural. Usando esses métodos, registros eletrofisiológicos e de imagem podem ser realizados ao longo de várias horas em estruturas neurais profundas do cérebro.

Introdução

Em contraste com outros métodos microscópicos de imagem 1,2,3,4,5,6,7,8, a microscopia confocal baseada em fibra óptica in vivo permite a medição da dinâmica do fluxo sanguíneo em qualquer região cerebral, em qualquer profundidade, em alta velocidade (até 240 Hz^, dependendo do tamanho do campo de^visão9). Uma sonda de fibra óptica permite imagens confocais de varredura a laser in vivo com resolução de 3 μm porque a ponta da sonda (uma objetiva sem lente composta por um feixe de 5000-6000 fibras individuais de 3 μm de diâmetro) pode ser posicionada com a precisão de um microeletrodo, dentro de 15 μm do alvo fluorescente de interesse. Assim como na imagem in vivo de dois fótons, os fluoróforos devem ser previamente introduzidos no alvo da imagem. Por exemplo, a fluoresceína dextran (ou pontos quânticos) pode ser injetada na vasculatura, ou proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, podem ser transfectadas em células, ou corantes fluorescentes como Oregon Green BAPTA-1 podem ser carregados em massa nas células, antes da imagem.

Pesquisas recentes utilizando essas técnicas descobriram que a atividade motora das células murais levando a vasoespasmos capilares ictais – constrições súbitas que ocorrem na posição das células murais durante convulsões 9 – pode contribuir para a neurodegeneração no hipocampo ictal⁹. Enquanto estudos de imagem anteriores mostraram constrições pericitárias in vitro e in vivo relacionadas à aplicação de fármacos 6,7,10,11,12^, Leal-Campanario e col. encontraram as primeiras evidências de constrições capilares espontâneas in vivo no encéfalo murino. Para estabelecer relevância para a epilepsia do lobo temporal humano, eles estudaram camundongos machos (P30-40 velhos) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) ^14,15 (JAX stock #003532), um modelo genético de ataxia episódica humana tipo 1¹⁵. Os pericitos conduziram vasoconstrições murais hipocampais patológicas e fisiológicas⁹ nos animais espontaneamente epilépticos e suas ninhadas selvagens (WT). Essas observações foram replicadas em animais WT tornados epilépticos com ácido caínico, indicando assim sua generalização para outras formas de epilepsia. Além disso, Leal-Campanario et al determinaram, usando novas abordagens de microscopia estereológica, que neurônios apoptóticos – mas não saudáveis – em animais epilépticos estavam espacialmente acoplados à microvasculatura hipocampal. Como a excitotoxicidade não tem associação espacial conhecida com a vasculatura, esse resultado indicou que a hipóxia induzida por isquemia vasoespasmódica capilar anormal contribui para a neurodegeneração na epilepsia. A Figura 1 mostra um esquema da configuração geral.

Protocolo

O protocolo segue as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Neurológico Barrow.

1. Posicionamento estereotáxico para craniotomia

1. Pesar e anestesiar o rato com um cocktail de ketamina-xilazina (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.). Certifique-se de que o animal esteja totalmente anestesiado, observando sua ausência de reação ao beliscão da cauda e/ou dos dedos dos pés.
2. Coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse e use um termômetro retal para monitorar continuamente sua temperatura corporal durante a cirurgia inicial de implante anestesiado (Figura 2A).
3. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos.
4. Estabilize a cabeça do animal em uma estrutura estereotáxica de roedor, equipada com um adaptador de mouse. Para orientar adequadamente o camundongo na armação estereotáxica, coloque os dentes do animal dentro do orifício da barra de mordida (Figura 2A e Figura 3A, item g). Apertar a pinça nasal até que fique confortável (Figura 2A,B e Figura 3A, item h). O posicionamento do corpo do mouse deve ser o mais reto possível (como na Figura 2A).
   1. Fixar ainda mais a cabeça do animal com barras auriculares de camundongo com manguitos de suporte de mandíbula (Figura 2A e Figura 3A, item i), para prender firmemente os processos zigomáticos do crânio.
      NOTA: Uma vez fixada, a cabeça do rato não deve ter qualquer amplitude de movimento horizontal.
5. Uma vez que o mouse esteja ajustado ao quadro estereotáxico (Figura 3B, item j), limpe e esterilize o couro cabeludo limpando-o com esfoliação de clor-hexedina 2-3 vezes, cada vez seguida de um enxágue com álcool. Em seguida, aplique lidocaína tópica no topo da cabeça.
6. Faça uma incisão ao longo da linha média de posterior para anterior (iniciar a incisão na base do crânio e concluí-la entre os olhos; 12-15 mm) ao longo da linha média sagital do crânio, usando uma tesoura fina ou uma lâmina. Retrair as bordas do couro cabeludo com quatro pinças de serrefine bulldog de 28 mm para expor o crânio e maximizar a área de trabalho (Figura 2B e Figura 3C).
7. Utilizar bisturi ou microespátula (Figura 3C) para raspar o periósteo até as bordas da incisão. Utilizar tesoura ou pinça separadora de tecido (Figura 3C) para retrair cuidadosamente os músculos da parte posterior do pescoço (Figura 2B).
8. Secar a parte superior do crânio com um aplicador com ponta de algodão, umedecido com álcool ou peróxido de hidrogênio a 30%, para otimizar a visualização das suturas cranianas. Aplique soro fisiológico no crânio uma vez que o tecido conjuntivo foi removido.
9. Uma vez estabilizada a cabeça do camundongo no aparelho estereotáxico, colocar a ponta da agulha da seringa (21 G) no suporte do eletrodo (Figura 3B, item l) e fixar o suporte do eletrodo no micromanipulador estereotáxico, abaixando a ponta da agulha até o nível do crânio (Figura 2D).
10. Ajustar a direção médio-lateral do crânio medindo a altura do crânio a qualquer distância posterior ao bregma (i.e., -2,0 mm), e duas distâncias iguais laterais da linha média em ambos os lados do crânio (i.e., ± 1,5 mm) (Figura 2D). Procure uma diferença de altura entre locais que seja inferior a 0,05 mm no sentido dorso-ventral.
    1. Se for maior que 0,05 mm, gire o crânio do mouse usando a barra de mordida ou reposicione a cabeça do mouse afrouxando as barras auriculares cuidadosamente, deslocando lateralmente a cabeça e as barras auriculares conforme necessário e, em seguida, reapertando as barras auriculares.
11. Uma vez posicionado o crânio no dispositivo estereotáxico, determine e registre as coordenadas estereotáxicas das suturas cranianas bregma e lambda ao longo dos eixos anteroposterior (AP), lateral medial (ML) e ventral dorsal (DV).
12. Identificar o ponto alvo (hipocampo direito) com o auxílio de um atlas estereotáxico. Em seguida, encontrar no crânio as coordenadas do ponto alvo em relação ao bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (Figura 2E).
13. Com um marcador cirúrgico, marque quatro cantos de uma janela de imagem de 1,4 mm x 2 mm no crânio com pontos, centrados ao redor do ponto alvo diretamente acima do hipocampo (Figura 2F), para posterior craniotomia.
14. Utilizar o marcador cirúrgico para desenhar dois pontos adicionais: um sobre o osso parietal superior esquerdo (Figura 2G) e outro sobre o osso frontal direito (Figura 2H), para indicar a futura colocação de dois parafusos ósseos (Figura 3A, item b) que ancorarão a calota (Figura 3B, item m) ao crânio.
15. Utilizar o marcador cirúrgico para desenhar mais três pontos indicando onde serão inseridos os eletrodos de registro do EEG peridural: um ponto posicionado 1 mm para cada lado da linha média e um ponto adicional na linha média posicionado 1 mm atrás do Lambda (Figura 2E, Figura 4A e Figura 5B).

2. Instalação do Head-Cap

1. Usando uma broca de 0,7 mm de diâmetro (Figura 3C), faça cuidadosamente dois pequenos orifícios no crânio, nas posições de ponto que indicam a colocação dos parafusos ósseos (ver passo 1.15 acima). Em seguida, pegar dois parafusos ósseos (ranhurado em aço inoxidável, comprimento: 4 mm; diâmetro: 0,85 mm) previamente desinfetados com etanol 70-80% e rosqueá-los ao crânio para maior estabilidade da calota (Figura 2I-J e Figura 3A, item b).
   1. Certifique-se de que as pontas do parafuso não se projetem além do fundo do osso para a cavidade do crânio, correndo o risco de danificar o cérebro. Observe que um dos dois parafusos ósseos estará anterior aos dois parafusos head-cap e o outro posterior a eles (Figura 2G-J).
2. Esguiche soro fisiológico sobre o crânio para resfriá-lo e limpá-lo. Em seguida, seque completamente o crânio e aplique uma fina camada de cianoacrilato ao redor dos parafusos.
3. Utilizar uma peça de alinhamento personalizada (Figura 3A, item c) presa ao microdrive montado no dispositivo estereotáxico (Figura 2F-J e Figura 3A, item d), de modo que a posição da cabeceira fique alinhada ao longo da linha média, com a crista anterior sobrejacente ao bregma. Esta peça personalizada em aço inoxidável tem formato de L (angulada a 90°), com dois furos separados por 4 mm (Figura 2F-J e Figura 3A, item c).
   1. Use o manipulador estereotáxico para posicionar a peça de alinhamento em forma de L, com dois parafusos de acionamento Fillister Head Slotted conectados (M1.6 x 0.35 Metric Coarse, 12 mm de comprimento; Figura 3A, item a) sobre o bregma, até que a base dos parafusos fique apoiada no crânio, tomando cuidado para não exercer pressão sobre o crânio (Figura 2I-J).
4. Aplicar cianoacrilato seguido de cimento dentário para fixar a base dos parafusos ao crânio. Cuidado para não obstruir as marcas de referência da janela de imagem sobre o hipocampo (Figura 2K).

3. Cirurgia de craniotomia por janela de imagem

1. Em cada uma das posições das marcas de referência de craniotomia que indicam os cantos da janela de imagem (ver passo 1.14 acima), perfurar um orifício de broca de 0,7 mm de diâmetro, seguido de delinear suavemente a periferia da janela de craniotomia de 1,4 mm x 2 mm com a broca, com cortes iterativamente mais profundos (Figura 2L).
2. Tome cuidado para não perfurar muito profundamente ou com muita força o crânio, que é fino e frágil, tendo uma espessura de aproximadamente 300 μm. Uma vez que o retalho ósseo esteja completo, pry o retalho solto com a ponta de um bisturi, estando atento para não danificar a dura-máter subjacente.
3. Cobrir a janela aberta com cera de osso (Figura 2M).
4. Usando uma broca de 0,9 mm de diâmetro, faça três orifícios para colocação futura dos eletrodos de EEG peridural (ver passo 1.15 acima), tomando cuidado para não cortar a dura-máter (Figura 2E,L).
5. Cubra os três orifícios com cera de osso.
6. Aplicar suavemente cianoacrilato ao redor das bordas da janela de imagem coberta com cera de osso e orifícios de EEG, tomando cuidado para não selar as craniotomias (Figura 2L).
7. Construir uma parede de cimento dentário que englobe a janela de imagem e os orifícios do EEG e a ligue à calota cefálica previamente cimentada (Figura 2M e Figura 3B, item m).
8. Deixe o cimento secar por pelo menos 10 minutos.
9. Fechar as margens frouxas da ferida com suturas simples interrompidas, utilizando seda trançada preta 4-0 ou 5-0 (Figura 2N e Figura 3C).

4. Pós-operatório

1. Use um aplicador com ponta de algodão para aplicar pomada de lidocaína ao redor da pele exposta para amortecer a sensação ao redor da borda da ferida.
2. Use um aplicador estéril com ponta de algodão para aplicar Neosporin na pele exposta.
3. Retire o animal da estrutura estereotáxica (Figura 2N).
4. Injetar cetoprofeno (5 mg/kg) IP ou IM para analgesia pós-cirúrgica.
5. Observe o animal até que ele esteja alerta e em movimento (isso geralmente ocorrerá dentro de minutos).
6. Coloque o animal em uma gaiola quente e continue monitorando sua recuperação até que ele beba ou coma e esteja pronto para ser transferido para o alojamento de animais.
7. Verificar o animal pelo menos uma vez ao dia por aproximadamente uma semana após a cirurgia, observando quaisquer sinais de comportamento apático e/ou alimentação/bebida inadequada (Figura 2O).

5. Injeção de corante e registro de EEG

1. Aguarde no mínimo um dia após a cirurgia de implante da touca para iniciar as gravações.
2. Coloque o mouse em um dispositivo de contenção de espuma moldado ao seu corpo, dentro da estrutura estereotáxica (Figura 3B, itens n & j).
3. Fixe a tampa da cabeça (Figura 3 B-I, item m) a uma barra de montagem personalizada que é fixada ao quadro estereotáxico (Figura 3A,B, itens e & j e Figura 4A). A seção longa do item e (Figura 3A,B) deve ter um comprimento entre 9,4 – 13 mm. Fixar o item f (uma placa de montagem com dimensões 1,5 cm x 0,5 cm, com dois furos separados 4 mm do centro para o centro) ao item e (Figura 3A,B, itens e, f e k). Esse sistema de alinhamento posicionará o mouse acordado de forma segura ao quadro estereotáxico durante as sessões de imagem (Figura 4).
4. Inserir os eletrodos de registro do EEG peridural (Figura 5A), colocando os eletrodos terra (fios brancos) dentro do orifício central posterior e os eletrodos de registro (fios vermelhos) nos orifícios anterior esquerdo e direito (Figura 2E, Figura 4E e Figura 5E). Posicione cada um dos fios em forma de L entre o crânio e a dura-máter (Figura 5C) para otimizar o contato elétrico.
5. Injetar a veia caudal com dextran verde fluoresceína lisina-fixável (0,2 mL/25 g em peso corporal de fluoresceína 5% p/p), para visualizar o fluxo sanguíneo dentro do hipocampo.
   1. Para aumentar a dilatação da veia central da cauda do rato antes da injeção, use uma ou mais das seguintes estratégias: a) Aplicar etanol 70% na veia central usando um aplicador com ponta de algodão; b) Mergulhar a cauda em água morna (35-40 °C) por 1-3 minutos; c) Exponha a cauda a uma lâmpada de aquecimento por alguns minutos.
   2. Fixe a cauda do rato com dois dedos e localize a veia central, que fica imediatamente abaixo da pele. Insira a agulha (seringa de insulina ultrafina com agulha integrada 30G), com o bisel para cima, na veia, aproximadamente a meio caminho a dois terços da base da cauda. Mantenha a agulha paralela à cauda durante a injeção.
   3. Injete o corante de forma lenta e constante, tomando cuidado para evitar qualquer alteração na posição da agulha ou cauda.
      NOTA: Não deve haver resistência ao deprimir o êmbolo da seringa.
   4. Depois de completar a injeção, retire a agulha e aplique uma pressão suave no local da punção para selar o vaso.
   5. Permitir que a coagulação ocorra.

6. Endomicroscopia pré-clínica confocal de varredura a laser (pCLE) acoplada a feixe óptico in vivo

1. Imediatamente após a injeção da veia caudal (passo 5.5.3 acima), prenda o feixe de fibra óptica chanfrado de 300 μm (contendo 5000–7000 fibras de 3 μm em cada feixe) na orientação para baixo para o braço móvel do acionamento estereotáxico robótico.
2. Remova a cera óssea da craniotomia.
3. Retire a dura-máter, usando a ponta dobrada de uma agulha de seringa.
4. Usando o sistema de posicionamento robótico, primeiro mova a objetiva da fibra para o local estereotáxico anteroposterior e esquerdo-direito apropriado, com a ponta zerada no eixo z na superfície do córtex.
5. Iniciar o registro do EEG (Figura 5D).
6. Iniciar varredura confocal a laser do plano posterior da fibra-objetiva, seguido diretamente pela descida lenta da objetiva no eixo z usando os controles z do microdrive robótico, até atingir a profundidade alvo dentro do cérebro (Figura 4C). Visualize os resultados das imagens no software microscópico enquanto desce.
   1. Se a ponta da fibra estiver dentro da região de gravação X-Y-Z alvo e dois ou mais vasos entrarem no FOV da janela de imagem, pare a descida e inicie as gravações de vídeo. Obtenha filmes de lapso de tempo de campo total ao vivo do fluxo sanguíneo a 11,7 Hz usando o software de imagem do Cellvizio Lab. (Velocidades maiores podem ser obtidas com um FOV menor). As gravações podem ocorrer por 4-5 horas de cada vez, em dias consecutivos, se necessário.
7. Com seringa de 10 mL com tubo chanfrado de silicone fixado na ponta da agulha, alimente o animal durante as gravações fornecendo periodicamente pasta feita com pastilhas de camundongos moídas com água.
8. Ao final da sessão de imagem, encerre as gravações.
9. Remova suavemente os eletrodos de EEG e limpe-os com Tergazyme.
10. Remova lentamente o feixe de fibra óptica do cérebro do animal, invertendo a fibra ao longo do eixo z de entrada.
11. Solte o animal do poste da cabeça e dos apoios corporais.
12. Se apropriado, siga os protocolos de eutanásia e processamento tecidual necessários para visualizar os vasos sanguíneos e realizar a imunohistoquímica.
13. Se estiver planejando gravar do mesmo animal em uma sessão futura, cubra a janela de imagem com cera de osso ou silástico.

Resultados

Desenvolvemos esses métodos para avaliar se vasoespasmos capilares anormais conduzidos por pericitos no hipocampo – que ocorrem como resultado de convulsões – poderiam causar hipóxia franca que contribui para a morte celular no foco ictal ^9,13.

O desenvolvimento da touca e sua instalação adequada proporcionaram alta estabilidade nos registros, permitindo o registro simultâneo do EEG e do fluxo sanguíneo profundo no hipocampo...

Discussão

Desenvolvemos um sistema de contenção head-cap para experimentos simultâneos de pCLE eletrofisiológico e de fibra óptica em camundongos acordados, reduzindo a potencial contaminação de resposta devido a drogas anestésicas. A tampa da cabeça e o aparelho de montagem são simples de construir e são reutilizáveis para experimentos de imagem crônicos de comportamento acordado. Verificamos a qualidade dos registros em relação ao padrão-ouro para imagens microscópicas de fluxo sanguíneo in vivo, TPLSM.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121