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要約

多光子イメージングは組織表面からの限られた深さでしか効果がありませんが、pCLEを介して任意の深さで3μm分解能のイメージングを達成することが可能です。ここでは、発作性マウスと野生型マウスの海馬の微小血管動態を測定するためのpCLEイメージングを実施するためのプロトコルを提示します。

要約

このプロトコルの目的は、壁細胞によって駆動される発作時の毛細血管血流効果を解明するための特定のアプリケーションにおいて、光ファイバーバンドル結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡(pCLE)を記述することです。In vitroおよびin vivo皮質イメージングは、周皮細胞によって引き起こされる毛細血管収縮が、健康な動物の機能的な局所神経活動および薬物適用に起因する可能性があることを示しています。ここでは、pCLEを使用して、てんかんの神経変性における微小血管ダイナミクスの役割を、あらゆる組織の深さ(特に海馬)で決定する方法に関するプロトコルが示されています。本稿では、神経活動に対する麻酔薬の潜在的な副作用に対処するために、覚醒した動物のpCLEを記録するために適応された頭部拘束技術について説明する。これらの方法を用いることで、脳の深部神経構造において、電気生理学的および画像的記録を数時間にわたって行うことができる。

概要

他の顕微鏡イメージング法1,2,3,4,5,6,7,8とは対照的に、in vivo光ファイバーベースの共焦点顕微鏡は、任意の脳領域の血流動態を、任意の深さで、高速(視野サイズに応じて最大240Hz)で測定することができます9 ).光ファイバープローブは、プローブの先端(直径5000〜6000本の3μmの個々のファイバーの束で構成されるレンズレス対物レンズ)を微小電極の精度で目的の蛍光ターゲットから15μm以内に配置できるため、3μmの分解能でin vivo共焦点レーザー走査イメージングを可能にします。in vivo 2光子イメージングと同様に、蛍光色素はイメージングターゲットに事前に導入しておく必要があります。例えば、フルオレセインデキストラン(または量子ドット)を血管系に注入したり、遺伝子にコードされた蛍光タンパク質を細胞にトランスフェクションしたり、Oregon Green BAPTA-1などの蛍光色素をイメージング前に細胞にバルクロードしたりすることができます。

これらの技術を用いた最近の研究では、発作性毛細血管痙攣(発作中に壁細胞の位置に起こる突然の収縮)につながる壁画細胞の運動活動が、発作性海馬の神経変性に寄与する可能性があることがわかった9。以前のイメージング研究では、in vitroおよびin vivoの周皮細胞の狭窄が薬物用途に関連することが示されていましたが6,7,10,11,12、Leal-Campanarioらは、マウスの脳におけるin vivoの自発的な毛細血管収縮の最初の証拠を発見しました。ヒトの側頭葉てんかんとの関連性を確立するために、彼らは雄(P30-40歳)ノックアウト(KO)Kv1.1(kcna1-null)マウス14,15(JAXストック#003532)、ヒトエピソード性運動失調症1型の遺伝的モデルを研究しました15。周皮細胞は、自然発生的にてんかんを起こした動物とその野生型(WT)同腹仔において、病理学的および生理学的海馬壁画血管収縮9を引き起こした。これらの観察は、カイニン酸でてんかんを起こしたWT動物で再現され、それによって他の形態のてんかんへの一般化を示しています。.さらに、Leal-Campanarioらは、新しい立体顕微鏡法を用いて、てんかん動物のアポトーシスニューロン(健康ではない)が海馬の微小血管系に空間的に結合していることを突き止めました。興奮毒性は血管系との空間的関連性が知られていないため、この結果は、異常な毛細血管血管痙攣性虚血誘発性低酸素症がてんかんの神経変性に寄与していることを示しました。図1は、一般的なセットアップの概略図を示しています。

プロトコル

このプロトコルは、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドラインに従っています。すべての手順は、バロー神経学研究所の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1.開頭手術のための脳定位固定装置

  1. マウスの体重を量り、ケタミン-キシラジン(100 mg / kg–10 mg / kg i.p.)カクテルで麻酔をかけます。.動物が尻尾やつま先をつまんでも反応しないことを観察して、動物が完全に麻酔されていることを確認してください。
  2. マウスの下に温熱パッドを置き、直腸体温計を使用して、最初の麻酔埋め込み手術中に体温を継続的に監視します(図2A)。
  3. 目の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗ります。
  4. マウスアダプターを装備したげっ歯類の脳定位固定装置フレームで動物の頭を安定させます。マウスを脳定位固定装置フレームに正しく配置するには、動物の歯をバイトバーの穴の内側に入れます(図2Aおよび図3A、項目g)。ノーズクランプをぴったりと収まるまで締めます(図2A、Bおよび図3A、項目h)。マウスの胴体の位置は、できるだけまっすぐにする必要があります(図2Aを参照)。
    1. さらに、顎ホルダーの袖口付きのマウスイヤーバー(図2Aおよび図3A、項目i)を使用して動物の頭を固定し、頭蓋骨の頬骨突起をしっかりと固定します。
      注意: 固定すると、マウスの頭部は水平方向に動く範囲がなくなります。
  5. マウスを脳定位固定装置フレームに合わせたら(図3B、項目j)、頭皮をクロールヘキセジンスクラブで2〜3回拭き、そのたびにアルコールリンスで頭皮を洗浄および滅菌します。次に、頭の上に局所リドカインを塗布します。
  6. 細いハサミまたは刃物を使用して、頭蓋骨の矢状正中線に沿って、後部から前方に向かって正中線に沿って切開します(頭蓋骨の基部から開始し、目の間に完了します;12〜15 mm)。4つの28mmブルドッグセレファインクランプで頭皮の境界を引っ込めて頭蓋骨を露出させ、作業領域を最大化します(図2B および 図3C)。
  7. メスまたはマイクロスパチュラ(図3C)を使用して、骨膜を切開部の端までこすります。組織分離用のハサミまたは鉗子(図3C)を使用して、首の後ろの筋肉を慎重に引っ込めます(図2B)。
  8. 頭蓋骨の上部を、アルコールまたは30%過酸化水素で湿らせた綿の先端アプリケーターで乾燥させ、頭蓋縫合糸の視覚化を最適化します。結合組織が除去されたら、頭蓋骨に生理食塩水を塗布します。
  9. マウスの頭部を脳定位固定装置で安定させたら、注射器の針先(21 G)を電極ホルダー(図3B、項目l)に置き、電極ホルダーを脳定位固定装置マイクロマニピュレーターに取り付け、針先を頭蓋骨の高さまで下げます(図2D)。
  10. ブレグマの後方の任意の距離(つまり、-2.0 mm)で頭蓋骨の高さを測定し、頭蓋骨の両側の正中線から外側に2つの等しい距離(つまり、±1.5 mm)を測定することにより、頭蓋骨の内側-外側方向を調整します(図2D)。背腹方向の高低差が0.05mm以下を目安にしてください。
    1. 0.05mmを超える場合は、バイトバーを使用してマウスの頭蓋骨を回転させるか、イヤーバーを慎重に緩め、必要に応じてヘッドとイヤーバーを横方向にずらしてから、イヤーバーを締め直してマウスの頭の位置を変えます。
  11. 頭蓋骨が定位固定装置に配置されたら、前後(AP)、内側外側(ML)、および背側腹側(DV)軸に沿ったブレグマとラムダの頭蓋骨縫合糸の定位座標を決定して記録します。
  12. 脳定位固定装置アトラスの助けを借りてターゲットポイント(右海馬)を特定します。次に、頭蓋骨でブレグマ(AP:-2.7 mm、ML:-2.7 mm)に対する目標点の座標を見つけます(図2E)。
  13. 外科マーカーを使用して、頭蓋骨の1.4 mm x 2 mmのイメージングウィンドウの4つの角に、海馬の真上のターゲットポイント(図2F)を中心にドットでマークし、その後の開頭術に使用します。
  14. 外科マーカーを使用して、左上の頭頂骨(図2G)と右前頭骨(図2H)の2つの点を描き、ヘッドキャップ(図3B、項目m)を頭蓋骨に固定する2本の骨スクリュー(図3A、項目b)の将来の配置を示します。
  15. 手術マーカーを使用して、硬膜外脳波記録電極が挿入される場所を示すさらに3つのドットを描きます:正中線の両側に1つのドットを配置し、ラムダの1mm後方に位置する正中線上に1つの追加のドット(図2E、図 4A 、 および図5B)。

2. ヘッドキャップの取り付け

  1. 直径0.7 mmのバリ(図3C)を使用して、頭蓋骨の2つの小さな穴を、骨のネジの位置を示すドットの位置に慎重に開けます(上記のステップ1.15を参照)。次に、エタノール70〜80%で消毒した2本の骨ネジ(ステンレス鋼スロット付き、長さ:4 mm、直径:0.85 mm)を取り、頭蓋骨にネジ止めしてヘッドキャップの安定性を高めます(図2I-J および 図3A、項目b)。
    1. ネジの先端が骨の底を超えて頭蓋骨腔に突き出ないようにし、脳に損傷を与える危険があります。2本の骨ネジのうち1本は2本のヘッドキャップスクリューの前方にあり、もう1本は2本の骨ねじの後方にあることに注意してください(図2G-J)。
  2. 頭蓋骨の上に生理食塩水を噴射して冷やし、きれいにします。次に、頭蓋骨を完全に乾かし、ネジの周りにシアノアクリレートの薄層を塗布します。
  3. 脳定位固定装置(図2F-Jおよび図3A、項目d)に取り付けられたマイクロドライブに固定されたカスタムアライメントピース(図3A、項目c)を使用して、ヘッドキャップの位置が正中線に沿って整列し、前隆起がブレグマを覆うようにします。このカスタムステンレス鋼片はL字型(90°の角度)で、2つの穴が4mm間隔で開いています(図2F-Jおよび図3A、項目c)。
    1. 脳定位固定装置マニピュレーターを使用して、2本のフィリスターヘッドスロット付きドライブネジ(M1.6 x 0.35メートル粗、長さ12 mm;図 3A、項目a)をブレグマの上に置き、頭蓋骨に圧力をかけないように注意しながら、ネジの基部が頭蓋骨に平らになるまで貼り付けます(図2I-J)。
  4. シアノアクリレートを塗布した後、歯科用セメントを塗布して、ネジの基部を頭蓋骨に取り付けます。海馬の上のイメージングウィンドウの基準マークを妨げないように注意してください(図2K)。

3.画像窓開頭手術

  1. イメージングウィンドウの角を示す開頭術基準マークの各位置(上記のステップ1.14を参照)に、直径0.7 mmのバリ穴を開け、続いてドリルで1.4 mm x 2 mmの開頭窓の周囲をドリルでゆっくりと描き、繰り返し深く切り込みます(図2L)。
  2. 厚さ約300μmの薄くて壊れやすい頭蓋骨に、深く穴を開けすぎたり、力を入れすぎたりしないように注意してください。骨のフラップが完成したら、下にある硬膜を傷つけないように注意しながら、メスの先端で緩んだフラップをこじ開けます。
  3. 開いた窓を骨ワックスで覆います(図2M)。
  4. 直径0.9mmのバリを使用して、硬膜外脳波電極を将来配置するための3つの穴を開けます(上記のステップ1.15を参照)硬膜を切断しないように注意します(図2E、L)。
  5. 3つの穴を骨のワックスで覆います。
  6. 開頭術を密閉しないように注意しながら、骨垢で覆われたイメージングウィンドウとEEGホールの端にシアノアクリレートを静かに塗布します(図2L)。
  7. イメージングウィンドウとEEGホールを囲み、以前にセメントで固定したヘッドキャップに結合する歯科用セメントの壁を構築します(図2M および 図3B、アイテムm)。
  8. セメントを少なくとも10分間乾燥させます。
  9. 4-0または5-0の黒い編組シルクを使用して、単純な中断縫合糸で緩んだ創傷マージンを閉じます(図2N および 図3C)。

4.術後

  1. 先端が綿のアプリケーターを使用して、露出した皮膚の周りにリドカイン軟膏を塗布し、傷口の周りの感覚を鈍化させます。
  2. 滅菌綿の先端アプリケーターを使用して、露出した皮膚にネオスポリンを塗布します。.
  3. 動物を脳定位固定装置フレームから取り出します(図2N)。
  4. 術後の鎮痛のためにケトプロフェン(5 mg / kg)IPまたはIMを注射します。
  5. 動物が警戒して動くまで観察します(これは通常、数分以内に発生します)。
  6. 動物を温かいケージに入れ、飲んだり食べたりして動物舎に移す準備ができるまで、回復を観察し続けます。
  7. 手術後約1週間は、少なくとも1日1回、動物の様子を観察し、無気力な行動や不適切な飲食の兆候がないか観察します(図2O)。

5.染料注入と脳波記録

  1. ヘッドキャップ移植手術後、最低1日待ってから記録を開始します。
  2. マウスを、脳定位固定装置フレーム内の体に成形された泡抑制装置に入れます(図3B、項目nおよびj)。
  3. ヘッドキャップ(図3 B-I、項目m)を、脳定位固定装置フレーム(図3A、B、項目eおよびj、および図4A)に取り付けられたカスタム取り付けバーに固定します。アイテムe(図3A、B)の長いセクションの長さは9.4〜13 mmである必要があります。アイテムf(寸法1.5 cm x 0.5 cmの取り付けプレート、中心から中心まで4 mm離れた2つの穴)をアイテムe(図3A、B、アイテムe、f、k)に固定します。このアライメントシステムは、イメージングセッション全体を通して、覚醒マウスを脳定位固定装置フレームにしっかりと配置します(図4)。
  4. 硬膜外脳波記録電極(図5A)を挿入し、接地電極(白線)を後方中央穴内に、記録電極(赤線)を前方の左右の穴(図2E、図4E、図5E)に配置します。頭蓋骨と硬膜の間に各ワイヤをL字型に配置し(図5C)、電気的接触を最適化します。
  5. 緑色フルオレセインリジン固定型デキストラン(0.2 mL/25 gのフルオレセイン5%w / w)を尾静脈に注入して、海馬内の血流を視覚化します。
    1. 注射前にマウスの尾部の中心静脈の拡張を促進するには、次の戦略の1つ以上を使用します:a)綿の先端アプリケーターを使用して中心静脈に70%エタノールを塗布します。b)テールを温水(35〜40°C)に1〜3分間浸します。c)テールを加熱ランプに数分間さらします。
    2. マウスの尻尾を2本の指で固定し、皮膚のすぐ下にある中心静脈を見つけます。針(針30Gを内蔵した極細インスリンジ)を、斜めを上にして、尾の付け根から約半分から3分の2の静脈に挿入します。注射中は針を尾と平行に保ちます。
    3. 針や尾の位置が変わらないように注意しながら、ゆっくりと着実に染料を注入します。
      注意: シリンジプランジャーを押し下げるときに抵抗があってはなりません。
    4. 注入が完了したら、針を抜き、穿刺部位に穏やかな圧力をかけて血管を密閉します。
    5. 凝固が起こるのを待ちます。

6. in vivo光ファイバーバンドル結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡(pCLE)

  1. 尾静脈注射(上記のステップ5.5.3)の直後に、300μmの斜めの光ファイバーバンドル(各バンドルに5000〜7000本の3μmファイバーを含む)を下向きにロボット定位固定装置ドライブの可動アームにクランプします。
  2. 開頭術から骨ワックスを取り除きます。
  3. シリンジ針の曲がった先端を使用して、硬膜を取り除きます。
  4. ロボットポジショニングシステムを使用して、まず、皮質表面のz軸で先端をゼロにして、ファイバー対物レンズを適切な前後および左右の脳定位固定位置に移動します。
  5. 脳波記録を開始します(図5D)。
  6. ファイバー対物レンズのバックプレーンの共焦点レーザースキャンを開始し、続いてロボットマイクロドライブのzコントロールを使用して対物レンズをz軸にゆっくりと下降させ、脳内のターゲット深度に到達します(図4C)。降下中に顕微鏡ソフトウェアでイメージング結果を表示します。
    1. ファイバー先端がターゲットのX-Y-Z記録領域内にあり、2つ以上の血管がイメージングウィンドウのFOVに入る場合は、降下を停止してビデオ録画を開始します。Cellvizio Labのイメージングソフトウェアを使用して、11.7Hzでの血流のライブフルフィールドタイムラプスムービーを取得します。(FOVを小さくすると、より高速になる場合があります)。録音は、必要に応じて連続した日で、一度に4〜5時間行われる場合があります。
  7. 針の先端に面取りされたシリコンチューブが固定された10 mLシリンジを使用して、水で粉砕したマウスペレットで作ったペーストを定期的に与えることにより、記録中に動物に与えます。
  8. イメージングセッションの最後に、記録を終了します。
  9. EEGリード線をそっと取り外し、Tergazymeで清掃します。
  10. 動物の脳から光ファイバーの束をゆっくりと取り除き、ファイバーを入射のz軸に沿って反転させます。
  11. 動物をヘッドポストと身体拘束具から解放します。
  12. 必要に応じて、必要な安楽死および組織処理プロトコルに従って、血管を視覚化し、免疫組織化学を行います。
  13. 将来のセッションで同じ動物から記録することを計画している場合は、イメージングウィンドウを骨ワックスまたはシラスティックで覆います。

結果

我々は、発作の結果として発生する海馬の異常な周皮細胞駆動毛細血管痙攣が、発作の焦点における細胞死に寄与する率直な低酸素症を引き起こす可能性があるかどうかを評価するために、これらの方法を開発しました9,13。

ヘッドキャップの開発と適切な設置により、記録の安定性が高くなり、野生型とてんかんの覚醒マウ?...

ディスカッション

我々は、覚醒マウスの電気生理学的実験と光ファイバーpCLE実験を同時に行うためのヘッドキャップ拘束システムを開発し、麻酔薬による潜在的な応答汚染を低減しました。ヘッドキャップと取り付け装置は簡単に組み立てることができ、慢性的な覚醒行動のイメージング実験に再利用できます。記録の品質を、in vivo顕微鏡血流イメージングのゴールドスタンダードであるTPLSMに照らして確認...

開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

このプロジェクトは、米国てんかん学会のResearch Initiative Award、Arizona Biomedical Research CommissionからS.L.M.への賞、およびResearch to Prevent Blindness Inc.からSUNYダウンステート健康科学大学眼科へのチャレンジ助成金、New York State Empire Innovation Programによって資金提供されました。 全米科学財団(0726113、0852636、1523614)、バロー神経学財団、マリアン・ロシェル夫人、グレース・ウェルトン夫人、ディグニティ・ヘルス・シード賞、全米科学財団(0726113、0852636、1523614)および国立衛生研究所(R01EY031971およびR01CA258021)からの連邦助成金から、S.L.M.およびS.M.C.への助成金。この作業は、国防次官補室(保健問題担当)の助成金も受けています。W81XWH-15-1-0138、SLM へL.-C.は、スペイン教育省のホセ・カスティジェホ・フェローシップの支援を受けました。O. Caballero 氏と M. Ledo 氏の技術的なアドバイスと支援に感謝します。 

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.7 mm diameter burrFine Science Tools19007-07For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burrFine Science Tools19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUSfrom Handpiece solutionAEU12C
Bull dog serrifine clumpFine Science Tools18050-28
CellVizio dual bandMauna Kea Technologies
CellVizio single bandMauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment pieceL-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting barThe long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5Fine Science Tools11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard PackageReliance Dental Mfg Co.602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine ScrewMSC industrial direct co.2834117
Fine Point scissorFine Science Tools14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)Invitrogen, USAD7137
Halsey smooth needle holderFine Science Tools12001-13
Kalt suture needle 3/8 curvedFine Science Tools12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouseStoelting Co. 5170451670
Methocel 2%Omnivision GmbHPZN: 04682367Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 MouseCWE Inc.08-13000
PhysioTel F20-EET transmittersDSI270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFTStoelting Co.C1351704
Sel-Tapping bone screwsFine Science Tools19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse StereotaxicStoelting Co51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0Fine Science Tools18020-40
Tissue separating microspatulaFine Science Tools10091-121

参考文献

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  3. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
  4. Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
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  8. Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
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  14. Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
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