Endomicroscopia confocale confocale a scansione laser accoppiata a fibre in vivo (pCLE) dei capillari dell'ippocampo in topi svegli

Riepilogo

Mentre l'imaging multifotone è efficace solo a profondità limitate dalla superficie del tessuto, è possibile ottenere immagini con risoluzione di 3 μm a qualsiasi profondità tramite pCLE. Qui, presentiamo un protocollo per condurre l'imaging pCLE per misurare la dinamica microvascolare nell'ippocampo di topi ictali e wild-type.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere l'endomicroscopia confocale a scansione laser (pCLE) pre-clinica accoppiata a fascio ottico nella sua applicazione specifica per chiarire gli effetti del flusso sanguigno capillare durante le convulsioni, guidati da cellule murali. L'imaging corticale in vitro e in vivo ha dimostrato che le costrizioni capillari guidate dai periciti possono derivare dall'attività neurale locale funzionale, nonché dall'applicazione di farmaci, in animali sani. Qui, viene presentato un protocollo su come utilizzare pCLE per determinare il ruolo della dinamica microvascolare nella degenerazione neurale nell'epilessia, a qualsiasi profondità tissutale (in particolare nell'ippocampo). Descriviamo una tecnica di poggiatesta che è stata adattata per registrare pCLE in animali svegli, per affrontare i potenziali effetti collaterali degli anestetici sull'attività neurale. Utilizzando questi metodi, le registrazioni elettrofisiologiche e di imaging possono essere condotte per diverse ore nelle strutture neurali profonde del cervello.

Introduzione

A differenza di altri metodi di imaging microscopico 1,2,3,4,5,6,7,8, la microscopia confocale in vivo basata su fibre ottiche consente di misurare la dinamica del flusso sanguigno in qualsiasi regione del cervello, a qualsiasi profondità^, ad alta velocità (fino a 240 Hz a seconda delle dimensioni del campo visivo⁹). Una sonda a fibre ottiche consente di ottenere immagini a scansione laser confocale in vivo con una risoluzione di 3 μm perché la punta della sonda (un obiettivo senza lente costituito da un fascio di 5000-6000 singole fibre di 3 μm di diametro) può essere posizionata con la precisione di un microelettrodo, entro 15 μm dal target fluorescente di interesse. Come per l'imaging a due fotoni in vivo, i fluorofori devono essere preventivamente introdotti nel bersaglio di imaging. Ad esempio, la fluoresceina destrano (o punti quantici) può essere iniettata nel sistema vascolare, o le proteine fluorescenti geneticamente codificate possono essere trasfettate nelle cellule, o i coloranti fluorescenti come Oregon Green BAPTA-1 possono essere caricati in massa nelle cellule, prima dell'imaging.

Recenti ricerche che utilizzano queste tecniche hanno scoperto che l'attività motoria delle cellule murali che porta a vasospasmo capillare ictale - improvvise costrizioni che si verificano nella posizione delle cellule murali durante le convulsioni 9 - può contribuire alla neurodegenerazione nell'ippocampo ictale⁹. Mentre precedenti studi di imaging hanno mostrato costrizioni dei periciti in vitro e in vivo collegate alle applicazioni di farmaci 6,7,10,11,12^, Leal-Campanario et al. hanno trovato la prima evidenza di costrizioni capillari spontanee in vivo nel cervello murino. Per stabilire la rilevanza per l'epilessia del lobo temporale umano, hanno studiato topi maschi (P30-40 old) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) ^14,15 (JAX stock #003532), un modello genetico di atassia episodica umana di tipo 1¹⁵. I periciti hanno provocato vasocostrizioni murali ippocampali sia patologiche che fisiologiche⁹ negli animali spontaneamente epilettici e nei loro compagni di cucciolata wild-type (WT). Queste osservazioni sono state replicate in animali WT resi epilettici con acido kainico, indicando così la loro generalizzazione ad altre forme di epilessia. Leal-Campanario et al. hanno inoltre determinato, utilizzando nuovi approcci di microscopia stereologica, che i neuroni apoptotici, ma non sani, negli animali epilettici erano spazialmente accoppiati alla microvascolarizzazione dell'ippocampo. Poiché l'eccitotossicità non ha alcuna associazione spaziale nota con il sistema vascolare, questo risultato ha indicato che l'ipossia indotta da ischemia vasospastica capillare anormale contribuisce alla neurodegenerazione nell'epilessia. La Figura 1 mostra uno schema della configurazione generale.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Barrow Neurological Institute.

1. Posizionamento stereotassico per craniotomia

1. Pesare e poi anestetizzare il topo con un cocktail ketamina-xilazina (100 mg/kg-10 mg/kg i.p.). Assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato osservando la sua mancanza di reazione al pizzicamento della coda e/o delle dita dei piedi.
2. Posizionare un termoforo sotto il mouse e utilizzare un termometro rettale per monitorare continuamente la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico di impianto anestetizzato iniziale (Figura 2A).
3. Applicare un unguento oftalmico per prevenire la secchezza oculare.
4. Stabilizzare la testa dell'animale in una cornice stereotassica per roditori, dotata di un adattatore per mouse. Per orientare correttamente il topo nel telaio stereotassico, posizionare i denti dell'animale all'interno del foro della barra del morso (Figura 2A e Figura 3A, punto g). Serrare il nasello clamp fino a quando non è aderente (Figura 2A,B e Figura 3A, elemento h). Il posizionamento del corpo del mouse deve essere il più dritto possibile (come nella Figura 2A).
   1. Fissare ulteriormente la testa dell'animale utilizzando barre auricolari di topo con polsini portamascelle (Figura 2A e Figura 3A, punto i), per bloccare saldamente i processi zigomatici del cranio.
      NOTA: Una volta fissata, la testa del mouse non dovrebbe avere un raggio di movimento orizzontale.
5. Una volta che il topo è stato adattato alla struttura stereotassica (Figura 3B, punto j), pulire e sterilizzare il cuoio capelluto strofinandolo con uno scrub a base di cloro-esodio 2-3 volte, ogni volta seguito da un risciacquo alcolico. Quindi, applicare la lidocaina topica sulla parte superiore della testa.
6. Praticare un'incisione lungo la linea mediana da posteriore ad anteriore (iniziare l'incisione alla base del cranio e completarla tra gli occhi; 12-15 mm) lungo la linea mediana sagittale del cranio, utilizzando forbici sottili o una lama. Ritrarre i bordi del cuoio capelluto con quattro pinze per serrefine bulldog da 28 mm per esporre il cranio e massimizzare l'area di lavoro (Figura 2B e Figura 3C).
7. Utilizzare un bisturi o una microspatola (Figura 3C) per raschiare il periostio fino ai bordi dell'incisione. Utilizzare una forbice o una pinza per separare i tessuti (Figura 3C) per ritrarre con cautela i muscoli nella parte posteriore del collo (Figura 2B).
8. Asciugare la parte superiore del cranio con un applicatore con punta di cotone, inumidito con alcol o perossido di idrogeno al 30%, per ottimizzare la visualizzazione delle suture craniche. Applicare soluzione fisiologica sul cranio una volta rimosso il tessuto connettivo.
9. Una volta che la testa del topo è stabilizzata nell'apparato stereotassico, posizionare la punta dell'ago della siringa (21 G) nel portaelettrodo (Figura 3B, elemento l) e collegare il portaelettrodo al micromanipolatore stereotassico, abbassando la punta dell'ago a livello del cranio (Figura 2D).
10. Regolare la direzione mediale-laterale del cranio misurando l'altezza del cranio a qualsiasi distanza posteriore al bregma (cioè -2,0 mm) e due distanze uguali lateralmente dalla linea mediana su entrambi i lati del cranio (cioè ± 1,5 mm) (Figura 2D). Puntare a una differenza di altezza tra i punti inferiore a 0,05 mm in direzione dorso-ventrale.
    1. Se maggiore di 0.05 mm, ruotare il cranio del mouse utilizzando la barra del morso o riposizionare la testa del mouse allentando con attenzione le barre auricolari, spostando lateralmente la testa e le barre auricolari secondo necessità, quindi serrando nuovamente le barre auricolari.
11. Una volta che il cranio è posizionato nel dispositivo stereotassico, determinare e registrare le coordinate stereotassiche delle suture del cranio bregma e lambda lungo gli assi anteroposteriore (AP), laterale mediale (ML) e ventrale dorsale (DV).
12. Identificare il punto target (ippocampo destro) con l'aiuto di un atlante stereotassico. Quindi, trova sul cranio le coordinate del punto bersaglio rispetto al bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (Figura 2E).
13. Utilizzando un marcatore chirurgico, contrassegnare i quattro angoli di una finestra di imaging di 1,4 mm x 2 mm sul cranio con punti, centrati attorno al punto bersaglio direttamente sopra l'ippocampo (Figura 2F), per la successiva craniotomia.
14. Utilizzare il marcatore chirurgico per disegnare due punti aggiuntivi: uno sopra l'osso parietale in alto a sinistra (Figura 2G) e un altro sopra l'osso frontale destro (Figura 2H), per indicare il futuro posizionamento di due viti ossee (Figura 3A, elemento b) che ancoreranno la calotta (Figura 3B, elemento m) al cranio.
15. Utilizzare il pennarello chirurgico per disegnare altri tre punti che indicano dove verranno inseriti gli elettrodi di registrazione EEG epidurale: un punto posizionato 1 mm su entrambi i lati della linea mediana e un punto aggiuntivo sulla linea mediana posizionato 1 mm dietro Lambda (Figura 2E, Figura 4A e Figura 5B).

2. Installazione del cappuccio della testa

1. Utilizzando una fresa di 0,7 mm di diametro (Figura 3C), praticare con cautela due piccoli fori nel cranio, in corrispondenza delle posizioni dei punti che indicano il posizionamento delle viti ossee (vedere il passaggio 1.15 sopra). Quindi, prendere due viti ossee (con intaglio in acciaio inossidabile, lunghezza: 4 mm; diametro: 0,85 mm) precedentemente disinfettate con etanolo al 70-80% e avvitarle al cranio per una maggiore stabilità del cappuccio della testa (Figura 2I-J e Figura 3A, elemento b).
   1. Assicurarsi che le punte delle viti non sporgano oltre la parte inferiore dell'osso nella cavità cranica, rischiando di danneggiare il cervello. Si noti che una delle due viti ossee sarà anteriore alle due viti a testa cilindrica e l'altra posteriore ad esse (Figura 2G-J).
2. Spruzzare soluzione fisiologica sul cranio per raffreddarlo e pulirlo. Quindi asciugare completamente il cranio e applicare un sottile strato di cianoacrilato attorno alle viti.
3. Utilizzare un pezzo di allineamento personalizzato (Figura 3A, elemento c) fissato al microdrive montato sul dispositivo stereotassico (Figura 2F-J e Figura 3A, elemento d), in modo che la posizione della cuffia sia allineata lungo la linea mediana, con la cresta anteriore sovrastante il bregma. Questo pezzo in acciaio inossidabile personalizzato è a forma di L (angolato a 90°), con due fori separati da 4 mm (Figura 2F-J e Figura 3A, elemento c).
   1. Utilizzare il manipolatore stereotassico per posizionare il pezzo di allineamento a forma di L, con due viti di azionamento con intaglio a testa bombata montate (M1,6 x 0,35 metrico grossolano, lunghezza 12 mm; Figura 3A, punto a) sopra il bregma, fino a quando la base delle viti non si appoggia sul cranio, facendo attenzione a non esercitare pressione sul cranio (Figura 2I-J).
4. Applicare cianoacrilato seguito da cemento dentale per fissare la base delle viti al cranio. Fare attenzione a non ostruire i segni di riferimento della finestra di imaging sopra l'ippocampo (Figura 2K).

3. Chirurgia craniotomica con finestra di imaging

1. In ciascuna delle posizioni dei segni di riferimento per craniotomia che indicano gli angoli della finestra di imaging (vedere il passaggio 1.14 sopra), praticare un foro di sbavatura di 0,7 mm di diametro, quindi delineare delicatamente la periferia della finestra craniotomica di 1,4 mm x 2 mm con il trapano, con tagli iterativi più profondi (Figura 2L).
2. Fare attenzione a non forare troppo in profondità o con troppa forza il cranio, che è sottile e fragile, avendo uno spessore di circa 300 μm. Una volta completato il lembo osseo, sollevare il lembo allentato con la punta di un bisturi, facendo attenzione a non danneggiare la dura madre sottostante.
3. Coprite la finestra aperta con cera per ossa (Figura 2M).
4. Utilizzando una fresa di 0,9 mm di diametro, praticare tre fori per il futuro posizionamento degli elettrodi EEG epidurale (vedere il passaggio 1.15 sopra) facendo attenzione a non tagliare la dura madre (Figura 2E,L).
5. Copri i tre fori con cera per ossa.
6. Applicare delicatamente il cianoacrilato attorno ai bordi della finestra di imaging ricoperta di cera ossea e dei fori EEG, facendo attenzione a non sigillare le craniotomie (Figura 2L).
7. Costruire una parete di cemento dentale che racchiuda la finestra di imaging e i fori EEG e la leghi al cappuccio della testa precedentemente cementato (Figura 2M e Figura 3B, elemento m).
8. Lasciare asciugare il cemento per almeno 10 minuti.
9. Chiudere i margini sciolti della ferita con semplici suture interrotte, utilizzando seta intrecciata nera 4-0 o 5-0 (Figura 2N e Figura 3C).

4. Post-operatorio

1. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per applicare l'unguento alla lidocaina intorno alla pelle esposta per attutire la sensazione intorno al bordo della ferita.
2. Utilizzare un applicatore sterile con punta in cotone per applicare Neosporin sulla pelle esposta.
3. Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico (Figura 2N).
4. Iniettare ketoprofene (5 mg/kg) IP o IM per l'analgesia post-chirurgica.
5. Osserva l'animale fino a quando non è vigile e si muove (questo di solito avviene in pochi minuti).
6. Metti l'animale in una gabbia calda e continua a monitorare il suo recupero fino a quando non beve o mangia ed è pronto per essere trasferito nella stabulazione dell'animale.
7. Controllare l'animale almeno una volta al giorno per circa una settimana dopo l'intervento, osservando eventuali segni di comportamento svogliato e/o di alimentazione/consumo inadeguato (Figura 2O).

5. Iniezione di colorante e registrazione EEG

1. Attendere almeno un giorno dopo l'intervento chirurgico di impianto del cappuccio per iniziare le registrazioni.
2. Posizionare il mouse in un dispositivo di contenimento in schiuma modellato sul suo corpo, all'interno della cornice stereotassica (Figura 3B, elementi n e j).
3. Fissare il cappuccio della testa (Figura 3 B-I, elemento m) a una barra di montaggio personalizzata fissata al telaio stereotassico (Figura 3A, B, elementi e e j e Figura 4A). La sezione lunga dell'elemento e (Figura 3A,B) deve avere una lunghezza compresa tra 9,4 e 13 mm. Fissare l'elemento f (una piastra di montaggio con dimensioni 1.5 cm x 0.5 cm, con due fori separati di 4 mm dal centro al centro) all'elemento e (Figura 3A, B, elementi e, f e k). Questo sistema di allineamento posizionerà il topo sveglio in modo sicuro al frame stereotassico durante le sessioni di imaging (Figura 4).
4. Inserire gli elettrodi di registrazione EEG epidurale (Figura 5A), posizionando gli elettrodi di terra (fili bianchi) all'interno del foro centrale posteriore e gli elettrodi di registrazione (fili rossi) nei fori anteriori sinistro e destro (Figura 2E, Figura 4E e Figura 5E). Posizionare ciascuno dei fili a forma di L tra il cranio e la dura madre (Figura 5C) per ottimizzare il contatto elettrico.
5. Iniettare nella vena caudale destrano fissabile con fluoresceina verde lisina (0,2 ml/25 g di fluoresceina 5% p/p), per visualizzare il flusso sanguigno all'interno dell'ippocampo.
   1. Per migliorare la dilatazione della vena centrale della coda del topo prima dell'iniezione, utilizzare una o più delle seguenti strategie: a) Applicare etanolo al 70% sulla vena centrale utilizzando un applicatore con punta di cotone; b) Immergere la coda in acqua tiepida (35-40 °C) per 1-3 minuti; c) Esporre la coda a una lampada riscaldante per alcuni minuti.
   2. Fissa la coda del topo con due dita e individua la vena centrale, che si trova immediatamente sotto la pelle. Inserire l'ago (siringa da insulina ultrafine con ago integrato 30G), con lo smusso rivolto verso l'alto, nella vena, a circa metà o due terzi dalla base della coda. Tenere l'ago parallelo alla coda durante l'iniezione.
   3. Iniettare il colorante lentamente e costantemente, facendo attenzione a evitare qualsiasi cambiamento nella posizione dell'ago o della coda.
      NOTA: Non dovrebbe esserci resistenza quando si preme lo stantuffo della siringa.
   4. Dopo aver completato l'iniezione, estrarre l'ago e applicare una leggera pressione sul sito di puntura per sigillare il vaso.
   5. Lasciare che si verifichi la coagulazione.

6. Endomicroscopia confocale a scansione laser confocale accoppiata a fascio ottico in fibra ottica in vivo (pCLE)

1. Subito dopo l'iniezione della vena caudale (passaggio 5.5.3 sopra), bloccare il fascio di fibre ottiche smussate da 300 μm (contenente 5000-7000 fibre da 3 μm in ciascun fascio) con orientamento verso il basso rispetto al braccio mobile dell'azionamento stereotassico robotico.
2. Rimuovere la cera ossea dalla craniotomia.
3. Rimuovere la dura, usando la punta piegata di un ago da siringa.
4. Utilizzando il sistema di posizionamento robotico, spostare prima l'obiettivo in fibra nella posizione stereotassica anteriore-posteriore e sinistra-destra appropriata, con la punta azzerata sull'asse z sulla superficie della corteccia.
5. Avviare la registrazione EEG (Figura 5D).
6. Avviare la scansione laser confocale del piano posteriore dell'obiettivo in fibra, seguita direttamente dalla discesa lenta dell'obiettivo sull'asse z utilizzando i controlli z del microdrive robotico, fino a raggiungere la profondità del bersaglio all'interno del cervello (Figura 4C). Visualizzare i risultati dell'imaging nel software microscopico durante la discesa.
   1. Se la punta della fibra si trova all'interno della regione di registrazione X-Y-Z target e due o più vasi entrano nel campo visivo della finestra di imaging, interrompere la discesa e avviare le registrazioni video. Ottieni filmati time-lapse in tempo reale a tutto campo del flusso sanguigno a 11,7 Hz utilizzando il software di imaging di Cellvizio Lab. (Velocità più elevate possono essere ottenute con un FOV inferiore). Le registrazioni possono avvenire per 4-5 ore alla volta, in giorni consecutivi se necessario.
7. Utilizzando una siringa da 10 mL con tubo di silicone smussato fissato alla punta dell'ago, nutrire l'animale durante le registrazioni fornendo periodicamente pasta a base di pellet di topi macinati con acqua.
8. Al termine della sessione di imaging, terminare le registrazioni.
9. Rimuovere delicatamente gli elettrocateteri EEG e pulirli con Tergazyme.
10. Rimuovere lentamente il fascio di fibre ottiche dal cervello dell'animale invertendo la fibra lungo l'asse z di ingresso.
11. Sganciare l'animale dal montante della testa e dai sistemi di ritenuta per il corpo.
12. Se appropriato, seguire i protocolli di eutanasia e di trattamento dei tessuti necessari per visualizzare i vasi sanguigni ed eseguire l'immunoistochimica.
13. Se si prevede di registrare dallo stesso animale in una sessione futura, coprire la finestra di imaging con cera ossea o silastico.

Risultati

Abbiamo sviluppato questi metodi per valutare se i vasospasmi capillari anormali guidati dai periciti nell'ippocampo, che si verificano a seguito di convulsioni, potrebbero causare ipossia franca che contribuisce alla morte cellulare nel focus ictale ^9,13.

Lo sviluppo del cappuccio e la sua corretta installazione hanno offerto un'elevata stabilità nelle registrazioni, consentendo la registrazione simultanea dell'EEG e del flusso sangu...

Discussione

Abbiamo sviluppato un sistema di ritenuta testa-cappuccio per esperimenti elettrofisiologici e pCLE simultanei a fibre ottiche in topi svegli, riducendo la potenziale contaminazione della risposta dovuta ai farmaci anestetici. Il cappuccio per la testa e l'apparato di montaggio sono semplici da costruire e sono riutilizzabili per esperimenti di imaging cronico da svegli. Abbiamo verificato la qualità delle registrazioni rispetto al gold standard per l'imaging microscopico del flusso sanguigno in vivo, TPLSM.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121