Uyanık Farelerde Hipokampal Kılcal Damarların İn Vivo Fiber Bağlantılı Klinik Öncesi Konfokal Lazer Taramalı Endomikroskopisi (pCLE)

Özet

Multifoton görüntüleme sadece doku yüzeyinden sınırlı derinliklerde etkili olurken, pCLE ile herhangi bir derinlikte 3 μm çözünürlükte görüntüleme elde etmek mümkündür. Burada, iktal ve vahşi tip farelerin hipokampusundaki mikrovasküler dinamikleri ölçmek için pCLE görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Bu protokolün amacı, duvar hücreleri tarafından yönlendirilen nöbetler sırasında kılcal kan akışı etkilerini aydınlatmak için spesifik uygulamasında fiber-optik-demet bağlantılı klinik öncesi konfokal lazer taramalı endomikroskopiyi (pCLE) tanımlamaktır. İn vitro ve in vivo kortikal görüntüleme, perisitler tarafından yönlendirilen kılcal daralmaların, sağlıklı hayvanlarda fonksiyonel lokal nöral aktivitenin yanı sıra ilaç uygulamasından da kaynaklanabileceğini göstermiştir. Burada, epilepside nöral dejenerasyonda mikrovasküler dinamiklerin rolünü belirlemek için pCLE'nin nasıl kullanılacağına dair bir protokol sunulmaktadır, herhangi bir doku derinliğinde (özellikle hipokampusta). Anesteziklerin nöral aktivite üzerindeki potansiyel yan etkilerini ele almak için uyanık hayvanlarda pCLE kaydetmek için uyarlanmış bir baş desteği tekniğini tanımladık. Bu yöntemler kullanılarak, beynin derin sinir yapılarında birkaç saat boyunca elektrofizyolojik ve görüntüleme kayıtları yapılabilir.

Giriş

Diğer mikroskobik görüntüleme yöntemlerinin ^{1,2,3,4,5,6,7,8} aksine, in vivo fiber optik tabanlı konfokal mikroskopi, herhangi bir beyin bölgesinde, herhangi bir derinlikte^, yüksek hızda (görüş alanı boyutuna bağlı olarak 240 Hz'e kadar) kan akış dinamiklerinin ölçülmesine olanak tanır 9 ). Bir fiber optik prob, 3 μm çözünürlükte in vivo konfokal lazer tarama görüntülemeye olanak tanır, çünkü probun ucu (5000-6000 3 μm çapında ayrı liflerden oluşan bir demetten oluşan lenssiz bir objektif) bir mikroelektrot doğruluğu ile ilgilenilen floresan hedefinin 15 μm içinde konumlandırılabilir. İn vivo iki fotonlu görüntülemede olduğu gibi, floroforlar görüntüleme hedefine önceden dahil edilmelidir. Örneğin, floresein dekstran (veya kuantum noktaları) vaskülatüre enjekte edilebilir veya genetik olarak kodlanmış floresan proteinler hücrelere transfekte edilebilir veya Oregon Green BAPTA-1 gibi floresan boyalar, görüntülemeden önce hücrelere toplu olarak yüklenebilir.

Bu teknikleri kullanan son araştırmalar, iktal kılcal vazospazmlara yol açan duvar hücresi motor aktivitesinin - nöbetler^sırasında duvar hücrelerinin pozisyonunda meydana gelen ani daralmalar 9 - iktal hipokampusta nörodejenerasyona katkıda bulunabileceğini bulmuştur⁹. Önceki görüntüleme çalışmaları ilaç uygulamalarına bağlı in vitro ve in vivo perisit daralmaları^{gösterirken 6,7,10,11,12,} Leal-Campanario ve ark. murin beyninde in vivo spontan kılcal daralmaların ilk kanıtını buldu. İnsan temporal lob epilepsisi ile alaka kurmak için, insan epizodik ataksisi tip 1 15'in genetik bir modeli olan erkek (P30-40 eski) nakavt (KO) Kv1.1 (kcna1-null) fareler^14,15 (JAX stok #003532) üzerinde çalıştılar. Perisitler, spontan epileptik hayvanlarda ve onların vahşi tip (WT) yavrularında hem patolojik hem de fizyolojik hipokampal duvar vazokonstriksiyonlarını⁹ tetikledi. Bu gözlemler, kainik asit ile epileptik hale getirilen WT hayvanlarında tekrarlandı ve böylece diğer epilepsi formlarına genellendiklerini gösterdi. Leal-Campanario ve arkadaşları ayrıca, yeni stereolojik mikroskopi yaklaşımları kullanarak, epileptik hayvanlardaki apoptotik (ancak sağlıklı olmayan) nöronların hipokampal mikrovaskülatüre uzamsal olarak bağlandığını belirlediler. Eksitotoksisitenin vaskülatür ile bilinen bir uzamsal ilişkisi olmadığından, bu sonuç anormal kapiller vazospazmik iskemiye bağlı hipoksinin epilepside nörodejenerasyona katkıda bulunduğunu göstermiştir. Şekil 1, genel kurulumun bir şemasını göstermektedir.

Protokol

Protokol, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Yönergelerini takip eder. Tüm prosedürler Barrow Nöroloji Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Kraniyotomi için stereotaksik konumlandırma

1. Fareyi tartın ve ardından bir ketamin-ksilazin (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.) kokteyli ile uyuşturun. Kuyruk ve/veya ayak parmağı sıkışmasına tepki vermediğini gözlemleyerek hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
2. Farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin ve ilk anestezi implantasyon ameliyatı sırasında vücut sıcaklığını sürekli olarak izlemek için bir rektal termometre kullanın (Şekil 2A).
3. Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürün.
4. Hayvanın başını, bir fare adaptörü ile donatılmış kemirgen stereotaksik bir çerçevede sabitleyin. Fareyi stereotaksik çerçevede düzgün bir şekilde yönlendirmek için, hayvanın dişlerini ısırma çubuğunun deliğine yerleştirin (Şekil 2A ve Şekil 3A, madde g). Burun kelepçesini tam oturana kadar sıkın (Şekil 2A,B ve Şekil 3A, madde h). Farenin vücut konumu mümkün olduğunca düz olmalıdır ( Şekil 2A'daki gibi).
   1. Kafatasının elmacık süreçlerini sıkıca kenetlemek için çene tutucu manşetli fare kulak çubuklarını (Şekil 2A ve Şekil 3A, madde i) kullanarak hayvanın kafasını daha da sabitleyin.
      NOT: Sabitlendikten sonra, farenin kafasında yatay hareket aralığı olmamalıdır.
5. Fare stereotaksik çerçeveye ayarlandıktan sonra (Şekil 3B, madde j), kafa derisini 2-3 kez klor-heksedin ovma ile silerek temizleyin ve sterilize edin, ardından her seferinde alkollü durulama yapın. Ardından, başın üstüne topikal lidokain uygulayın.
6. İnce makas veya bıçak kullanarak kafatasının sagital orta hattı boyunca posteriordan anteriora orta hat boyunca bir kesi yapın (kesiyi kafatasının tabanından başlatın ve gözler arasında tamamlayın; 12-15 mm). Kafatasını ortaya çıkarmak ve çalışma alanını en üst düzeye çıkarmak için kafa derisinin kenarlarını dört adet 28 mm bulldog serrefine kelepçe ile geri çekin (Şekil 2B ve Şekil 3C).
7. Periosteumu insizyonun kenarlarına kazımak için bir neşter veya mikrospatula (Şekil 3C) kullanın. Boynun arkasındaki kasları dikkatlice geri çekmek için doku ayırıcı makas veya forseps kullanın (Şekil 3C) (Şekil 2B).
8. Kraniyal sütürlerin görselleştirilmesini optimize etmek için kafatasının üst kısmını alkol veya% 30 hidrojen peroksit ile nemlendirilmiş pamuk uçlu bir aplikatör ile kurulayın. Bağ dokusu çıkarıldıktan sonra kafatasına salin uygulayın.
9. Farenin kafası stereotaksik aparatta stabilize edildikten sonra, elektrot tutucusuna bir şırınga iğne ucu (21 G) yerleştirin (Şekil 3B, madde l) ve elektrot tutucuyu stereotaksik mikromanipülatöre takın, iğne ucunu kafatası seviyesine indirin (Şekil 2D).
10. Kafatasının yüksekliğini bregmanın arkasındaki herhangi bir mesafede (yani -2.0 mm) ve kafatasının her iki tarafında orta hattan yanal iki eşit mesafede (yani ± 1.5 mm) ölçerek kafatasının medial-lateral yönünü ayarlayın (Şekil 2D). Dorsal-ventral yönde 0,05 mm'den daha az olan konumlar arasında bir yükseklik farkı hedefleyin.
    1. 0,05 mm'den büyükse, ısırma çubuğunu kullanarak farenin kafatasını döndürün veya kulak çubuklarını dikkatlice gevşeterek, gerektiğinde başı ve kulak çubuklarını yanal olarak kaydırarak ve ardından kulak çubuklarını yeniden sıkarak farenin kafasını yeniden konumlandırın.
11. Kafatası stereotaksik cihaza yerleştirildikten sonra, anteroposterior (AP), medial lateral (ML) ve dorsal ventral (DV) eksenler boyunca bregma ve lambda kafatası sütürlerinin stereotaktik koordinatlarını belirleyin ve kaydedin.
12. Stereotaksik atlas yardımıyla hedef noktayı (sağ hipokampus) belirleyin. Ardından, kafatasında bregmaya göre hedef nokta koordinatlarını bulun (AP: -2.7 mm, ML: -2.7 mm) (Şekil 2E).
13. Cerrahi bir işaretleyici kullanarak, kafatası üzerindeki 1.4 mm x 2 mm'lik bir görüntüleme penceresinin dört köşesini, sonraki kraniotomi için doğrudan hipokampusun (Şekil 2F) üzerindeki hedef noktanın etrafında ortalanmış noktalarla işaretleyin.
14. İki ek nokta çizmek için cerrahi işaretleyiciyi kullanın: biri sol üst parietal kemiğin üzerine (Şekil 2G) ve diğeri sağ ön kemiğin üzerine (Şekil 2H), iki kemik vidasının gelecekteki yerleşimini belirtmek için (Şekil 3A, madde b) kafa başlığını (Şekil 3B, madde m) kafatasına sabitleyecek.
15. Epidural EEG kayıt elektrotlarının nereye yerleştirileceğini gösteren üç nokta daha çizmek için cerrahi işaretleyiciyi kullanın: orta hattın her iki tarafına 1 mm yerleştirilmiş bir nokta ve Lambda'nın 1 mm arkasına yerleştirilmiş orta hatta bir ek nokta (Şekil 2E, Şekil 4A ve Şekil 5B).

2. Head-Cap kurulumu

1. 0.7 mm çapında bir çapak kullanarak (Şekil 3C), kafatasında kemik vidalarının yerleşimini gösteren nokta konumlarında dikkatlice iki küçük delik açın (yukarıdaki adım 1.15'e bakın). Ardından, daha önce %70-80 etanol ile dezenfekte edilmiş iki kemik vidasını (paslanmaz çelik oluklu, uzunluk: 4 mm; çap: 0,85 mm) alın ve ek kafa kapağı stabilitesi için kafatasına vidalayın (Şekil 2I-J ve Şekil 3A, madde b).
   1. Vida uçlarının kemiğin altından kafatası boşluğuna doğru çıkıntı yapmadığından ve beyne zarar verme riskine girmediğinden emin olun. İki kemik vidasından birinin iki kafa kapağı vidasının önünde, diğerinin ise arkasında olacağına dikkat edin (Şekil 2G-J).
2. Kafatasını soğutmak ve temizlemek için üzerine tuzlu su püskürtün. Ardından kafatasını tamamen kurutun ve vidaların etrafına ince bir siyanoakrilat tabakası uygulayın.
3. Özel bir hizalama parçası kullanın (Şekil 3A, madde c) clampstereotaksik cihaza monte edilmiş mikro sürücüye (Şekil 2F-J ve Şekil 3A, öğe d), böylece kafa başlığının konumu orta hat boyunca hizalanır, ön çıkıntı bregma üzerinde. Bu özel paslanmaz çelik parça L şeklindedir (90° açılı), 4 mm ile ayrılmış iki delik vardır (Şekil 2FJ ve Şekil 3A, öğe c).
   1. L şeklindeki hizalama parçasını konumlandırmak için stereotaksik manipülatörü kullanın, iki Dolgu Başlı Oluklu tahrik vidası takılı (M1.6 x 0.35 Metrik Kaba, 12 mm Uzunluk; Şekil 3A, madde a) bregma üzerinde, vidaların tabanı kafatası üzerinde düz durana kadar, kafatasına baskı uygulamamaya dikkat ederek (Şekil 2I-J).
4. Vidaların tabanını kafatasına tutturmak için siyanoakrilat ve ardından diş çimentosu uygulayın. Hipokampus üzerindeki görüntüleme penceresi referans işaretlerini engellememeye dikkat edin (Şekil 2K).

3. Görüntüleme penceresi kraniyotomi ameliyatı

1. Görüntüleme penceresinin köşelerini gösteren kraniyotomi referans işaretlerinin konumlarının her birinde (yukarıdaki adım 1.14'e bakın), 0,7 mm çapında bir çapak deliği açın, ardından 1,4 mm x 2 mm kraniyotomi penceresinin çevresini matkapla yinelemeli olarak daha derin kesiklerle nazikçe tanımlayın (Şekil 2L).
2. İnce ve kırılgan olan, kalınlığı yaklaşık 300 μm olan kafatasını çok derin veya çok fazla kuvvetle delmemeye özen gösterin. Kemik flebi tamamlandıktan sonra, gevşek kanadı bir neşterin ucuyla yukarı kaldırın ve alttaki dura materyale zarar vermemeye dikkat edin.
3. Açık pencereyi kemik balmumu ile örtün (Şekil 2M).
4. 0.9 mm çapında bir çapak kullanarak, epidural EEG elektrotlarının gelecekteki yerleşimi için üç delik açın (yukarıdaki adım 1.15'e bakın) dura mater'i kesmemeye dikkat edin (Şekil 2E, L).
5. Üç deliği kemik mumu ile örtün.
6. Kraniyotomileri kapatmamaya dikkat ederek, kemik mumu kaplı görüntüleme penceresinin ve EEG deliklerinin kenarlarına siyanoakrilat uygulayın (Şekil 2L).
7. Görüntüleme penceresini ve EEG deliklerini kapsayan ve onu önceden çimentolu başlık başlığına bağlayan bir diş çimentosu duvarı oluşturun (Şekil 2M ve Şekil 3B, madde m).
8. Çimentoyu en az 10 dakika kurumaya bırakın.
9. Gevşek yara kenarlarını 4-0 veya 5-0 siyah örgülü ipek kullanarak basit kesintili dikişlerle kapatın (Şekil 2N ve Şekil 3C).

4. Ameliyat sonrası

1. Yaranın kenarındaki hissi azaltmak için açıkta kalan cildin etrafına lidokain merhem uygulamak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
2. Neosporin'i açıkta kalan cilde uygulamak için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
3. Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın (Şekil 2N).
4. Cerrahi sonrası analjezi için ketoprofen (5 mg / kg) IP veya IM enjekte edin.
5. Hayvanı uyanık ve hareket edene kadar gözlemleyin (bu genellikle birkaç dakika içinde gerçekleşir).
6. Hayvanı ılık bir kafese koyun ve içene veya yene ve hayvan barınağına transfer edilmeye hazır olana kadar iyileşmesini izlemeye devam edin.
7. Ameliyattan sonra yaklaşık bir hafta boyunca hayvanı günde en az bir kez kontrol edin, herhangi bir kayıtsız davranış ve/veya yetersiz yeme/içme belirtisi olup olmadığını izleyin (Şekil 2O).

5. Boya enjeksiyonu ve EEG kaydı

1. Kayıtları başlatmak için başlık implantasyonu ameliyatından sonra en az bir gün bekleyin.
2. Fareyi, stereotaksik çerçeve içinde, gövdesine kalıplanmış bir köpük tutucu cihaza yerleştirin (Şekil 3B, madde n ve j).
3. Başlık kapağını (Şekil 3 B-I, madde m) stereotaksik çerçeveye takılan özel bir montaj çubuğuna sabitleyin (Şekil 3A,B, e ve j öğeleri ve Şekil 4A). E maddesinin uzun kesiti (Şekil 3A,B) 9.4 – 13 mm arasında bir uzunluğa sahip olmalıdır. f öğesini (1.5 cm x 0.5 cm boyutlarında, merkezden merkeze 4 mm ayrılmış iki deliği olan bir montaj plakası) e öğesine sabitleyin (Şekil 3A,B, e, f ve k öğeleri). Bu hizalama sistemi, görüntüleme seansları boyunca uyanık fareyi stereotaksik çerçeveye güvenli bir şekilde konumlandıracaktır (Şekil 4).
4. Epidural EEG kayıt elektrotlarını (Şekil 5A), toprak elektrotlarını (beyaz teller) arka merkezi deliğe ve kayıt elektrotlarını (kırmızı teller) ön sol ve sağ deliklere yerleştirin (Şekil 2E, Şekil 4E ve Şekil 5E). Elektrik temasını optimize etmek için tellerin her birini kafatası ile dura mater arasında L şeklinde konumlandırın (Şekil 5C).
5. Hipokampus içindeki kan akışını görselleştirmek için kuyruk damarına yeşil floresein lizin ile sabitlenebilir dekstran (0.2 mL / 25 g vücut ağırlıkça %5 w / w) enjekte edin.
   1. Enjeksiyondan önce farenin kuyruğunun merkezi damarının genişlemesini arttırmak için aşağıdaki stratejilerden birini veya birkaçını kullanın: a) Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak merkezi damara %70 etanol uygulayın; b) Kuyruğu 1-3 dakika ılık suya (35-40 °C) batırın; c) Kuyruğu birkaç dakika ısıtma lambasına maruz bırakın.
   2. Farenin kuyruğunu iki parmağınızla sabitleyin ve derinin hemen altında bulunan merkezi damarı bulun. İğneyi (entegre iğne 30G'li ultra ince insülin şırıngası), eğim yukarı bakacak şekilde, kuyruğun tabanının yaklaşık yarısı ila üçte ikisi arasında damarın içine sokun. Enjeksiyon sırasında iğneyi kuyruğa paralel tutun.
   3. İğnenin veya kuyruğun konumunda herhangi bir değişiklik olmamasına dikkat ederek boyayı yavaş ve sabit bir şekilde enjekte edin.
      NOT: Şırınga pistonuna basıldığında herhangi bir direnç olmamalıdır.
   4. Enjeksiyonu tamamladıktan sonra, iğneyi geri çekin ve damarı kapatmak için delinme bölgesine hafif bir baskı uygulayın.
   5. Pıhtılaşmanın gerçekleşmesine izin verin.

6. İn vivo fiber-optik-demet-bağlı klinik öncesi konfokal lazer taramalı endomikroskopi (pCLE)

1. Kuyruk damarı enjeksiyonunun hemen ardından (yukarıdaki adım 5.5.3), 300 μm eğimli fiber optik demeti (her demette 5000–7000 3 μm fiber içerir) robotik stereotaksik sürücünün mobil koluna aşağı yönde sıkıştırın.
2. Kemik mumunu kraniyotomiden çıkarın.
3. Bir şırınga iğnesinin bükülmüş ucunu kullanarak durayı çıkarın.
4. Robotik konumlandırma sistemini kullanarak, önce fiber objektifi, ucu korteks yüzeyindeki z ekseninde sıfırlanacak şekilde uygun ön-arka ve sol-sağ stereotaksik konuma taşıyın.
5. EEG kaydını başlatın (Şekil 5D).
6. Fiber objektifin arka düzleminin konfokal lazer taramasını başlatın, ardından beyindeki hedef derinliğe ulaşana kadar robotik mikro sürücünün z-kontrollerini kullanarak objektifi z ekseninde yavaşça alçaltın (Şekil 4C). Alçalırken görüntüleme sonuçlarını mikroskobik yazılımda görüntüleyin.
   1. Fiber ucu hedef X-Y-Z kayıt bölgesi içindeyse ve iki veya daha fazla damar görüntüleme penceresinin FOV'una giriyorsa, inişi durdurun ve video kayıtlarını başlatın. Cellvizio Lab'ın görüntüleme yazılımını kullanarak 11,7 Hz'de kan akışının canlı tam alan hızlandırılmış videolarını elde edin. (Daha küçük bir FOV ile daha yüksek hızlar elde edilebilir). Kayıtlar bir seferde 4-5 saat, gerekirse ardışık günlerde yapılabilir.
7. İğnenin ucuna sabitlenmiş eğimli silikon borulu 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, su ile öğütülmüş fare peletleri ile yapılan macunu periyodik olarak sağlayarak kayıtlar sırasında hayvanı besleyin.
8. Görüntüleme oturumunun sonunda kayıtları sonlandırın.
9. EEG derivasyonlarını nazikçe çıkarın ve Tergazyme ile temizleyin.
10. Fiberi z giriş ekseni boyunca ters çevirerek fiber optik demeti hayvanın beyninden yavaşça çıkarın.
11. Hayvanı baş direğinden ve vücut kısıtlamalarından serbest bırakın.
12. Uygunsa, kan damarlarını görselleştirmek ve immünohistokimya yapmak için gerekli ötenazi ve doku işleme protokollerini izleyin.
13. Gelecekteki bir oturumda aynı hayvandan kayıt yapmayı planlıyorsanız, görüntüleme penceresini kemik mumu veya silastik ile kapatın.

Sonuçlar

Bu yöntemleri, hipokampusta anormal perisit kaynaklı kılcal vazospazmların (nöbetlerin bir sonucu olarak ortaya çıkan) iktal odakta hücre ölümüne katkıda bulunan açık hipoksiye neden olup olmayacağını değerlendirmek için geliştirdik ^9,13.

Kafa başlığının geliştirilmesi ve uygun şekilde takılması, kayıtlarda yüksek stabilite sağladı ve hem iktal hem de interiktal dönemlerde vahşi tip ve epileptik uyan?...

Tartışmalar

Uyanık farelerde eşzamanlı elektrofizyolojik ve fiber optik pCLE deneyleri için bir baş başlığı kısıtlama sistemi geliştirdik ve anestezik ilaçlara bağlı potansiyel yanıt kontaminasyonunu azalttık. Başlık ve montaj aparatının yapımı kolaydır ve kronik uyanık davranan görüntüleme deneyleri için yeniden kullanılabilir. Kayıtların kalitesini, in vivo mikroskobik kan akışı görüntüleme için altın standart olan TPLSM'ye göre kontrol ettik.

Burada tanımladı?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121